Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry משאב משותף, RRID:SCR_021321, תודה רבה לעמיתינו ב- Cytek על דיונים מתמשכים של ניתוח ציטומטרי ספקטרלי מלא בתוכנות Aurora ו- SpectroFlo. דמויות נוצרו עם BioRender.com.

עכברים הוחזקו בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ בהתאם לפרוטוקולים של IACUC. כל העכברים הומתו על פי תקני AAALAC.
1. הכנת תאים חיסוניים מטחול העכבר
הערה: הרדימו עכברים תמימים באמצעות המתת חסד CO2 . עכברי C57BL/6 שנרכשו ממעבדות ג'קסון וגודלו בבית משמש?...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+An+overview.">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase,+Itk.">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2++channels.">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).</li><li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר בדיקה ממוטבת שנועדה למדוד תגובות סידן בתאי T ראשוניים של מורין העמוסים בצבע אינדיקטור ביחס הודו-1 באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא 7,8. היתרון בביצוע בדיקות שטף סידן באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא הוא היכולת להכפיף צביעת סמן תאי...

זרם סידן המושרה על ידי קולטן תאי T (TCR) הוא מדד שימושי להפעלת תאי T ומשמש לעתים קרובות כדי לקבוע אם לאוכלוסייה של תאי T יש תגובות לקויות בשלבים הפרוקסימליים של מסלול איתות TCR1. מדידות של זרימת סידן מבוצעות בדרך כלל על ידי תיוג מראש של תאי T עם אחד או זוג צבעי מחוון סידן פלואורסצנטיים, ולאחר מכן בחינת האותות הפלואורסצנטיים באמצעות ציטומטריית זרימה בזמן אמת לאחר TCR cross-linking 2,3,4. Indo-1, צבע סידן מטרי, מעורר על ידי לייזר UV עם פליטת שיא בשני אורכי גל שונים התלויים בקשירת סידן5, והוא צבע אינדיקטור נפוץ לניתוח ציטומטריית זרימה של תגובות סידן בלימפוציטים חיים. מכיוון שפרופיל הפליטה של Indo-1 הוא רחב למדי, זה יכול להיות מאתגר לשלב הערכת Indo-1 עם ניתוח סימולטני של סמני פני תא מרובים על ידי ציטומטריית זרימה של מעבר פס. מגבלה זו מגבילה את השימוש בניתוח ציטומטריית זרימה של תגובות סידן לאוכלוסיות מטוהרות מראש של תאי T או לאוכלוסיות המזוהות על ידי קבוצה מוגבלת של מולקולות פני התא.
כדי להתמודד עם המגבלות של מדידת תגובות סידן על אוכלוסיות הטרוגניות של לימפוציטים ראשוניים באמצעות ציטומטריית זרימה של מעבר פסים, פותח פרוטוקול למדידת פלואורסצנטיות Indo-1 באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. שיטה זו מאפשרת ריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא, תוך ניצול היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. היתרון בשימוש בציטומטריית זרימה בספקטרום מלא על פני ציטומטריית זרימה קונבנציונלית הוא היכולת להבחין בין אותות פלואורסצנטיים לצבעים חופפים מאוד, ובכך להגדיל את מספר סמני פני השטח שניתן להעריך בו זמנית בכל דגימה. ציטומטריית זרימה קונבנציונלית משתמשת במסנני פסים ומוגבלת לפלואורוכרום אחד לכל מערכת גלאים6. ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא אוספת אותות על פני כל הספקטרום של הפלואורוכרום באמצעות 64 גלאים במערכת ציטומטריית זרימה ספקטרליתשל חמישה לייזרים 7,8. בנוסף, ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא מנצלת את גלאי APD (Avalanche Photo Diode) בעלי רגישות מוגברת ביחס לגלאי צינור מכפיל אורהקיימים בציטומדי זרימה קונבנציונליים 8. כתוצאה מכך, גישה זו אידיאלית עבור אוכלוסיות תאים הטרוגניות, כגון תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם או תרחיפים של תאי איברי לימפה משניים מורין, מכיוון שהיא מבטלת את הצורך בבידוד של אוכלוסיות תאי T ספציפיות לפני סימון צבע הסידן. במקום זאת, ניתן להשתמש בפרופילי ביטוי של סמני פני השטח של התא ובציטומטריית זרימה לאחר איסוף נתונים כדי להעריך את תגובות הסידן בכל אוכלוסייה מעוניינת בהן. כפי שניתן לראות בדו"ח זה, ניתן לשלב את Indo-1 בקלות עם שמונה נוגדנים מצומדים פלואורוכרום, וכתוצאה מכך בסך הכל 10 חתימות ספקטרליות ייחודיות. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות על תערובות של תאים מקווי עכבר מובחנים באופן קונגני, מה שמאפשר ניתוח סימולטני של תגובות סידן בתאי T מסוג בר בהשוואה לאלה מקו עכברים ממוקד גנים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

