Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro 유세포 분석 공유 리소스, RRID:SCR_021321, Aurora 및 SpectroFlo 소프트웨어에 대한 전체 스펙트럼 세포 분석 분석에 대한 지속적인 논의를 해주신 Cytek의 동료들에게 깊은 감사를 드립니다. 피규어는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

마우스는 IACUC 프로토콜에 따라 콜로라도 대학교 안슈츠 메디컬 캠퍼스에서 유지되었습니다. 모든 마우스는 AAALAC 기준에 따라 안락사시켰다.
1. 마우스 비장에서 면역세포의 제조
참고: 순진한 마우스를 CO2 안락사로 안락사시킵니다. Jackson Laboratories에서 구입하여 사내에서 사육한 C57BL/6 마우스를 6-12주령의 실험에 사용합니다. 수컷과 ?...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+An+overview.">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase,+Itk.">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2++channels.">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).</li><li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석 7,8을 사용하여 적정된 Indo-1 비율계량 지표 염료가 로드된 1차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 측정하도록 설계된 최적화된 분석을 설명합니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 칼슘 플럭스 분석을 수행하는 이점은 Indo-1 형광 평가와 함께 표면 세포 마커 염색을 멀티플렉싱할 수 있다는 것입니다. 전체 스펙?...

T 세포 수용체(TCR) 유도 칼슘 유입은 T 세포 활성화의 유용한 척도이며 T 세포 집단이 TCR 신호 전달 경로1의 근위 단계에서 손상된 반응을 갖는지 여부를 결정하는 데 자주 사용됩니다. 칼슘 유입의 측정은 일반적으로 하나 또는 한 쌍의 형광 칼슘 지시약 염료로 T 세포를 사전 표지한 다음 TCR 가교후 실시간으로 유세포 분석을 사용하여 형광 신호를 검사하여 수행됩니다 2,3,4. 비율 미터법 칼슘 염료인 Indo-1은 칼슘 결합5에 따라 두 가지 다른 파장에서 피크 방출로 UV 레이저에 의해 여기되며, 살아있는 림프구의 칼슘 반응에 대한 유세포 분석 분석에 일반적으로 사용되는 지표 염료입니다. Indo-1의 방출 프로파일이 매우 광범위하기 때문에 Indo-1 평가와 대역 통과 유세포 분석에 의한 여러 세포 표면 마커의 동시 분석을 결합하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 제한은 T 세포의 사전 정제된 집단 또는 제한된 세포 표면 분자 세트에 의해 식별된 집단에 대한 칼슘 반응의 유세포 분석 분석의 활용을 제한합니다.
띠통과 유세포 분석을 사용하여 원발성 림프구의 이질적인 집단에 대한 칼슘 반응 측정의 한계를 해결하기 위해 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 Indo-1 형광을 측정하는 프로토콜이 개발되었습니다. 이 방법을 사용하면 Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화할 수 있으며, 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용할 수 있습니다. 기존의 유세포 분석에 비해 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하면 형광 신호와 고도로 겹치는 염료를 구별할 수 있어 각 샘플에서 동시에 평가할 수 있는 표면 마커의 수가 증가한다는 장점이 있습니다. 종래의 유세포 분석은 대역통과 필터를 사용하며, 검출기 시스템당 하나의 형광색소로 제한된다6. 전체 스펙트럼 유세포 분석은 5-레이저 스펙트럼 유세포 분석 시스템 7,8에서 64개의 검출기를 사용하여 형광색소의 전체 스펙트럼에 걸쳐 신호를 수집합니다. 또한, 전체 스펙트럼 유세포 분석은 종래의 유세포 분석기에 존재하는 광전자 증배관 검출기에 비해 감도가 증가한 APD(Avalanche Photo Diode) 검출기를 이용한다8. 결과적으로, 이 접근법은 칼슘 염료 표지 전에 특정 T 세포 집단을 분리할 필요가 없기 때문에 말초 혈액 단핵 세포 또는 쥐 이차 림프 기관 세포 현탁액과 같은 이종 세포 집단에 이상적입니다. 대신, 데이터 수집 후 세포 표면 마커 발현 프로필 및 유세포 분석 게이팅을 사용하여 각 관심 집단에서 칼슘 반응을 평가할 수 있습니다. 이 보고서에서 볼 수 있듯이 Indo-1은 8개의 형광색소 접합 항체와 쉽게 결합되어 총 10개의 고유한 스펙트럼 시그니처를 생성할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 선천적으로 구별되는 마우스 계통의 세포 혼합물에 쉽게 적용할 수 있어 유전자 표적 마우스 계통의 칼슘 반응과 비교하여 야생형 T 세포의 칼슘 반응을 동시에 분석할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

