Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

R01AI132419, CU | AMC İmmünomikro Akış Sitometrisi Paylaşılan Kaynak, RRID: SCR_021321, Aurora ve SpectroFlo yazılımı üzerinde tam spektral sitometrik analizin sürekli tartışmaları için Cytek'teki meslektaşlarımıza çok teşekkür ederiz. Figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Fareler, IACUC protokollerine uygun olarak Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp kampüsünde tutuldu. Tüm fareler AAALAC standartlarına göre ötenazi yapıldı.
1. Fare dalağından bağışıklık hücrelerinin hazırlanması
NOT: CO2 ötenazi ile naif fareleri ötenazi yapın. Jackson Laboratuvarları'ndan satın alınan ve şirket içinde yetiştirilen C57BL/6 fareleri, 6-12 haftalıkken deneyler için kullanılır. Deneyler için hem...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+An+overview.">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase,+Itk.">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2++channels.">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).</li><li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

Bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisi 7,8 kullanarak titre edilmiş Hint-1 oranmetrik indikatör boyası ile yüklenen primer murin T-hücrelerinde kalsiyum yanıtlarını ölçmek için tasarlanmış optimize edilmiş bir tahlili açıklamaktadır. Tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak kalsiyum akısı testleri yapmanın avantajı, Indo-1 floresansının değerlendirilmesi ile birlikte yüzey hücresi belirteci boyamasını çoklama yeteneğidir....

T-hücresi reseptörü (TCR) ile indüklenen kalsiyum akışı, T-hücresi aktivasyonunun yararlı bir ölçüsüdür ve sıklıkla bir T-hücresi popülasyonunun TCR sinyal yolu1'in proksimal adımlarında bozulmuş yanıtlara sahip olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Kalsiyum akışının ölçümleri genellikle T hücrelerinin bir veya bir çift floresan kalsiyum gösterge boyası ile önceden etiketlenmesi ve daha sonra TCR çapraz bağlama 2,3,4'ten sonra gerçek zamanlı olarak akış sitometrisi kullanılarak floresan sinyallerinin incelenmesiyle gerçekleştirilir. Orantı-metrik bir kalsiyum boyası olan Indo-1, kalsiyum bağlanma5'e bağlı iki farklı dalga boyunda pik emisyonlara sahip UV lazer tarafından uyarılır ve canlı lenfositlerde kalsiyum yanıtlarının akış sitometri analizi için yaygın olarak kullanılan bir gösterge boyasıdır. Hint-1'in emisyon profili oldukça geniş olduğundan, Hint-1 değerlendirmesini bant geçişli akış sitometrisi ile çoklu hücre yüzey belirteçlerinin eşzamanlı analizi ile birleştirmek zor olabilir. Bu sınırlama, önceden saflaştırılmış T hücresi popülasyonlarına veya sınırlı sayıda hücre yüzey molekülü tarafından tanımlanan popülasyonlara kalsiyum yanıtlarının akış sitometri analizinin kullanımını kısıtlar.
Primer lenfositlerin heterojen popülasyonları üzerindeki kalsiyum yanıtlarının bant geçişli akış sitometrisi kullanılarak ölçülmesinin sınırlamalarını ele almak için, tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak Hint-1 floresansını ölçmek için bir protokol geliştirilmiştir. Bu yöntem, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanarak, Hint-1'in hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoğullanmasına izin verir. Tam spektrumlu akış sitometrisinin geleneksel akış sitometrisine göre avantajı, floresan sinyallerini yüksek oranda örtüşen boyalardan ayırt etme kabiliyeti ve böylece her numunede aynı anda değerlendirilebilen yüzey belirteçlerinin sayısını arttırmasıdır. Geleneksel akış sitometrisi bandpass filtreleri kullanır ve dedektör sistemi6 başına bir florokrom ile sınırlıdır. Tam spektrumlu akış sitometrisi, beş lazerli spektral akış sitometri sistemi 7,8 üzerinde 64 dedektör kullanarak florokromun tüm spektrumu boyunca sinyaller toplar. Ek olarak, tam spektrumlu akış sitometrisi, geleneksel akış sitometrelerinde bulunan fotoçarpan tüp dedektörlerine göre artan duyarlılığa sahip APD (Çığ Fotoğraf Diyot) dedektörlerinden yararlanır8. Sonuç olarak, bu yaklaşım, kalsiyum boya etiketlemesinden önce spesifik T hücresi popülasyonlarının izolasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırdığından, periferik kan mononükleer hücreleri veya murin sekonder lenfoid organ hücresi süspansiyonları gibi heterojen hücre popülasyonları için idealdir. Bunun yerine, veri toplandıktan sonra hücre yüzey belirteci ekspresyon profilleri ve akış sitometrisi geçişi, ilgilenilen her popülasyondaki kalsiyum yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu raporda gösterildiği gibi, Hint-1, sekiz florokrom konjuge antikorla kolayca birleştirilebilir ve bu da toplam 10 benzersiz spektral imza ile sonuçlanır. Ayrıca, bu yöntem konjenik olarak farklı fare çizgilerinden gelen hücre karışımlarına kolayca uygulanabilir ve bu da gen hedefli bir fare hattından gelenlere kıyasla vahşi tip T hücrelerindeki kalsiyum tepkilerinin eşzamanlı analizine izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

