Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Muchas gracias a nuestros colegas de Cytek por las continuas discusiones sobre el análisis citométrico espectral completo en el software Aurora y SpectroFlo. Las figuras fueron creadas con BioRender.com.

Los ratones se mantuvieron en el campus médico Anschutz de la Universidad de Colorado de acuerdo con los protocolos de IACUC. Todos los ratones fueron sacrificados de acuerdo con los estándares de AAALAC.
1. Preparación de células inmunes del bazo del ratón
NOTA: Eutanasia a ratones ingenuos con eutanasia deCO2 . Los ratones C57BL / 6 comprados en Jackson Laboratories y criados internamente se utilizan para experimentos a las 6-12 sema...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. 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L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. 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Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

Este protocolo describe un ensayo optimizado diseñado para medir las respuestas de calcio en células T murinas primarias cargadas con colorante indicador ratiométrico Indo-1 titulado utilizando citometría de flujo de espectro completo 7,8. La ventaja de realizar ensayos de flujo de calcio utilizando citometría de flujo de espectro completo es la capacidad de multiplexar la tinción del marcador celular de superficie en combinación con la evaluación de la f...

La afluencia de calcio inducida por receptores de células T (TCR) es una medida útil de la activación de células T y se usa con frecuencia para determinar si una población de células T tiene respuestas deterioradas en los pasos proximales de la vía de señalización TCR1. Las mediciones de la afluencia de calcio generalmente se realizan marcando previamente las células T con uno o un par de colorantes indicadores fluorescentes de calcio, y luego examinando las señales fluorescentes utilizando citometría de flujo en tiempo real después de la reticulación TCR 2,3,4. Indo-1, un colorante de calcio métrico de relación, es excitado por el láser UV con emisiones máximas en dos longitudes de onda diferentes dependiendo de la unión al calcio5, y es un colorante indicador comúnmente utilizado para el análisis de citometría de flujo de las respuestas de calcio en linfocitos vivos. Como el perfil de emisión de Indo-1 es bastante amplio, puede ser difícil combinar la evaluación de Indo-1 con el análisis simultáneo de múltiples marcadores de superficie celular mediante citometría de flujo de paso de banda. Esta limitación restringe la utilización del análisis de citometría de flujo de las respuestas de calcio a poblaciones prepurificadas de células T o a poblaciones identificadas por un conjunto limitado de moléculas de superficie celular.
Para abordar las limitaciones de medir las respuestas de calcio en poblaciones heterogéneas de linfocitos primarios mediante citometría de flujo de paso de banda, se desarrolló un protocolo para medir la fluorescencia Indo-1 mediante citometría de flujo de espectro completo. Este método permite multiplexar Indo-1 con paneles de anticuerpos dirigidos a moléculas de la superficie celular, aprovechando las capacidades altamente flexibles de la citometría de flujo de espectro completo. La ventaja de utilizar la citometría de flujo de espectro completo sobre la citometría de flujo convencional es su capacidad para distinguir las señales fluorescentes de colorantes altamente superpuestos, aumentando así el número de marcadores de superficie que se pueden evaluar simultáneamente en cada muestra. La citometría de flujo convencional utiliza filtros de paso de banda y está restringida a un fluorocromo por sistema detector6. La citometría de flujo de espectro completo recoge señales en todo el espectro del fluorocromo utilizando 64 detectores en un sistema de citometría de flujo espectral de cincoláseres 7,8. Además, la citometría de flujo de espectro completo aprovecha los detectores APD (Avalanche Photo Diode) que tienen una mayor sensibilidad en relación con los detectores de tubos fotomultiplicadores presentes en los citómetros de flujo convencionales8. En consecuencia, este enfoque es ideal para las poblaciones de células heterogéneas, como las células mononucleares de sangre periférica o las suspensiones murinas de células de órganos linfoides secundarios, ya que elimina la necesidad de aislar poblaciones específicas de células T antes del marcado del colorante de calcio. En cambio, los perfiles de expresión del marcador de superficie celular y la activación por citometría de flujo después de la recopilación de datos se pueden usar para evaluar las respuestas al calcio en cada población de interés. Como se muestra en este informe, Indo-1 se puede combinar fácilmente con ocho anticuerpos conjugados con fluorocromo, lo que resulta en un total de 10 firmas espectrales únicas. Además, este método se puede aplicar fácilmente a mezclas de células de líneas de ratón congénicamente distintas, lo que permite el análisis simultáneo de las respuestas de calcio en células T de tipo salvaje en comparación con las de una línea de ratón dirigida a genes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

