Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
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R01AI132419, CU |AMC ImmunoMicro Flow Cytometry共有リソース、RRID:SCR_021321、AuroraおよびSpectroFloソフトウェアでのフルスペクトルサイトメトリー分析の継続的な議論を提供してくれたCytekの同僚に感謝します。図は BioRender.com で作成されました。

マウスは、IACUCプロトコルに従ってコロラド大学アンシュッツ医科キャンパスで維持された。全てのマウスをAAALAC基準に従って安楽死させた。
1. マウス脾臓からの免疫細胞の調製
注:ナイーブマウスをCO2 安楽死で安楽死させる。ジャクソン研究所から購入し、社内で飼育したC57BL/6マウスを6〜12週齢で実験に使用します。実験には?...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+An+overview.">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase,+Itk.">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2++channels.">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).</li><li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

このプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリー7,8を使用して滴定されたIndo-1レシオメトリックインジケーター色素をロードした初代マウスT細胞におけるカルシウム応答を測定するために設計された最適化されたアッセイについて説明しています。フルスペクトルフローサイトメトリーを使用してカルシウムフラックスアッセイを実施す?...

T細胞受容体(TCR)誘導性カルシウム流入は、T細胞活性化の有用な尺度であり、T細胞の集団がTCRシグナル伝達経路1の近位ステップで応答を障害しているかどうかを判断するために頻繁に使用されます。カルシウム流入の測定は、一般に、T細胞を1つまたは1対の蛍光カルシウム指示色素で予め標識し、次いでTCR架橋後にフローサイトメトリーを用いて蛍光シグナルをリアルタイムで調べることによって行われる2,3,4。レシオメトリックカルシウム色素であるインド-1は、カルシウム結合に依存する2つの異なる波長でピーク発光するUVレーザーによって励起され5、生リンパ球におけるカルシウム応答のフローサイトメトリー分析に一般的に使用される指標色素です。Indo-1の発光プロファイルは非常に広いため、Indo-1評価とバンドパスフローサイトメトリーによる複数の細胞表面マーカーの同時分析を組み合わせることは困難な場合があります。この制限により、カルシウム応答のフローサイトメトリー分析の利用は、T細胞の事前に精製された集団または限られた細胞表面分子のセットによって同定された集団に制限されます。
バンドパスフローサイトメトリーを使用して初代リンパ球の不均一な集団に対するカルシウム応答を測定することの限界に対処するために、フルスペクトルフローサイトメトリーを使用してIndo-1蛍光を測定するためのプロトコルが開発されました。この方法では、フルスペクトルフローサイトメトリーの柔軟性の高い機能を利用して、細胞表面分子に向けられた抗体のパネルでIndo-1をマルチプレックス化することができます。従来のフローサイトメトリーよりもフルスペクトルフローサイトメトリーを使用する利点は、蛍光シグナルを高度に重なり合う色素から区別できるため、各サンプルで同時に評価できる表面マーカーの数が増えることです。従来のフローサイトメトリーはバンドパスフィルターを使用し、検出器システム6あたり1つの蛍光色素に制限されています。フルスペクトルフローサイトメトリーは、5レーザースペクトルフローサイトメトリーシステム上の64個の検出器を使用して、蛍光色素の全スペクトルにわたってシグナルを収集します7,8。さらに、フルスペクトルフローサイトメトリーは、従来のフローサイトメーター8に存在する光電子増倍管検出器と比較して感度が向上したAPD(アバランシェフォトダイオード)検出器を利用します。したがって、このアプローチは、カルシウム色素標識の前に特定のT細胞集団を単離する必要がないため、末梢血単核細胞やマウス二次リンパ器官細胞懸濁液などの不均一な細胞集団に最適です。代わりに、データ収集後の細胞表面マーカー発現プロファイルとフローサイトメトリーゲーティングを使用して、関心のある各集団におけるカルシウム応答を評価できます。このレポートで示されているように、Indo-1は8つの蛍光色素結合抗体と容易に組み合わせることができ、合計10のユニークなスペクトルシグネチャが得られます。さらに、この方法は、先天的に異なるマウス系統の細胞の混合物に容易に適用することができ、遺伝子標的マウス株からのものと比較して、野生型T細胞におけるカルシウム応答の同時解析を可能にする。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

