Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Tusen takk til våre kolleger i Cytek for kontinuerlige diskusjoner om full spektral cytometrisk analyse av programvaren Aurora og SpectroFlo. Figurer ble laget med BioRender.com.

Mus ble opprettholdt ved University of Colorado Anschutz Medical campus i samsvar med IACUC-protokoller. Alle mus ble avlivet i henhold til AAALAC-standarder.
1. Forberedelse av immunceller fra musmilten
MERK: Avlive naive mus med CO2 eutanasi. C57BL/6 mus kjøpt fra Jackson Laboratories og avlet internt brukes til eksperimenter ved 6-12 ukers alder. Både hann- og hunnmus brukes til eksperimenter.
<ol><li>Desinfiser musehuden med 70% e...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+An+overview.">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase,+Itk.">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2++channels.">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).</li><li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

Denne protokollen beskriver en optimalisert analyse designet for å måle kalsiumresponser i primære murine T-celler lastet med titrert Indo-1 ratiometrisk indikatorfargestoff ved bruk av fullspektret flowcytometri 7,8. Fordelen med å utføre kalsiumfluksanalyser ved bruk av fullspektret flowcytometri er evnen til å multiplekse overflatecellemarkørfarging i kombinasjon med vurdering av Indo-1-fluorescens. Fullspektret flowcytometri har fordelen av å tillate ...

T-cellereseptor (TCR) indusert kalsiuminnstrømning er et nyttig mål på T-celleaktivering og brukes ofte til å avgjøre om en populasjon av T-celler har svekkede responser i de proksimale trinnene i TCR-signalveien1. Målinger av kalsiuminnstrømning utføres vanligvis ved å forhåndsmerke T-cellene med ett eller et par fluorescerende kalsiumindikatorfargestoffer, og deretter undersøke de fluorescerende signalene ved hjelp av flowcytometri i sanntid etter TCR-kryssbinding 2,3,4. Indo-1, et forholdsmetrisk kalsiumfargestoff, er begeistret av UV-laseren med topputslipp ved to forskjellige bølgelengder avhengig av kalsiumbinding5, og er et vanlig brukt indikatorfargestoff for flowcytometrianalyse av kalsiumresponser i levende lymfocytter. Siden emisjonsprofilen til Indo-1 er ganske bred, kan det være utfordrende å kombinere Indo-1-vurdering med samtidig analyse av flere celleoverflatemarkører ved hjelp av båndpassflowcytometri. Denne begrensningen begrenser bruken av flowcytometrianalyse av kalsiumresponser til forhåndsrensede populasjoner av T-celler eller til populasjoner identifisert av et begrenset sett med molekyler på celleoverflaten.
For å løse begrensningene ved måling av kalsiumrespons på heterogene populasjoner av primære lymfocytter ved bruk av båndpassflowcytometri, ble det utviklet en protokoll for å måle Indo-1-fluorescens ved bruk av fullspektret flowcytometri. Denne metoden tillater multipleksing av Indo-1 med paneler av antistoffer rettet mot celleoverflatemolekyler, og utnytter de svært fleksible egenskapene til fullspektret flowcytometri. Fordelen med å bruke fullspektret flowcytometri fremfor konvensjonell flowcytometri er evnen til å skille fluorescerende signaler fra sterkt overlappende fargestoffer, og dermed øke antall overflatemarkører som kan vurderes samtidig i hver prøve. Konvensjonell flowcytometri bruker båndpassfiltre og er begrenset til ett fluorokrom per detektorsystem6. Full spektrum flowcytometri samler signaler over hele spekteret av fluorokrom ved hjelp av 64 detektorer på et fem-laser spektralt flowcytometrisystem 7,8. I tillegg utnytter fullspektret flowcytometri APD-detektorer (Avalanche Photo Diode) som har økt følsomhet i forhold til fotomultiplikatorrørdetektorer som finnes på konvensjonelle strømningscytometre8. Følgelig er denne tilnærmingen ideell for heterogene cellepopulasjoner, for eksempel mononukleære celler i perifert blod eller murine sekundære lymfoide organcellesuspensjoner, da det eliminerer behovet for isolering av spesifikke T-cellepopulasjoner før kalsiumfargestoffmerking. I stedet kan ekspresjonsprofiler for celleoverflatemarkører og flowcytometrigating etter datainnsamling brukes til å vurdere kalsiumresponser i hver populasjon av interesse. Som vist i denne rapporten, kan Indo-1 lett kombineres med åtte fluorokrom-konjugerte antistoffer, noe som resulterer i totalt 10 unike spektrale signaturer. Videre kan denne metoden lett brukes på blandinger av celler fra kongenisk distinkte muselinjer, noe som muliggjør samtidig analyse av kalsiumresponser i villtype T-celler sammenlignet med de fra en genmålrettet muselinje.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