La afluencia de calcio en respuesta a la estimulación del receptor de células T es una medida común de la señalización de células T. Se han desarrollado varios colorantes indicadores de calcio para evaluar la señalización de calcio mediante citometría de flujo de paso de banda. Este protocolo está diseñado para medir las respuestas de calcio en células T murinas primarias utilizando citometría de flujo de espectro completo. Los esplenocitos totales se marcan con el colorante indicador de calcio ratiométrico Indo-1, junto con un panel de anticuerpos conjugados con fluorocromo contra moléculas de la superficie celular. Aprovechar las capacidades de la citometría de flujo de espectro completo proporciona una plataforma para utilizar una amplia gama de tinciones de superficie celular en combinación con Indo-1. Las células se analizan en tiempo real a 37 °C antes y después de la adición de un anticuerpo anti-CD3 para estimular el receptor de células T. Después de desmezclar las señales espectrales, se calcula la proporción de Indo-1 unido a calcio libre y se puede visualizar a lo largo del tiempo para cada población cerrada de esplenocitos. Esta técnica puede permitir el análisis simultáneo de las respuestas de calcio en poblaciones celulares múltiples.

El flujo de trabajo experimental para evaluar las respuestas de calcio en células T murinas primarias utilizando un colorante ratiométrico Indo-1 con tinciones superficiales de multiplexación se muestra en la Figura 1. Después de cosechar y procesar los esplenocitos de ratón en una suspensión de una sola célula, las células se tiñen con un éster Indo-1 AM y se tiñen superficialmente con anticuerpos ligados al fluorocromo. Una vez que se completa la carga de colorante y la tinción...

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Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

La afluencia de calcio, una medida de la señalización de las células T, es una forma efectiva de analizar las respuestas a la estimulación del receptor de células T. Este protocolo para multiplexar Indo-1 con paneles de anticuerpos dirigidos a moléculas de superficie celular aprovecha las capacidades altamente flexibles de la citometría de flujo de espectro completo.

Análisis de la afluencia de calcio inducida por receptores de células T en células T murinas primarias mediante citometría de flujo de espectro completo