T細胞受容体刺激に応答するカルシウム流入は、T細胞シグナル伝達の一般的な尺度である。バンドパスフローサイトメトリーによるカルシウムシグナル伝達を評価するために、いくつかのカルシウム指示色素が開発されています。このプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリーを使用して初代マウスT細胞のカルシウム応答を測定するように設計されています。全脾細胞は、細胞表面分子に対する蛍光色素結合抗体のパネルとともに、レシオメトリックカルシウム指示色素Indo-1で標識されています。フルスペクトルフローサイトメトリーの機能を活用することで、Indo-1と組み合わせて幅広い細胞表面染色剤を利用するためのプラットフォームが提供されます。次いで、T細胞受容体を刺激する抗CD3抗体の添加前後の37°Cで細胞をリアルタイムで分析する。スペクトルシグナルを混合解除した後、カルシウム結合とカルシウムフリーのインド-1の比率が計算され、脾細胞のゲート集団ごとに経時的に視覚化できます。この技術は、複数の細胞集団におけるカルシウム応答の同時解析を可能にすることができる。

マルチプレックス表面染色を有するIndo-1レシオメトリック色素を用いて初代マウスT細胞におけるカルシウム応答を評価する実験ワークフローを 図1に示す。マウス脾細胞を回収し、単一細胞懸濁液に加工した後、細胞をIndo-1 AMエステルで染色し、蛍光色素結合抗体で表面染色します。色素の装填と抗体染色が完了したら、リンパ球サンプルを生物学的温度(37°C)まで温め...

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Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

T細胞シグナル伝達の尺度であるカルシウム流入は、T細胞受容体刺激に対する応答を分析するための効果的な方法です。Indo-1を細胞表面分子に向けられた抗体のパネルでマルチプレックス化するためのこのプロトコルは、フルスペクトルフローサイトメトリーの非常に柔軟な機能を利用しています。

