Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Molte grazie ai nostri colleghi di Cytek per le continue discussioni sull'analisi citometrica spettrale completa sul software Aurora e SpectroFlo. Le figure sono state create con BioRender.com.

I topi sono stati mantenuti presso il campus medico Anschutz dell'Università del Colorado in conformità con i protocolli IACUC. Tutti i topi sono stati sottoposti a eutanasia secondo gli standard AAALAC.
1. Preparazione delle cellule immunitarie dalla milza del topo
NOTA: eutanasia di topi naïve con eutanasia CO2 . I topi C57BL / 6 acquistati dai Jackson Laboratories e allevati internamente vengono utilizzati per esperimenti a 6-12 setti...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+An+overview.">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase,+Itk.">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2++channels.">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).</li><li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

Questo protocollo descrive un saggio ottimizzato progettato per misurare le risposte del calcio nelle cellule T murine primarie caricate con colorante indicatore raziometrico Indo-1 titolato utilizzando la citometria a flusso a spettro completo 7,8. Il vantaggio di eseguire saggi di flusso di calcio utilizzando la citometria a flusso a spettro completo è la capacità di multiplexare la colorazione dei marcatori cellulari superficiali in combinazione con la valut...

L'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T (TCR) è una misura utile dell'attivazione delle cellule T e viene spesso utilizzato per determinare se una popolazione di cellule T ha risposte compromesse nelle fasi prossimali della via di segnalazione TCR1. Le misurazioni dell'afflusso di calcio vengono generalmente eseguite pre-marcando le cellule T con uno o un paio di coloranti indicatori di calcio fluorescenti e quindi esaminando i segnali fluorescenti utilizzando la citometria a flusso in tempo reale dopo la reticolazione TCR 2,3,4. Indo-1, un colorante di calcio metrico proporzionale, è eccitato dal laser UV con emissioni di picco a due diverse lunghezze d'onda dipendenti dal legame del calcio5 ed è un colorante indicatore comunemente usato per l'analisi citometrica a flusso delle risposte del calcio nei linfociti vivi. Poiché il profilo di emissione di Indo-1 è piuttosto ampio, può essere difficile combinare la valutazione di Indo-1 con l'analisi simultanea di più marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso passa-banda. Questa limitazione limita l'utilizzo dell'analisi citometrica a flusso delle risposte del calcio a popolazioni pre-purificate di cellule T o a popolazioni identificate da un insieme limitato di molecole di superficie cellulare.
Per affrontare i limiti della misurazione delle risposte del calcio su popolazioni eterogenee di linfociti primari utilizzando la citometria a flusso passa-banda, è stato sviluppato un protocollo per misurare la fluorescenza Indo-1 utilizzando la citometria a flusso a spettro completo. Questo metodo consente di multiplexare Indo-1 con pannelli di anticorpi diretti alle molecole della superficie cellulare, sfruttando le capacità altamente flessibili della citometria a flusso a spettro completo. Il vantaggio di utilizzare la citometria a flusso a spettro completo rispetto alla citometria a flusso convenzionale è la sua capacità di distinguere i segnali fluorescenti da coloranti altamente sovrapposti, aumentando così il numero di marcatori di superficie che possono essere valutati simultaneamente in ciascun campione. La citometria a flusso convenzionale utilizza filtri passa-banda ed è limitata a un fluorocromo per sistema rivelatore6. La citometria a flusso a spettro completo raccoglie segnali attraverso l'intero spettro del fluorocromo utilizzando 64 rivelatori su un sistema di citometria a flusso spettrale a cinque laser 7,8. Inoltre, la citometria a flusso a spettro completo sfrutta i rivelatori APD (Avalanche Photo Diode) che hanno una maggiore sensibilità rispetto ai rivelatori a tubo fotomoltiplicatore presenti sui citometri a flusso convenzionali8. Di conseguenza, questo approccio è ideale per le popolazioni cellulari eterogenee, come le cellule mononucleate del sangue periferico o le sospensioni di cellule di organi linfoidi secondari murini, in quanto elimina la necessità di isolare specifiche popolazioni di cellule T prima della marcatura del colorante di calcio. Invece, i profili di espressione dei marcatori della superficie cellulare e il gating della citometria a flusso dopo la raccolta dei dati possono essere utilizzati per valutare le risposte al calcio in ciascuna popolazione di interesse. Come mostrato in questo rapporto, Indo-1 può essere facilmente combinato con otto anticorpi coniugati con fluorocromo, risultando in un totale di 10 firme spettrali uniche. Inoltre, questo metodo può essere facilmente applicato a miscele di cellule provenienti da linee di topo congenitamente distinte, consentendo l'analisi simultanea delle risposte del calcio nelle cellule T wild-type rispetto a quelle di una linea di topo mirata al gene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