Kalsiuminnstrømning som respons på T-cellereseptorstimulering er et vanlig mål for T-cellesignalering. Flere kalsiumindikatorfargestoffer er utviklet for å vurdere kalsiumsignalering ved hjelp av båndpassflowcytometri. Denne protokollen er utformet for å måle kalsiumresponser i primære murine T-celler ved bruk av fullspektret flowcytometri. Totale splenocytter er merket med ratiometrisk kalsiumindikatorfargestoff Indo-1, sammen med et panel av fluorokrom-konjugerte antistoffer mot celleoverflatemolekyler. Utnyttelse av egenskapene til fullspektret flowcytometri gir en plattform for å utnytte et bredt utvalg av celleoverflateflekker i kombinasjon med Indo-1. Cellene analyseres deretter i sanntid ved 37 °C før og etter tilsetning av et anti-CD3-antistoff for å stimulere T-cellereseptoren. Etter å ha blandet spektralsignalene, beregnes forholdet mellom kalsiumbundet og kalsiumfritt Indo-1 og kan visualiseres over tid for hver inngjerdede populasjon av splenocytter. Denne teknikken kan tillate samtidig analyse av kalsiumresponser i flere cellepopulasjoner.

Den eksperimentelle arbeidsflyten for å vurdere kalsiumresponser i primære murine T-celler ved bruk av et Indo-1-ratiometrisk fargestoff med multipleksende overflateflekker er vist i figur 1. Etter høsting og bearbeiding av musens miltocytter i en enkeltcellesuspensjon, blir cellene farget med en Indo-1 AM-ester og overflatefarget med fluorokrombundne antistoffer. Når fargestoffbelastningen og antistofffargingen er fullført, varmes lymfocyttprøvene opp til en biologisk temperatur (37 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Kalsiuminnstrømning, et mål på T-cellesignalering, er en effektiv måte å analysere responser på T-cellereseptorstimulering. Denne protokollen for multipleksing av Indo-1 med paneler av antistoffer rettet mot celleoverflatemolekyler utnytter de svært fleksible egenskapene til fullspektret flowcytometri.

Analyse av T-cellereseptorindusert kalsiuminnstrømning i primære Murine T-celler ved fullspektret flowcytometri