זרימת סידן בתגובה לגירוי קולטן תאי T היא מדד נפוץ של איתות תאי T. מספר צבעי מחוון סידן פותחו כדי להעריך איתות סידן על ידי ציטומטריית זרימה של מעבר פסים. פרוטוקול זה נועד למדוד תגובות סידן בתאי T מורינים ראשוניים באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. סך כל הטחול מסומן בצבע אינדיקטור הסידן היחסי Indo-1, יחד עם פאנל של נוגדנים מצומדים פלואורוכרום למולקולות פני התא. מינוף היכולות של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא מספק פלטפורמה לשימוש במגוון רחב של כתמים על פני התא בשילוב עם Indo-1. לאחר מכן תאים מנותחים בזמן אמת ב 37 ° C לפני ואחרי תוספת של נוגדן אנטי CD3 כדי לעורר את קולטן תא T. לאחר פירוק האותות הספקטרליים, מחושב היחס בין Indo-1 הקשור לסידן ללא סידן וניתן לדמיין אותו לאורך זמן עבור כל אוכלוסייה מגודרת של טחול. טכניקה זו יכולה לאפשר ניתוח סימולטני של תגובות סידן באוכלוסיות תאים מרובות.

תהליך העבודה הניסיוני להערכת תגובות סידן בתאי T מורינים ראשוניים באמצעות צבע יחסי הודו-1 עם כתמים על פני השטח המרובבים מוצג באיור 1. לאחר קצירת ועיבוד הטחול של העכבר לתרחיף תא יחיד, התאים מוכתמים באסתר Indo-1 AM ומשטח מוכתמים בנוגדנים המקושרים לפלואורוכרום. לאחר השלמת טעינת הצב...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

זרם סידן, מדד לאיתות תאי T, הוא דרך יעילה לנתח תגובות לגירוי קולטן תאי T. פרוטוקול זה לריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא מנצל את היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא.

ניתוח של זרימת סידן המושרה על ידי קולטן תאי T בתאי T מורין ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