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

El protocolo permite a los investigadores medir simultáneamente la respuesta al calcio en las células T primarias junto con la evaluación de su subconjunto y fenotipo de superficie. La principal ventaja de esta técnica es que evita la necesidad de aislar subconjuntos específicos de células antes de examinar sus respuestas al calcio. Para comenzar, prepare una solución madre de un microgramo por microlitro de Indo-1 AM agregando 50 microlitros de DMSO en un vial que contenga 50 microgramos de Indo-1 AM. Diluir la solución madre en un volumen apropiado de cRPMI y una concentración de seis microgramos por mililitro.Coloque el medio en un baño de agua a 37 grados centígrados. Luego use este medio para diluir una suspensión celular previamente preparada en una proporción de uno a uno para obtener de cinco a 6 millones de células por mililitro. A continuación, a una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos, agregue un mililitro de suspensión celular por pocillo por condición experimental.Prepare una sola muestra de control teñida para Indo-1 libre de calcio agregando EGTA a las células cargadas con colorante Indo-1. Prepare un pozo para el control biológico negativo sin fluoróforos ni colorante Indo-1. Prepare un control positivo Indo-1 agregando ionomicina a una concentración de 50 micromoles a la suspensión celular cargada con colorante en el citómetro de flujo.Además, prepare un pozo para controles de tinción única para poblaciones celulares adicionales utilizando fluoróforos conjugados con anticuerpos. Luego agregue dos microgramos de anticuerpo bloqueador del receptor FC por millón de células e incube la placa durante 45 minutos con golpecitos cada 15 minutos para resuspender las células. Después de la incubación, mezcle y retire todo el volumen de células de la placa y agréguelo a los tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros.Centrifugar y decantar el sobrenadante. Una vez que las células se lavan con un mililitro de cRPMI precalentado, granular de nuevo y decantar el sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de cRPMI e incubar cada tubo, dejando la parte superior del tubo ligeramente abierta para el intercambio de gases, lo que permite la desesterificación completa de los ésteres AM intracelulares.A continuación, prepare una mezcla maestra de todos los anticuerpos conjugados de fluorocromo definidos por el usuario y agréguela a las células en reposo para obtener un mililitro del volumen celular. Después del reposo, pellet las células y lavar el pellet resuspendiendo en un mililitro de cRPMI enfriado a cuatro grados centígrados. Repita este paso y coloque los tubos sobre hielo.Resuspender muestras individuales en 500 microlitros de cRPMI libre de rojo de fenol utilizando un tubo de flujo de poliestireno de cinco mililitros con una tapa. Para mantener la temperatura utilizando el análisis de flujo de calcio, prepare un baño de cuentas agregando cuentas de baño a un pequeño baño de agua y caliéntelo hasta 37 grados centígrados. Corte cuidadosamente un tubo de crónica de 50 mililitros por la mitad y deseche la parte superior del tubo.Llene tres cuartas partes del tubo restante con cuentas de baño y permita que alcance los 37 grados centígrados en el baño de cuentas. Coloque el baño de cuentas cerca de un citómetro de flujo, junto con una rejilla de espuma de poliestireno para colocar el tubo. Antes del análisis en el citómetro de flujo, caliente los tubos individualmente a 37 grados centígrados durante siete minutos.Inicie sesión en el software del citómetro de flujo y haga clic en la pestaña Biblioteca. Luego seleccione etiquetas fluorescentes para agregar Indo-1 unido al calcio e Indo-1 sin calcio. Luego seleccione láser UV en grupos de etiquetas fluorescentes y haga clic en agregar para agregar un nombre de etiqueta fluorescente.Elija la excitación láser y la longitud de onda de emisión y, a continuación, haga clic en Guardar. Continúe con la configuración experimental. Haga clic en la pestaña Adquisición, Abrir/Crear un nuevo experimento y agregue las etiquetas fluorescentes deseadas al experimento.Cree un grupo de referencia y un nuevo grupo de muestra para el experimento y etiquete ambos grupos. En la pestaña Adquisiciones, establezca los eventos para que se registren al máximo en 10 millones, deteniendo el volumen hasta el volumen máximo de 3000 microlitros y el tiempo de detención hasta el máximo de 36, 000 segundos. Adquiera controles de tinción única para anticuerpos conjugados definidos por el usuario incluidos en el panel multicolor y para el colorante funcional Indo-1.Agregue 50 micromoles de ionomicina al control positivo y vórtice Indo-1 unido al calcio. Agregue el tubo de flujo a la placa de inyección de muestras y haga clic en Grabar. Luego agregue control negativo Indo-1 sin calcio al citómetro de flujo y haga clic en Grabar.Desmezcle los controles de una sola mancha haciendo clic en el botón Desmezclar. Una vez que se complete la mezcla, cree gráficos secuenciales utilizando la hoja de trabajo sin mezclar, como SSC-A versus FSC-A, para eliminar los desechos de la muestra y SSC-A versus SSC-H para eliminar dobletes. Luego cree puertas haciendo clic en Tramar.Agregue un gráfico a la