L'afflusso di calcio in risposta alla stimolazione del recettore delle cellule T è una misura comune della segnalazione delle cellule T. Sono stati sviluppati diversi coloranti indicatori di calcio per valutare la segnalazione del calcio mediante citometria a flusso passa-banda. Questo protocollo è progettato per misurare le risposte del calcio nelle cellule T murine primarie utilizzando la citometria a flusso a spettro completo. Gli splenociti totali sono marcati con il colorante indicatore raziometrico del calcio Indo-1, insieme a un pannello di anticorpi coniugati con fluorocromo alle molecole della superficie cellulare. Sfruttando le capacità della citometria a flusso a spettro completo, si fornisce una piattaforma per l'utilizzo di una vasta gamma di colorazioni della superficie cellulare in combinazione con Indo-1. Le cellule vengono quindi analizzate in tempo reale a 37 °C prima e dopo l'aggiunta di un anticorpo anti-CD3 per stimolare il recettore delle cellule T. Dopo aver mescolato i segnali spettrali, viene calcolato il rapporto tra Indo-1 legato al calcio e Indo-1 privo di calcio e può essere visualizzato nel tempo per ogni popolazione gated di splenociti. Questa tecnica può consentire l'analisi simultanea delle risposte del calcio in più popolazioni cellulari.

Il flusso di lavoro sperimentale per valutare le risposte del calcio nelle cellule T murine primarie utilizzando un colorante raziometrico Indo-1 con colorazioni superficiali multiplexing è mostrato in Figura 1. Dopo aver raccolto e processato gli splenociti di topo in una sospensione a singola cellula, le cellule vengono colorate con un estere Indo-1 AM e colorate con anticorpi legati al fluorocromo. Una volta completato il carico del colorante e la colorazione degli anticorpi, i campioni ...

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Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

L'afflusso di calcio, una misura della segnalazione delle cellule T, è un modo efficace per analizzare le risposte alla stimolazione del recettore delle cellule T. Questo protocollo per il multiplexing di Indo-1 con pannelli di anticorpi diretti alle molecole della superficie cellulare sfrutta le capacità altamente flessibili della citometria a flusso a spettro completo.

Analisi dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T murine primarie mediante citometria a flusso a spettro completo