הפרוטוקול מאפשר לחוקרים למדוד בו זמנית את תגובת הסידן בתאי T ראשוניים יחד עם הערכת תת-הקבוצה שלהם ופנוטיפ פני השטח שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מונעת את הצורך לבודד תת-קבוצות ספציפיות של תאים לפני בחינת תגובות הסידן שלהם. כדי להתחיל, להכין מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר תמיסת מלאי של Indo-1 AM על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של DMSO לתוך בקבוקון המכיל 50 מיקרוגרם של Indo-1 AM. לדלל את תמיסת המלאי לנפח מתאים של cRPMI וריכוז של שישה מיקרוגרם למיליליטר.מניחים את המדיום באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש בתווך זה כדי לדלל תרחיף תאים שהוכן בעבר ביחס של אחד לאחד כדי לקבל חמישה עד 6 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, לצלחת תרבית רקמה של 12 בארות, הוסף מיליליטר אחד של תרחיף תאים לכל באר לכל תנאי ניסוי.הכינו דגימת בקרה אחת מוכתמת עבור Indo-1 נטול סידן על ידי הוספת EGTA לתאים עמוסי צבע Indo-1. הכינו באר להדברה ביולוגית שלילית ללא פלואורופורים או צבע הודו-1. הכינו בקרה חיובית של Indo-1 על ידי הוספת יונומיצין בריכוז של 50 מיקרומול לתרחיף התא העמוס בצבע בציטומטר הזרימה.כמו כן, הכינו באר לבקרות כתמים בודדים עבור אוכלוסיות תאים נוספות באמצעות פלואורופורים מצומדים של נוגדנים. לאחר מכן הוסיפו שני מיקרוגרם של נוגדן חוסם קולטן FC למיליון תאים ודגרו על הצלחת במשך 45 דקות עם הקשה כל 15 דקות כדי להשעות מחדש את התאים. לאחר הדגירה, מערבבים ומסירים את כל נפח התאים מהצלחת ומוסיפים אותו לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מיליליטר.צנטריפוגה ודקנט הסופרנטנט. לאחר שהתאים נשטפים במיליליטר אחד של cRPMI שחומם מראש, גלולה שוב ומרוקנת את הסופרנטנט. להשהות מחדש את התאים במיליליטר אחד של cRPMI ולדגור על כל צינור, משאיר את החלק העליון של הצינור פתוח מעט לחילופי גזים, המאפשר דה-אסטריפיקציה מלאה של אסטרי AM תוך תאיים.לאחר מכן, הכינו תערובת אב של כל הנוגדנים המצומדים פלואורוכרום המוגדרים על-ידי המשתמש והוסיפו אותו לתאי המנוחה עבור מיליליטר אחד מנפח התא. לאחר מנוחה, גלולה את התאים ולשטוף את הגלולה על ידי resuspending במיליליטר אחד של cRPMI מקורר לארבע מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה והנח את הצינורות על קרח.יש להשהות דגימות בודדות ב-500 מיקרוליטר של cRPMI נטול פנול אדום באמצעות צינור זרימה פוליסטירן של חמישה מיליליטר עם מכסה. כדי לשמור על הטמפרטורה באמצעות ניתוח שטף סידן, הכינו אמבט חרוזים על ידי הוספת חרוזי אמבטיה לאמבט מים קטן וחממו אותו עד 37 מעלות צלזיוס. חותכים בזהירות צינור כרוניקה של 50 מיליליטר לשניים ומשליכים את החלק העליון של הצינור.ממלאים שלושה רבעים מהצינור הנותר בחרוזי אמבטיה ומאפשרים לו להגיע ל -37 מעלות צלזיוס באמבט החרוזים. הניחו את אמבט החרוזים ליד ציטומטר זרימה, יחד עם מתלה קלקר כדי למקם את הצינור. לפני הניתוח על ציטומטר זרימה, לחמם את הצינורות בנפרד ל 37 מעלות צלזיוס במשך שבע דקות.היכנס לתוכנת ציטומטר הזרימה ולחץ על הכרטיסייה ספריה. לאחר מכן בחר תגי פלורסנט כדי להוסיף Indo-1 הקשור לסידן ו- Indo-1 ללא סידן. לאחר מכן בחר לייזר UV תחת קבוצות תגים פלואורסצנטיים ולחץ על הוסף כדי להוסיף שם תג פלואורסצנטי.בחר את עירור הלייזר ואת אורך גל הפליטה ולאחר מכן לחץ על שמור. המשך למערך הניסוי. לחץ על הכרטיסייה רכישה, פתח/צור ניסוי חדש והוסף את תגי הפלואורסצנט הרצויים לניסוי.צור קבוצת התייחסות וקבוצת מדגם חדשה עבור הניסוי ותייג את שתי הקבוצות. תחת הכרטיסייה רכישות, הגדר את האירועים להקליט למקסימום ב -10 מיליון, עצירת נפח לנפח המרבי של 3000 מיקרוליטר, וזמן עצירה למקסימום של 36, 000 שניות. רכוש פקדים מוכתמים בודדים עבור נוגדנים מצומדים המוגדרים על-ידי המשתמש הכלולים בלוח הרב-צבעוני ועבור צבע פונקציונלי מסוג Indo-1.הוסף 50 מיקרומול של יונומיצין לבקרה ולמערבולת Indo-1 החיובית הקשורה לסידן. הוסף את צינור הזרימה ללוח ההזרקה לדוגמה ולחץ על הקלט. לאחר מכן הוסף בקרת Indo-1 שלילית ללא סידן לציטומטר הזרימה ולחץ על הקלט.