hoja de cálculo y haga doble clic dentro de la puerta para crear una población cerrada río abajo. Continúe hasta que se contabilicen todas las poblaciones de interés. A continuación, caliente las muestras de control teñidas individuales previamente preparadas a 37 grados centígrados para el análisis secuencial.Configure el software de citometría de flujo y ejecute DI en agua helada durante dos o tres minutos para garantizar la estabilidad fluídica del citómetro de flujo. Configure gráficos secuenciales en la hoja de cálculo sin mezclar creando puertas utilizando los botones de rectángulo poligonal o puerta de elipse para incluir la población de interés. Haga doble clic dentro de la puerta y cambie los parámetros de los ejes y y x a SSC-A frente a SSC-H.Complete la definición de los parámetros del eje haciendo clic izquierdo en el eje. Cree una gráfica con SSC-A frente a la señal de tinte de viabilidad. Puerta de las células vivas que son negativas para la tinción de colorante de amina.Las células vivas negativas para la tinción de muertos vivos se agruparán en la marca cero tanto en el eje y como en el eje x. Haga doble clic en la gráfica interior para crear una nueva gráfica que contenga solo linfocitos vivos de una sola célula. Cambie el eje Y a Indo-1 frente al tiempo en el eje x para visualizar la afluencia de calcio.A continuación, coloque la muestra biológica calentada en la SIT de la máquina. Ejecute las muestras a 2, 500 a 3000 eventos por segundo en un caudal medio para visualizar la afluencia de calcio en un número limitado de poblaciones celulares. Agregue el siguiente tubo al baño de cuentas en el control de adquisición.Presione Grabar para registrar los datos iniciales durante 30 segundos para obtener un nivel basal de señalización de calcio en la muestra. Luego haga clic en Detener y retire el tubo del puerto de inyección de muestra. Agregue 30 microgramos de anti-CD3 no conjugado directamente en el tubo de muestra para iniciar la afluencia de calcio.Vuelva a colocar rápidamente el tubo en el puerto de inyección de la muestra y pulse Grabar en el software. Registre datos durante siete minutos, observando el tiempo transcurrido bajo los controles de adquisición en el software. A continuación, pulse Detener en el software.Añadir un microgramo por mililitro de ionomicina y registrar durante 30 segundos para obtener la máxima señal de calcio en las células de interés. Continúe con la siguiente muestra y repita el flujo de trabajo hasta que se hayan recopilado todas las muestras. Guarde el experimento y haga clic en el archivo zip de exportación.Los archivos sin mezclar se cargan en un software externo de análisis de citometría de flujo. Una señal consistente estable en un gráfico de tiempo versus dispersión lateral indicó estabilidad fluídica. La población de linfocitos fue cerrada seguida de discriminación de singletes en una gráfica de altura de dispersión lateral versus área.Se evaluó la viabilidad de los singletes. Luego se aplicó gating en población CD19 negativa. Estos subconjuntos de células T se evaluaron utilizando anticuerpos contra CD4 y CD8 mediante la visualización de la fluorescencia Indo-1 unida al calcio frente al tiempo.En poblaciones celulares individuales, la gráfica de Indo-1 unido al calcio versus el tiempo mostró una línea de base antes de la estimulación. Una respuesta máxima a medida que los niveles de calcio intracelular disminuyeron y la respuesta al calcio provocó la adición de ionomicina. Antes de la adición de anticuerpos anti-CD3, se detectó una señal débil de Indo-1 unida al calcio.Durante la respuesta máxima, las células mostraron una fuerte señal de Indo-1 unida al calcio y una reducción de Indo-1 libre de calcio. A los cinco minutos después del pico, la fluorescencia Indo-1 casi volvió a la línea de base. Después de la adición de ionomicina, se visualizó una señal robusta de Indo-1 unido al calcio, lo que indica una carga de colorante adecuada de las células.El análisis de las poblaciones raras se realizó trazando Indo-1 unido al calcio versus Indo-1 libre de calcio después de la activación de cada población de interés. Y analizar la respuesta del calcio durante todo el curso del tiempo para cada subconjunto. El flujo de calcio utilizando perfiles de espectro completo puede conducir a un análisis citométrico de flujo de alto parámetro en una variedad de subconjuntos inmunes.El análisis de alta dimensión para la agrupación no sesgada de subconjuntos de células T se puede utilizar en combinación con citometría de flujo de alto parámetro para un análisis avanzado. Esta técnica se desarrolla para el análisis de múltiples subconjuntos inmunes en conjunto entre sí en una muestra a granel.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

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Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

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La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

La medición de células T Alorreactividad recurriendo a imágenes de Citometría de Flujo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Cuantificación de basados en citometría de flujo multicolor de las mitocondrias y los lisosomas en las células T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...