フルスペクトルフローサイトメトリーによる初代マウスT細胞におけるT細胞受容体誘導性カルシウム流入の解析

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

このプロトコルにより、研究者は初代T細胞のカルシウム応答を同時に測定し、それらのサブセットと表面表現型を評価することができます。この技術の主な利点は、カルシウム応答を調べる前に細胞の特定のサブセットを単離する必要がないことです。はじめに、50マイクログラムのインド1 AMを含むバイアルに50マイクロリットルのDMSOを加えることにより、インド-1 AMの1マイクロリットルあたり1マイクログラムのストック溶液を調製します。ストック溶液を適切な量のcRPMIとミリリットルあたり6マイクログラムの濃度に希釈します。培地を摂氏37度の水浴に入れる。次に、この培地を使用して、事前に調製した細胞懸濁液を1対1の比率で希釈し、1ミリリットルあたり5〜600万個の細胞を取得します。次に、12穴組織培養プレートに、実験条件ごとに1ウェルあたり1ミリリットルの細胞懸濁液を添加する。Indo-1色素を負荷した細胞にEGTAを添加することにより、カルシウムフリーのIndo-1の単一染色対照サンプルを調製します。蛍光色素やIndo-1色素を含まない生物学的陰性対照用のウェルを準備します。フローサイトメーターで色素を装填した細胞懸濁液に50マイクロモルの濃度でイオノマイシンを添加することにより、Indo-1ポジティブコントロールを調製します。また、抗体結合蛍光色素を使用して、追加の細胞集団のための単一染色コントロール用のウェルを調製します。次に、100万細胞あたり2マイクログラムのFC受容体遮断抗体を追加し、15分ごとにタップしてプレートを45分間インキュベートし、細胞を再懸濁します。インキュベーション後、プレートから全容量の細胞を混合して取り出し、それを1.7ミリリットルの微量遠心チューブに加える。遠心分離機で上清をデカントする。細胞を1ミリリットルの予め温めたcRPMIで洗浄したら、再度ペレット化し、上清をデカントする。細胞を1ミリリットルのcRPMIに再懸濁し、各チューブをインキュベートし、チューブの上部をガス交換のためにわずかに開いたままにして、細胞内AMエステルの完全な脱エステル化を可能にします。次に、すべてのユーザー定義蛍光色素結合抗体のマスターミックスを調製し、それを1ミリリットルの細胞容量の休止細胞に加えます。安静後、細胞をペレット化し、摂氏4度に冷却した1ミリリットルのcRPMIに再懸濁してペレットを洗浄する。この手順を繰り返し、チューブを氷の上に置きます。キャップ付きの5ミリリットルのポリスチレンフローチューブを使用して、個々のサンプルを500マイクロリットルのフェノールレッドフリーcRPMIに再懸濁します。カルシウムフラックス分析を使用して温度を維持するには、小さな水浴にバスビーズを加えてビーズバスを準備し、摂氏37度まで温めます。50ミリリットルのクロニクルチューブを慎重に半分に切り、チューブの上部を廃棄します。残りのチューブの4分の3をバスビーズで満たし、ビーズバスで摂氏37度に達するようにします。ビーズバスをフローサイトメーターの近くに置き、発泡スチロールラックと一緒にチューブを配置します。フローサイトメーターで分析する前に、チューブを個別に摂氏37度に7分間温めます。フローサイトメーターソフトウェアにログインし、「ライブラリ」タブをクリックします。次に、蛍光タグを選択して、カルシウム結合型Indo-1とカルシウムフリーIndo-1を追加します。次に、蛍光タググループでUVレーザーを選択し、[追加]をクリックして蛍光タグ名を追加します。レーザー励起波長と発光波長を選択し、[保存]をクリックします。実験的なセットアップに進みます。[取得]タブをクリックし、新しい実験を開く/作成して、目的の蛍光タグを実験に追加します。実験の参照グループと新しいサンプル グループを作成し、両方のグループにラベルを付けます。[取得] タブで、記録するイベントを最大 1,000 万に設定し、容量を最大容量 3000 マイクロリットルに、停止時間を最大 36, 000 秒に設定します。マルチカラーパネルに含まれるユーザー定義の標識抗体およびIndo-1機能性色素の単一染色コントロールを取得します。カルシウム結合したIndo-1ポジティブコントロールとボルテックスに50マイクロモルのイオノマイシンを追加します。フローチューブをサンプル注入ボードに追加し、[記録]をクリックします。次に、カルシウムフリーのIndo-1ネガティブコントロールをフローサイトメーターに追加し、[記録]をクリックします。汚れた単一のコントロールをミックス解除するには、[Unmix]ボタンをクリックします。混合解除が完了したら、サンプルから破片を除去するためのSSC-A対FSC-A、ダブレットを除去するためのSSC-A対SSC-Hなどの非混合ワークシートを使用してシーケンシャルプロットを作成します。次に、プロットをクリックしてゲートを作成します。