T 세포 수용체 자극에 대한 반응으로 칼슘 유입은 T 세포 신호 전달의 일반적인 척도입니다. 띠 통과 유세포 분석에 의한 칼슘 신호 전달을 평가하기 위해 여러 칼슘 지표 염료가 개발되었습니다. 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석을 사용하여 일차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 측정하도록 설계되었습니다. 총 비장 세포는 세포 표면 분자에 대한 형광 색소 접합 항체 패널과 함께 비율 계량 칼슘 지표 염료 Indo-1로 표지됩니다. 전체 스펙트럼 유세포 분석의 기능을 활용하면 Indo-1과 함께 다양한 세포 표면 염색을 활용할 수 있는 플랫폼이 제공됩니다. 이어서, 세포는 T 세포 수용체를 자극하기 위해 항-CD3 항체의 첨가 전후에 37°C에서 실시간으로 분석된다. 스펙트럼 신호를 혼합하지 않은 후, 칼슘 결합 대 칼슘이 없는 Indo-1의 비율이 계산되고 비장 세포의 각 게이트 집단에 대해 시간 경과에 따라 시각화될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 여러 세포 집단에서 칼슘 반응을 동시에 분석할 수 있습니다.

다중화 표면 염색이 있는 Indo-1 비율계량 염료를 사용하여 일차 쥐 T 세포에서 칼슘 반응을 평가하는 실험 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. 마우스 비장세포를 채취하여 단일 세포 현탁액으로 처리한 후, 세포를 Indo-1 AM 에스테르로 염색하고 표면을 형광 색소 결합 항체로 염색합니다. 염료 로딩 및 항체 염색이 완료되면 림프구 샘플을 생물학적 온도(37°C)로 예열합니다. ?...

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Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

T 세포 신호 전달의 척도인 칼슘 유입은 T 세포 수용체 자극에 대한 반응을 분석하는 효과적인 방법입니다. Indo-1을 세포 표면 분자를 겨냥한 항체 패널과 다중화하기 위한 이 프로토콜은 전체 스펙트럼 유세포 분석의 매우 유연한 기능을 활용합니다.

Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

이 프로토콜을 통해 연구자는 일차 T 세포의 칼슘 반응을 동시에 측정하고 하위 집합 및 표면 표현형을 평가할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 칼슘 반응을 검사하기 전에 세포의 특정 하위 집합을 분리할 필요가 없다는 것입니다. 시작하려면 50 마이크로 그램의 DMSO를 50 마이크로 그램의 Indo-1 AM이 들어있는 바이알에 첨가하여 Indo-1 AM의 마이크로 리터 당 1 마이크로 그램의 저장 용액을 준비합니다. 원액을 적절한 부피의 cRPMI와 밀리리터당 6마이크로그램의 농도로 희석합니다.섭씨 37도의 수조에 매체를 넣습니다. 그런 다음 이 배지를 사용하여 이전에 제조된 세포 현탁액을 1:1 비율로 희석하여 밀리리터당 5-600만 개의 세포를 얻습니다. 다음에, 12-웰 조직 배양 플레이트에, 실험 조건당 웰 당 1 밀리리터의 세포 현탁액을 첨가한다.Indo-1 염료가 로딩된 세포에 EGTA를 첨가하여 칼슘이 없는 Indo-1에 대한 단일 염색 대조군 샘플을 준비합니다. 형광단이나 Indo-1 염료가 없는 생물학적 음성 조절을 위한 웰을 준비합니다. 유세포 분석기에서 염료가 로딩된 세포 현탁액에 50 마이크로몰의 농도로 이오노마이신을 첨가하여 Indo-1 양성 대조군을 준비합니다.또한, 항체 접합 형광단을 사용하여 추가 세포 집단에 대한 단일 염색 대조군을 위한 웰을 준비합니다. 그런 다음 백만 세포당 2마이크로그램의 FC 수용체 차단 항체를 추가하고 세포를 재현탁하기 위해 15분마다 두드리면서 45분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 플레이트로부터 세포의 전체 부피를 혼합 및 제거하고 1.7 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 첨가한다.원심분리하고 상등액을 디캔팅합니다. 세포가 1밀리리터의 예열된 cRPMI로 세척되면, 다시 펠렛화하고 상청액을 경사 제거한다. 1밀리리터의 cRPMI에 세포를 재현탁하고 각 튜브를 배양하여 가스 교환을 위해 튜브의 상단을 약간 열어 두어 세포 내 AM 에스테르의 완전한 탈에스테르화를 허용합니다.다음으로, 모든 사용자 정의 형광색소 접합 항체의 마스터 믹스를 준비하고 이를 세포 부피의 1밀리리터 동안 휴지기 세포에 추가합니다. 휴식 후, 세포를 펠렛화하고, 섭씨 4도로 냉각된 cRPMI 1밀리리터에 재현탁하여 펠릿을 세척한다. 이 단계를 반복하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.캡이 있는 5밀리리터 폴리스티렌 플로우 튜브를 사용하여 500마이크로리터의 페놀 레드가 없는 cRPMI에 개별 시료를 재현탁합니다. 칼슘 플럭스 분석을 사용하여 온도를 유지하려면 작은 수조에 목욕 비즈를 추가하여 비드 배스를 준비하고 섭씨 37도까지 데우십시오. 50밀리리터 크로니클 튜브를 조심스럽게 반으로 자르고 튜브 상단을 버립니다.나머지 튜브의 4분의 3을 목욕 구슬로 채우고 구슬 욕조에서 섭씨 37도에 도달하도록 합니다. 비드 배스를 유세포 분석기 근처에 놓고 스티로폼 랙과 함께 튜브를 배치합니다. 유세포 분석기에서 분석하기 전에 튜브를 개별적으로 섭씨 37도까지 7분 동안 예열합니다.유세포 분석기 소프트웨어에 로그인하고 라이브러리 탭을 클릭합니다. 그런 다음 형광 태그를 선택하여 칼슘 결합 Indo-1 및 칼슘 무함유 Indo-1을 추가합니다. 그런 다음 형광 태그 그룹에서 UV 레이저를 선택하고 추가를 클릭하여 형광 태그 이름을 추가합니다.레이저 여기(laser excitation) 및 방출 파장(emission wavelength)을 선택한 다음 Save(저장)를 클릭합니다. 실험 설정을 계속합니다. 획득 탭을 클릭하고 새 실험을 열기/만들기를 클릭하고 원하는 형광 태그를 실험에 추가합니다.실험에 대한 참조 그룹과 새 샘플 그룹을 만들고 두 그룹에 레이블을 지정합니다. 획득 탭에서 이벤트를 최대 1,000만 개로 기록하고, 중지 볼륨을 최대 3000마이크로리터로 설정하고, 중지 시간을 최대 36, 000초로 설정합니다. 다색 패널에 포함된 사용자 정의 접합 항체 및 Indo-1 기능성 염료에 대한 단일 염색 대조군을 획득합니다.50마이크로몰의 이오노마이신을 칼슘 결합 Indo-1 양성 대조군에 추가하고 소용돌이칩니다. 플로우 튜브를 샘플 주입 보드에 추가하고 Record(기록)를 클릭합니다. 그런 다음 칼슘이 없는 Indo-1 음성 대조군을 유세포 분석기에 추가하고 기록을 클릭합니다.Unmix 버튼을 클릭하여 단일 염색 컨트롤을 혼합하지 않습니다. 