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Protokollen tillater etterforskere å måle kalsiumrespons samtidig i primære T-celler sammen med å vurdere deres delmengde og overflatefenotype. Den største fordelen med denne teknikken er at den unngår behovet for å isolere spesifikke delmengder av celler før de undersøker kalsiumresponsene. For å begynne, forberede en mikrogram per mikroliter stamløsning av Indo-1 AM ved å tilsette 50 mikroliter DMSO i et hetteglass som inneholder 50 mikrogram Indo-1 AM. Fortynn stamoppløsningen til et passende volum cRPMI og en konsentrasjon på seks mikrogram per milliliter.Plasser mediet i et vannbad ved 37 grader Celsius. Bruk deretter dette mediet til å fortynne en tidligere forberedt cellesuspensjon i et en-til-ett-forhold for å få fem til 6 millioner celler per milliliter. Deretter tilsettes en milliliter cellesuspensjon per brønn per brønn per eksperimentell tilstand til en 12-brønns vevskulturplate.Forbered en enkelt farget kontrollprøve for kalsiumfri Indo-1 ved å legge EGTA til Indo-1 fargestoffbelastede celler. Forbered en brønn for biologisk negativ kontroll uten fluoroforer eller Indo-1-fargestoff. Forbered en Indo-1 positiv kontroll ved å tilsette ionomycin i en konsentrasjon på 50 mikromol til den fargebelastede cellesuspensjonen ved flowcytometeret.Forbered også en brønn for enkeltflekkkontroller for ytterligere cellepopulasjoner ved bruk av antistoffkonjugerte fluoroforer. Deretter tilsettes to mikrogram FC-reseptorblokkerende antistoff per million celler og inkuberer platen i 45 minutter med tapping hvert 15. minutt for å resuspendere cellene. Etter inkubering, bland og fjern hele volumet av celler fra platen og legg det til 1,7 milliliter mikrosentrifugerør.Sentrifuge og dekantere supernatanten. Når cellene er vasket med en milliliter forvarmet cRPMI, pellet igjen og dekanter supernatanten. Resuspender cellene i en milliliter cRPMI og inkuber hvert rør, slik at toppen av røret er litt åpen for gassutveksling, slik at fullstendig de-esterifisering av de intracellulære AM-estere.Deretter lager du en masterblanding av alle de brukerdefinerte fluorokromkonjugerte antistoffene og legger det til hvilecellene for en milliliter av cellevolumet. Etter hvile, pellet cellene og vask pelleten ved å resuspendere i en milliliter cRPMI kjølt til fire grader Celsius. Gjenta dette trinnet og legg rørene på is.Resuspender individuelle prøver i 500 mikroliter fenolfri cRPMI ved hjelp av et fem milliliter polystyrenstrømningsrør med en hette. For å opprettholde temperaturen ved hjelp av kalsiumfluxanalyse, lag et perlebad ved å legge badeperler til et lite vannbad og varme det opp til 37 grader Celsius. Klipp forsiktig et 50 milliliter krønikerør i to og kast toppen av røret.Fyll tre fjerdedeler av det gjenværende røret med badeperler og la det nå 37 grader Celsius i perlebadet. Plasser perlebadet i nærheten av et flowcytometer, sammen med et isoporstativ for å plassere røret. Før analysen på strømningscytometeret, varm rørene individuelt til 37 grader Celsius i syv minutter.Logg på flowcytometer-programvaren og klikk på kategorien Bibliotek. Velg deretter fluorescerende koder for å legge til kalsiumbundet Indo-1 og kalsiumfri Indo-1. Velg deretter UV-laser under fluorescerende taggrupper og klikk på legg til for å legge til et fluorescerende merkenavn.Velg lasereksitasjon og emisjonsbølgelengde, og klikk deretter Lagre. Fortsett til det eksperimentelle oppsettet. Klikk på Brukeranskaffelse-fanen, Åpne/Opprett et nytt eksperiment og legg til de ønskede fluorescerende kodene i eksperimentet.Opprett en referansegruppe og en ny eksempelgruppe for eksperimentet, og merk begge gruppene. Under fanen Anskaffelser angir du hendelsene til maksimalt 10 millioner, stoppvolum til maksimalt volum på 3000 mikroliter og stopptid til maksimalt 36 000 sekunder. Skaff enkeltfargede kontroller for brukerdefinerte konjugerte antistoffer inkludert i flerfargepanelet og for Indo-1 funksjonelt fargestoff.Tilsett 50 mikromol ionomycin til den kalsiumbundne Indo-1 positive kontrollen og virvelen. Legg strømningsrøret til injeksjonsprøvekortet og klikk på Registrer. Legg deretter til kalsiumfri Indo-1 negativ kontroll til flowcytometeret og klikk på Record.Unmixed single stained kontrollene ved å klikke på Unmix knappen. Når blandingen er fullført, oppretter du sekvensielle plott ved hjelp av det ublandede regnearket, for eksempel SSC-A kontra FSC-A, for å fjerne rusk fra prøven og SSC-A kontra SSC-H for å fjerne dubletter. Opprett deretter porter ved å klikke på Plot.Legg til et plott i regnearket, og dobbeltklikk i porten for å opprette en nedstrøms inngjerdet populasjon. Fortsett til alle populasjonene av interesse er gjort rede for. Deretter varmer du de tidligere tilberedte