ワークシートにプロットを追加し、ゲート内をダブルクリックして、下流のゲート母集団を作成します。関心のあるすべての母集団が考慮されるまで続けます。次に、事前に調製した単一染色コントロールサンプルを摂氏37度に温めて逐次分析します。フローサイトメトリーソフトウェアをセットアップし、氷水中でDIを2〜3分間実行して、フローサイトメーターの流動性を確保します。混合されていないワークシートにシーケンシャルプロットを設定するには、ポリゴンの長方形または楕円ゲートボタンを使用してゲートを作成し、対象の母集団を含めます。ゲートの内側をダブルクリックし、y 軸と x 軸のパラメータを SSC-A 対 SSC-H に変更します。軸を左クリックして、軸パラメータの定義を完了します。SSC-A対生存率色素シグナルのプロットを作成します。アミン色素染色が陰性の生細胞をゲートします。生死染色陰性の生細胞は、y軸とx軸の両方のゼロマークにクラスター化します。内側のプロットをダブルクリックして、単一細胞の生リンパ球のみを含む新しいプロットを作成します。カルシウム流入を視覚化するために、X 軸の Y 軸を Indo-1 対時間に変更します。次に、温めた生物学的サンプルを機械のSITに入れます。中程度の流速で毎秒2, 500〜3000イベントでサンプルを実行し、限られた数の細胞集団におけるカルシウム流入を視覚化します。次のチューブを取得制御のビーズバスに追加します。記録を押して初期データを30秒間記録し、サンプル中のカルシウムシグナル伝達の基礎レベルを取得します。次に、[停止]をクリックして、サンプル注入ポートからチューブを取り外します。30マイクログラムの非抱合型抗CD3をサンプルチューブに直接追加して、カルシウム流入を開始します。チューブをサンプル注入ポートにすばやく戻し、ソフトウェアの[記録]を押します。ソフトウェアのアクイジションコントロールで経過時間を監視しながら、7分間データを記録します。次に、ソフトウェアで[停止]を押します。イオノマイシン1ミリリットルあたり1マイクログラムを追加し、30秒間記録して、目的の細胞で最大のカルシウムシグナルを取得します。次のサンプルに進み、すべてのサンプルが収集されるまでワークフローを繰り返します。実験を保存し、エクスポート zip ファイルをクリックします。混合されていないファイルは、外部のフローサイトメトリー分析ソフトウェアにアップロードされます。時間対側方散乱のプロットにおける安定した一貫した信号は、流体安定性を示した。リンパ球集団をゲーティングした後、側方散乱高さ対面積のプロット上で一重項を識別した。一重項は生存率について評価した。次に、CD19陰性集団のゲーティングを適用しました。これらのT細胞サブセットは、カルシウム結合インド-1蛍光対時間比を視覚化することにより、CD4およびCD8に対する抗体を使用して評価されました。個々の細胞集団において、カルシウム結合型Indo-1の時間に対するプロットは、刺激前のベースラインを示した。細胞内カルシウムレベルが低下するにつれてピーク応答し、カルシウム応答はイオノマイシンを添加することによって誘発されました。抗CD3抗体添加前に、弱いカルシウム結合Indo-1シグナルが検出された。ピーク応答の間、細胞は強いカルシウム結合Indo-1シグナルを示し、カルシウムフリーIndo-1を減少させた。ピーク後5分で、Indo-1蛍光はほぼベースラインに戻った。イオノマイシン添加後、カルシウム結合Indo-1の堅牢なシグナルが可視化され、細胞の適切な色素負荷が示されました。希少集団の分析は、関心のある各集団をゲーティングした後、カルシウム結合型Indo-1とカルシウムを含まないIndo-1をプロットすることによって実行されました。各サブセットについて全経時変化にわたるカルシウム応答を解析した。フルスペクトルプロファイリングを用いたカルシウムフラックスは、さまざまな免疫サブセットにおける高パラメータフローサイトメトリー分析につながる可能性があります。T細胞サブセットの偏りのないクラスタリングのための高次元解析は、高度な解析のためにハイパラメータフローサイトメトリーと組み合わせて使用することができます。この技術は、バルクサンプル中の複数の免疫サブセットを互いに組み合わせて分析するために開発されました。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

T細胞におけるクロマチンの状態を評価するためにフローサイトメトリーの使用

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた定量化

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

マウス胸腺、膵リンパ節および脾臓フローサイトメトリーを用いた排水における制御性 T 細胞サブセットの定量

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...