בטל את הערבוב של הפקדים המוכתמים הבודדים על-ידי לחיצה על כפתור בטל מיקס. לאחר השלמת ביטול הערבוב, צור תרשימים רציפים באמצעות גליון העבודה הלא מעורב, כגון SSC-A לעומת FSC-A, להסרת פסולת מהדגימה ו- SSC-A לעומת SSC-H להסרת כפילויות. לאחר מכן צור שערים על ידי לחיצה על Plot.הוסף תרשים לגליון העבודה ולחץ פעמיים בתוך השער כדי ליצור אוכלוסייה מגודרת במורד הזרם. המשיכו עד לטיפול בכל האוכלוסיות המעניינות. לאחר מכן, חממו את דגימות הבקרה המוכתמות הבודדות שהוכנו בעבר ל -37 מעלות צלזיוס לניתוח רציף.הגדר את תוכנת ציטומטריית הזרימה והפעל DI במי קרח למשך שתיים עד שלוש דקות כדי להבטיח את היציבות הנוזלית של ציטומטר הזרימה. הגדר תרשימים רציפים בגליון העבודה הלא מעורב על-ידי יצירת שערים באמצעות לחצני מלבן מצולע או שער אליפסה כדי לכלול את האוכלוסייה המעניינת. לחץ פעמיים בתוך השער ושנה את הפרמטרים y ו- x ציר ל- SSC-A לעומת SSC-H.השלם את הגדרת פרמטרי הציר על ידי לחיצה שמאלית על הציר. צור תרשים עם SSC-A לעומת אות צבע כדאיות. שער התאים החיים שהם שליליים לצביעת צבע אמין.תאים חיים שליליים לצביעה חיה מתים יתקבצו בסימן האפס הן על ציר y והן על ציר x. לחץ פעמיים על העלילה הפנימית כדי ליצור חלקה חדשה המכילה רק לימפוציטים חיים של תא אחד. שנה את ציר Y ל- Indo-1 לעומת זמן בציר x להדמיה של זרם הסידן.לאחר מכן הכניסו את הדגימה הביולוגית המחוממת ל-SIT של המכונה. הפעל את הדגימות בקצב של 2, 500 עד 3000 אירועים בשנייה בקצב זרימה בינוני כדי לדמיין זרימת סידן במספר מוגבל של אוכלוסיות תאים. הוסף את הצינור הבא לאמבט החרוזים בבקרת רכישה.לחץ על הקלט כדי להקליט את הנתונים הראשוניים במשך 30 שניות כדי לקבל רמה בסיסית של איתות סידן בדגימה. לאחר מכן לחץ על עצור והסר את הצינור מפתח הזרקת הדגימה. הוסף 30 מיקרוגרם של אנטי CD3 לא מצומד ישירות לתוך צינור הדגימה כדי להתחיל זרימת סידן.החזיר במהירות את הצינור ליציאת הזרקת הדגימה ולחץ על הקלט בתוכנה. הקלט נתונים במשך שבע דקות, תוך צפייה בזמן שחלף תחת בקרות הרכישה בתוכנה. לאחר מכן לחץ על עצור בתוכנה.הוסף מיקרוגרם אחד למיליליטר של יונומיצין ורשום במשך 30 שניות כדי לקבל את אות הסידן המרבי בתאים המעניינים. המשך לדוגמה הבאה וחזור על זרימת העבודה עד שכל הדגימות ייאספו. שמור את הניסוי ולחץ על קובץ ה- zip לייצוא.קבצים לא מעורבים מועלים לתוכנה חיצונית לניתוח ציטומטריה של זרימה. אות עקבי יציב בתרשים של זמן לעומת פיזור צדדי הצביע על יציבות נוזלית. אוכלוסיית הלימפוציטים הייתה מגודרת ואחריה אפליה של סינגלים על חלקה של גובה פיזור צדדי לעומת שטח.סינגלים הוערכו כדאיות. לאחר מכן הוחל על אוכלוסייה שלילית CD19. תת-קבוצות תאי T אלה הוערכו באמצעות נוגדנים ל-CD4 ו-CD8 על ידי הדמיה של פלואורסצנטיות Indo-1 הקשורה לסידן לעומת הזמן.באוכלוסיות תאים בודדות, תרשים האינדו-1 הקשור לסידן לעומת הזמן הראה קו בסיס לפני הגירוי. תגובת שיא כאשר רמות הסידן התוך-תאי ירדו ותגובת הסידן התעוררה על-ידי הוספת יונומיצין. לפני הוספת נוגדנים נגד CD3, זוהה אות Indo-1 חלש הקשור לסידן.במהלך תגובת השיא, התאים הראו אות Indo-1 חזק הקשור לסידן והפחתת Indo-1 נטול סידן. חמש דקות לאחר השיא, הפלואורסצנטיות של האינדו-1 כמעט חזרה לקו הבסיס. לאחר הוספת יונומיצין, הודגם אות חזק של Indo-1 הקשור לסידן, מה שמצביע על העמסת צבע מספקת של התאים.ניתוח האוכלוסיות הנדירות בוצע על ידי שרטוט Indo-1 הקשור לסידן לעומת Indo-1 נטול סידן לאחר שבחן כל אוכלוסייה מעוניינת בכך. וניתוח תגובת הסידן לאורך כל מהלך הזמן עבור כל תת-קבוצה. שטף סידן באמצעות פרופיל ספקטרום מלא יכול להוביל לניתוח ציטומטרי של זרימת פרמטרים גבוהה במגוון תת-קבוצות חיסוניות.ניתן להשתמש באנליזה ממדית גבוהה עבור אשכולות בלתי משוחדים של תת-קבוצות תאי T בשילוב עם ציטומטריה של זרימת פרמטרים גבוהה לניתוח מתקדם. טכניקה זו פותחה לניתוח של תת-קבוצות חיסוניות מרובות בשילוב זו עם זו בדגימה בתפזורת.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...