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Il protocollo consente ai ricercatori di misurare simultaneamente la risposta al calcio nelle cellule T primarie insieme alla valutazione del loro sottogruppo e fenotipo di superficie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che evita la necessità di isolare specifici sottoinsiemi di cellule prima di esaminare le loro risposte al calcio. Per iniziare, preparare una soluzione madre di un microgrammo per microlitro di Indo-1 AM aggiungendo 50 microlitri di DMSO in una fiala contenente 50 microgrammi di Indo-1 AM. Diluire la soluzione madre in un volume appropriato di cRPMI e una concentrazione di sei microgrammi per millilitro.Posizionare il mezzo a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Quindi utilizzare questo mezzo per diluire una sospensione cellulare precedentemente preparata con un rapporto uno-a-uno per ottenere da cinque a 6 milioni di cellule per millilitro. Successivamente, a una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti, aggiungere un millilitro di sospensione cellulare per pozzetto per condizione sperimentale.Preparare un singolo campione di controllo colorato per Indo-1 privo di calcio aggiungendo EGTA alle celle caricate con colorante Indo-1. Preparare un pozzo per il controllo biologico negativo senza fluorofori o colorante Indo-1. Preparare un controllo positivo Indo-1 aggiungendo ionomicina ad una concentrazione di 50 micromoli alla sospensione cellulare caricata di colorante al citometro a flusso.Inoltre, preparare un pozzo per i controlli a singola colorazione per ulteriori popolazioni cellulari utilizzando fluorofori coniugati con anticorpi. Quindi aggiungere due microgrammi di anticorpo bloccante del recettore FC per milione di cellule e incubare la piastra per 45 minuti con picchiettamento ogni 15 minuti per risospendere le cellule. Dopo l'incubazione, mescolare e rimuovere l'intero volume di cellule dalla piastra e aggiungerlo a tubi di microcentrifuga da 1,7 millilitri.Centrifugare e decantare il surnatante. Una volta lavate le celle con un millilitro di cRPMI preriscaldato, pellettare nuovamente e decantare il surnatante. Risospendere le cellule in un millilitro di cRPMI e incubare ogni tubo, lasciando la parte superiore del tubo leggermente aperta per lo scambio di gas, consentendo la completa deesterificazione degli esteri AM intracellulari.Quindi, preparare un master mix di tutti gli anticorpi coniugati al fluorocromo definiti dall'utente e aggiungerlo alle cellule a riposo per un millilitro del volume cellulare. Dopo il riposo, pellet le celle e lavare il pellet riassumendo in un millilitro di cRPMI raffreddato a quattro gradi Celsius. Ripetere questo passaggio e posizionare i tubi sul ghiaccio.Risospendere i singoli campioni in 500 microlitri di cRPMI privo di rosso fenolo utilizzando un tubo di flusso in polistirene da cinque millilitri con un tappo. Per mantenere la temperatura utilizzando l'analisi del flusso di calcio, preparare un bagno di perline aggiungendo perline da bagno a un piccolo bagno d'acqua e riscaldarlo fino a 37 gradi Celsius. Tagliare con cura un tubo cronaca da 50 millilitri a metà e scartare la parte superiore del tubo.Riempire tre quarti del tubo rimanente con perline da bagno e lasciarlo raggiungere i 37 gradi Celsius nel bagno di perline. Posizionare il bagno di perline vicino a un citometro a flusso, insieme a un rack di polistirolo per posizionare il tubo. Prima dell'analisi sul citometro a flusso, riscaldare i tubi individualmente a 37 gradi Celsius per sette minuti.Accedere al software del citometro a flusso e fare clic sulla scheda Libreria. Quindi selezionare i tag fluorescenti per aggiungere Indo-1 legato al calcio e Indo-1 privo di calcio. Quindi selezionare il laser UV sotto i gruppi di tag fluorescenti e fare clic su Aggiungi per aggiungere un nome di tag fluorescente.Scegliere la lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione laser, quindi fare clic su Salva. Continuare con la configurazione sperimentale. Fare clic sulla scheda Acquisizione, Apri/Crea un nuovo esperimento e aggiungere i tag fluorescenti desiderati all'esperimento.Creare un gruppo di riferimento e un nuovo gruppo di esempio per l'esperimento ed etichettare entrambi i gruppi. Nella scheda Acquisizioni, impostare gli eventi in modo che vengano registrati al massimo a 10 milioni, arrestando il volume al volume massimo di 3000 microlitri e il tempo di arresto al massimo su 36.000 secondi. Acquisire controlli a colorazione singola per anticorpi coniugati definiti dall'utente inclusi nel pannello multicolore e per colorante funzionale Indo-1.Aggiungere 50 micromoli di ionomicina al controllo positivo e al vortice Indo-1 legato al calcio. Aggiungere il tubo di flusso alla scheda di iniezione del campione e fare clic su Registra. Quindi aggiungere il controllo negativo Indo-1 privo di calcio al citometro a flusso e fare clic su Registra.Svuotare i controlli a macchia singola facendo clic sul pulsante Unmix. Una volta completata la miscelazione, creare grafici sequenziali utilizzando il foglio di lavoro non miscelato, ad esempio SSC-A rispetto a FSC-A, per rimuovere i detriti dal campione e SSC-A rispetto a SSC-H