혼합 해제가 완료되면 샘플에서 잔해물을 제거하기 위해 SSC-A 대 FSC-A, 이중선을 제거하기 위해 SSC-A 대 SSC-H와 같은 혼합되지 않은 워크시트를 사용하여 순차적 플롯을 만듭니다. 그런 다음 플롯을 클릭하여 게이트를 만듭니다.워크시트에 플롯을 추가하고 게이트 내부를 두 번 클릭하여 다운스트림 게이트 모집단을 생성합니다. 관심 있는 모든 모집단이 설명될 때까지 계속합니다. 다음으로, 순차적 분석을 위해 이전에 준비된 단일 염색 대조군 샘플을 섭씨 37도까지 따뜻하게 합니다.유세포 분석 소프트웨어를 설정하고 얼음물에서 2-3분 동안 DI를 실행하여 유세포 분석기의 유체 안정성을 보장합니다. 관심 있는 모집단을 포함하도록 polygon rectangle 또는 ellipse gate 버튼을 사용하여 게이트를 생성하여 혼합되지 않은 워크시트에 순차적 플롯을 설정합니다. 게이트 내부를 두 번 클릭하고 y축 및 x축 매개변수를 SSC-A 대 SSC-H로 변경합니다.축을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 축 매개변수 정의를 완료합니다. SSC-A 대 생존성 염료 신호로 플롯을 만듭니다. 아민 염료 염색을 위해 음성인 살아있는 세포를 게이트합니다.살아있는 죽은 염색에 대해 음성인 살아있는 세포는 y축과 x축 모두에서 0 표시에 모입니다. 내부 플롯을 두 번 클릭하여 단일 세포 살아있는 림프구만 포함하는 새 플롯을 만듭니다. 칼슘 유입을 시각화하기 위해 Y축을 Indo-1 대 x축의 시간으로 변경합니다.다음으로 데워진 생물학적 샘플을 기계의 SIT에 넣습니다. 중간 유속에서 초당 2, 500 - 3000 이벤트로 샘플을 실행하여 제한된 수의 세포 집단에서 칼슘 유입을 시각화합니다. 획득 제어에서 비드 배스에 다음 튜브를 추가합니다.Record를 눌러 30초 동안 초기 데이터를 기록하여 샘플에서 칼슘 신호의 기초 수준을 얻습니다. 그런 다음 중지를 클릭하고 샘플 주입 포트에서 튜브를 제거합니다. 30마이크로그램의 비접합 항-CD3를 샘플 튜브에 직접 추가하여 칼슘 유입을 시작합니다.튜브를 샘플 주입 포트에 빠르게 다시 놓고 소프트웨어에서 Record를 누릅니다. 7분 동안 데이터를 기록하고 소프트웨어의 수집 제어 하에서 경과된 시간을 관찰합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 중지를 누릅니다.이오노마이신 1밀리리터당 1마이크로그램을 추가하고 30초 동안 기록하여 관심 세포에서 최대 칼슘 신호를 얻습니다. 다음 샘플을 계속 진행하고 모든 샘플이 수집될 때까지 워크플로를 반복합니다. 실험을 저장하고 zip 파일 내보내기를 클릭합니다.혼합되지 않은 파일은 외부 유세포 분석 소프트웨어에 업로드됩니다. 시간 플롯 대 측면 산란에서 안정적이고 일관된 신호는 유체 안정성을 나타냅니다. 림프구 개체군을 게이트한 후 측면 산란 높이 대 면적의 플롯에서 싱글렛을 식별했습니다.싱글렛은 생존력에 대해 평가되었습니다. 그런 다음 CD19 음성 집단에 게이팅을 적용했습니다. 이러한 T 세포 하위 집합은 칼슘 결합 Indo-1 형광 대 시간을 시각화하여 CD4 및 CD8에 대한 항체를 사용하여 평가되었습니다.개별 세포 집단에서, 칼슘 결합 Indo-1 대 시간의 플롯은 자극 전의 기준선을 나타냈다. 세포 내 칼슘 수치가 감소함에 따라 피크 반응이 나타나고 칼슘 반응은 이오노마이신을 추가하여 유도되었습니다. 항-CD3 항체 첨가 전에, 약한 칼슘-결합 인도-1 신호가 검출되었다.피크 반응 동안, 세포는 강한 칼슘 결합 Indo-1 신호를 보였고 칼슘이 없는 Indo-1을 감소시켰다. 피크 후 5 분 후에 Indo-1 형광은 거의 기준선으로 돌아 왔습니다. 이오노마이신 첨가 후, 칼슘 결합 Indo-1의 강력한 신호가 시각화되어 세포의 적절한 염료 로딩을 나타냅니다.희귀 개체군의 분석은 관심 있는 각 개체군에 대한 게이팅 후 칼슘 결합 Indo-1 대 칼슘이 없는 Indo-1을 플로팅하여 수행되었습니다. 각 서브세트에 대한 전체 시간 경과에 걸쳐 칼슘 반응을 분석한다. 전체 스펙트럼 프로파일링을 사용하는 칼슘 플럭스는 다양한 면역 하위 집합에서 높은 파라미터 유세포 분석으로 이어질 수 있습니다.T 세포 하위 집합의 편향되지 않은 클러스터링을 위한 고차원 분석은 고급 분석을 위해 높은 파라미터 유세포 분석과 함께 사용할 수 있습니다. 이 기술은 벌크 샘플에서 서로 결합된 여러 면역 하위 집합의 분석을 위해 개발되었습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...