enkeltfargede kontrollprøvene til 37 grader Celsius for sekvensiell analyse.Sett opp flowcytometriprogramvaren og kjør DI i isvann i to til tre minutter for å sikre fluidstabiliteten til strømningscytometeret. Sett opp sekvensielle plott i det ublandede regnearket ved å opprette porter ved hjelp av knappene mangekantrektangel eller ellipseport for å inkludere populasjonen av interesse. Dobbeltklikk inne i porten og endre y- og x-akseparametrene til SSC-A kontra SSC-H.Fullfør defineringen av akseparametrene ved å venstreklikke på aksen. Lag et plott med SSC-A versus levedyktig fargestoffsignal. Gate de levende cellene som er negative for aminfargefarging.Levende celler som er negative for levende dødfarging, vil klynge seg ved nullmerket på både y- og x-aksen. Dobbeltklikk på innsiden av plottet for å lage et nytt plott som bare inneholder encellede levende lymfocytter. Endre Y-aksen til Indo-1 versus tid på x-aksen for visualisering av kalsiuminnstrømningen.Deretter plasserer du den oppvarmede biologiske prøven i SIT på maskinen. Kjør prøvene ved 2.500 til 3000 hendelser per sekund på en middels strømningshastighet for å visualisere kalsiuminnstrømning i et begrenset antall cellepopulasjoner. Legg neste rør til perlebadet i oppkjøpskontroll.Trykk på Record for å registrere de opprinnelige dataene i 30 sekunder for å oppnå et basalt nivå av kalsiumsignalering i prøven. Klikk deretter på Stopp og fjern røret fra prøveinjeksjonsporten. Tilsett 30 mikrogram ukonjugert anti-CD3 direkte inn i prøverøret for å initiere kalsiuminnstrømning.Sett slangen raskt tilbake på injeksjonsporten og trykk på Record i programvaren. Registrer data i syv minutter, og se tiden som er gått under anskaffelseskontrollene i programvaren. Trykk deretter på Stopp i programvaren.Legg til ett mikrogram per milliliter ionomycin og registrer i 30 sekunder for å oppnå maksimalt kalsiumsignal i cellene av interesse. Fortsett til neste prøve og gjenta arbeidsflyten til alle prøvene er samlet inn. Lagre eksperimentet og klikk på eksport-zip-filen.Ublandede filer lastes opp til ekstern programvare for flowcytometrianalyse. Et stabilt konsistent signal i et tidsplott versus sidespredning indikerte fluidisk stabilitet. Lymfocyttpopulasjonen ble inngjerdet etterfulgt av diskriminering av singleter på en tomt med sidespredningshøyde versus areal.Singlets ble vurdert for levedyktighet. Deretter ble det brukt på CD19-negativ populasjon. Disse T-celle undergruppene ble vurdert ved hjelp av antistoffer mot CD4 og CD8 ved å visualisere kalsiumbundet Indo-1 fluorescens versus tid.I individuelle cellepopulasjoner viste plottet av kalsiumbundet Indo-1 versus tid en baseline før stimulering. En maksimal respons da intracellulære kalsiumnivåer falt og kalsiumresponsen fremkalte ved å legge til ionomycin. Før tillegg av anti-CD3-antistoff ble det påvist et svakt kalsiumbundet Indo-1-signal.Under toppresponsen viste cellene et sterkt kalsiumbundet Indo-1-signal og redusert kalsiumfritt Indo-1. Fem minutter etter toppen var Indo-1-fluorescensen nesten tilbake til baseline. Etter ionomycintillegg ble et robust signal om kalsiumbundet Indo-1 visualisert, noe som indikerer tilstrekkelig fargebelastning av cellene.Analyse av de sjeldne populasjonene ble utført ved å plotte kalsiumbundet Indo-1 versus kalsiumfri Indo-1 etter å ha samlet på hver populasjon av interesse. Og analysere kalsiumresponsen over hele tidsforløpet for hver delmengde. Kalsiumfluks ved bruk av fullspektret profilering kan føre til cytometrisk analyse av høy parameterstrøm i en rekke immunundergrupper.Høydimensjonsanalyse for objektiv gruppering av T-celleundergrupper kan brukes i kombinasjon med høy parameterflowcytometri for avansert analyse. Denne teknikken er utviklet for analyse av flere immunundergrupper i forbindelse med hverandre i en bulkprøve.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Endring av primære humane T celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning av Fluorescent Nanoparticle Interaksjoner med Primær immun celle subpopulasjoner av flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Bruk av flowcytometrisystemer å vurdere tilstanden til Chromatin i T-celler

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling av T-celle alloreaktiviteten hjelp Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakteristikk av menneskelig Monocyte delsett av hele blod flyte cytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarget flyt cytometri-baserte kvantifisering av mitokondrier og lysosomer i T-celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Fastsettelse av regulatoriske T-celle delsett i Murine Thymus, bukspyttkjertelen drenering lymfeknute og milt bruker flowcytometri

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...