per rimuovere doppietti. Quindi crea porte facendo clic su Plot.Aggiungi un grafico al foglio di lavoro e fai doppio clic all'interno del cancello per creare una popolazione gated a valle. Continuare fino a quando tutte le popolazioni di interesse sono contabilizzate. Quindi, riscaldare i campioni di controllo a 37 gradi Celsius per l'analisi sequenziale.Impostare il software di citometria a flusso ed eseguire DI in acqua ghiacciata per due o tre minuti per garantire la stabilità fluidica del citometro a flusso. Impostare grafici sequenziali nel foglio di lavoro non misto creando porte utilizzando i pulsanti del rettangolo poligonale o del cancello dell'ellisse per includere la popolazione di interesse. Fate doppio clic all'interno del gate e modificate i parametri degli assi y e x impostandoli su SSC-A anziché SSC-H.Completate la definizione dei parametri dell'asse facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sull'asse. Creare un grafico con SSC-A rispetto al segnale di colorante di vitalità. Cancellare le cellule vive che sono negative per la colorazione del colorante amminico.Le celle vive negative per la colorazione dei morti vivi si raggrupperanno al segno zero sia sull'asse y che sull'asse x. Fare doppio clic sul grafico interno per creare un nuovo grafico contenente solo linfociti vivi a singola cellula. Modificare l'asse Y in Indo-1 rispetto al tempo sull'asse x per visualizzare l'afflusso di calcio.Quindi posizionare il campione biologico riscaldato nel SIT della macchina. Esegui i campioni a 2.500-3000 eventi al secondo su una portata media per visualizzare l'afflusso di calcio in un numero limitato di popolazioni cellulari. Aggiungere il tubo successivo al bagno di perline nel controllo dell'acquisizione.Premere Record per registrare i dati iniziali per 30 secondi per ottenere un livello basale di segnalazione del calcio nel campione. Quindi fare clic su Stop e rimuovere il tubo dalla porta di iniezione del campione. Aggiungere 30 microgrammi di anti-CD3 non coniugato direttamente nella provetta per avviare l'afflusso di calcio.Riposizionare rapidamente il tubo sulla porta di iniezione del campione e premere Record nel software. Registra i dati per sette minuti, osservando il tempo trascorso sotto i controlli di acquisizione nel software. Quindi premere Stop nel software.Aggiungere un microgrammo per millilitro di ionomicina e registrare per 30 secondi per ottenere il massimo segnale di calcio nelle cellule di interesse. Passare all'esempio successivo e ripetere il flusso di lavoro fino a quando non sono stati raccolti tutti i campioni. Salva l'esperimento e fai clic sul file zip di esportazione.I file non misti vengono caricati su un software di analisi citometrica a flusso esterno. Un segnale stabile e coerente in un grafico di tempo rispetto alla dispersione laterale indicava stabilità fluidica. La popolazione di linfociti è stata controllata seguita dalla discriminazione dei singoletti su un appezzamento di altezza di dispersione laterale rispetto all'area.I singoletti sono stati valutati per la vitalità. Quindi è stato applicato il gating sulla popolazione CD19-negativa. Questi sottogruppi di cellule T sono stati valutati utilizzando anticorpi contro CD4 e CD8 visualizzando la fluorescenza Indo-1 legata al calcio rispetto al tempo.Nelle singole popolazioni cellulari, il grafico di Indo-1 legato al calcio rispetto al tempo ha mostrato una linea di base prima della stimolazione. Una risposta di picco quando i livelli di calcio intracellulare sono diminuiti e la risposta al calcio ha suscitato l'aggiunta di ionomicina. Prima dell'aggiunta di anticorpi anti-CD3, è stato rilevato un debole segnale Indo-1 legato al calcio.Durante la risposta di picco, le cellule hanno mostrato un forte segnale Indo-1 legato al calcio e un ridotto Indo-1 privo di calcio. A cinque minuti dal picco, la fluorescenza Indo-1 è quasi tornata al basale. Dopo l'aggiunta di ionomicina, è stato visualizzato un robusto segnale di Indo-1 legato al calcio, che indica un adeguato carico di colorante delle cellule.L'analisi delle popolazioni rare è stata eseguita tracciando l'Indo-1 legato al calcio rispetto all'Indo-1 privo di calcio dopo aver individuato ciascuna popolazione di interesse. E analizzando la risposta del calcio durante l'intero corso temporale per ciascun sottoinsieme. Il flusso di calcio utilizzando la profilazione a spettro completo può portare ad un'analisi citometrica a flusso ad alto parametro in una varietà di sottogruppi immunitari.L'analisi ad alta dimensionalità per il clustering imparziale di sottoinsiemi di cellule T può essere utilizzata in combinazione con citometria a flusso ad alto parametro per analisi avanzate. Questa tecnica è sviluppata per l'analisi di più sottogruppi immunitari in combinazione tra loro in un campione di massa.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

L&#39;uso di citometria a flusso per valutare lo stato della cromatina in cellule T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Misura della T cellulare alloreattività Utilizzando Imaging Citometria a Flusso

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule T nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...