T hücresi reseptör stimülasyonuna yanıt olarak kalsiyum akışı, T hücresi sinyallemesinin yaygın bir ölçüsüdür. Kalsiyum sinyalizasyonunu bant geçişli akış sitometrisi ile değerlendirmek için çeşitli kalsiyum indikatör boyaları geliştirilmiştir. Bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak birincil murin T-hücrelerindeki kalsiyum yanıtlarını ölçmek için tasarlanmıştır. Toplam splenositler, orantısal kalsiyum indikatör boyası Indo-1 ve hücre yüzey moleküllerine florokrom konjuge antikorlardan oluşan bir panel ile etiketlenir. Tam spektrumlu akış sitometrisinin yeteneklerinden yararlanmak, Hint-1 ile kombinasyon halinde çok çeşitli hücre yüzeyi lekelerini kullanmak için bir platform sağlar. Hücreler daha sonra T hücresi reseptörünü uyarmak için bir anti-CD3 antikorunun eklenmesinden önce ve sonra 37 ° C'de gerçek zamanlı olarak analiz edilir. Spektral sinyallerin karıştırılmasından sonra, kalsiyuma bağlı kalsiyumun kalsiyumsuz Hint-1'e oranı hesaplanır ve her kapılı splenosit popülasyonu için zaman içinde görselleştirilebilir. Bu teknik, çoklu hücre popülasyonlarında kalsiyum yanıtlarının eşzamanlı analizine izin verebilir.

Çoklu yüzey lekelerine sahip bir Hint-1 oranmetrik boya kullanarak birincil murin T-hücrelerinde kalsiyum yanıtlarını değerlendirmek için deneysel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Fare splenositlerini tek bir hücre süspansiyonuna topladıktan ve işledikten sonra, hücreler bir Hint-1 esteri ile boyanır ve yüzey florokroma bağlı antikorlarla boyanır. Boya yüklemesi ve antikor boyama işlemi tamamlandıktan sonra, lenfosit örnekleri biyolojik bir sıcaklığa (37 °...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1'i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.

Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Protokol, araştırmacıların birincil T hücrelerindeki kalsiyum yanıtını aynı anda ölçmelerine ve alt kümelerini ve yüzey fenotiplerini değerlendirmelerine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, kalsiyum yanıtlarını incelemeden önce hücrelerin belirli alt kümelerini izole etme ihtiyacını ortadan kaldırmasıdır. Başlamak için, 50 mikrogram Hint-1 içeren bir şişeye 50 mikrolitre DMSO ekleyerek Hint-1'nin mikrolitre stok çözeltisi başına bir mikrogram hazırlayın. Stok çözeltisini uygun bir cRPMI hacmine ve mililitre başına altı mikrogramlık bir konsantrasyona seyreltin.Ortamı 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Daha sonra, mililitre başına beş ila 6 milyon hücre elde etmek için önceden hazırlanmış bir hücre süspansiyonunu bire bir oranda seyreltmek için bu ortamı kullanın. Daha sonra, 12 kuyucuklu bir doku kültürü plakasına, deneysel durum başına kuyu başına bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.Indo-1 boya yüklü hücrelere EGTA ekleyerek kalsiyumsuz Indo-1 için tek bir lekeli kontrol örneği hazırlayın. Florofor veya Hint-1 boyası olmadan biyolojik negatif kontrol için bir kuyu hazırlayın. Akış sitometresindeki boya yüklü hücre süspansiyonuna 50 mikromol konsantrasyonunda iyonomisin ekleyerek bir Hint-1 pozitif kontrol hazırlayın.Ayrıca, antikor konjuge floroforlar kullanarak ek hücre popülasyonları için tek leke kontrolleri için bir kuyu hazırlayın. Ardından, milyon hücre başına iki mikrogram FC reseptörü bloke edici antikor ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için her 15 dakikada bir dokunarak plakayı 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüm hücre hacmini plakadan karıştırın ve çıkarın ve 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine ekleyin.Süpernatanı santrifüj edin ve boşaltın. Hücreler bir mililitre önceden ısıtılmış cRPMI ile yıkandıktan sonra, pelet tekrar ve süpernatanı boşaltın. Hücreleri bir mililitre cRPMI'de yeniden askıya alın ve her tüpü inkübe edin, tüpün üstünü gaz değişimi için hafifçe açık bırakarak hücre içi esterlerinin tamamen deesterifikasyonuna izin verin.Daha sonra, kullanıcı tanımlı tüm florokrom konjuge antikorların ana karışımını hazırlayın ve hücre hacminin bir mililitresi için kalan hücrelere ekleyin. Dinlendikten sonra, hücreleri pelet edin ve dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş bir mililitre cRPMI'de yeniden askıya alarak peleti yıkayın. Bu adımı tekrarlayın ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin.Kapaklı beş mililitrelik polistiren akış tüpü kullanarak 500 mikrolitre fenol kırmızısız cRPMI'de bireysel numuneleri yeniden askıya alın. Kalsiyum akısı analizini kullanarak sıcaklığı korumak için, küçük bir su banyosuna banyo boncukları ekleyerek bir boncuk banyosu hazırlayın ve 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. 50 mililitrelik bir kronikleşme tüpünü dikkatlice ikiye bölün ve tüpün üstünü atın.Kalan tüpün dörtte üçünü banyo boncuklarıyla doldurun ve boncuk banyosunda 37 santigrat dereceye ulaşmasına izin verin. Boncuk banyosunu, tüpü konumlandırmak için bir strafor rafla birlikte bir akış sitometresinin yanına yerleştirin. Akış sitometresindeki analizden önce, tüpleri yedi dakika boyunca ayrı ayrı 37 santigrat dereceye ısıtın.Akış sitometresi yazılımına giriş yapın ve Kütüphane sekmesine tıklayın. Ardından, kalsiyuma bağlı Hint-1 ve kalsiyumsuz Hint-1 eklemek için floresan etiketleri seçin. Ardından floresan etiket grupları altında UV lazeri seçin ve floresan etiket adı eklemek için ekle'ye tıklayın.Lazer uyarma ve emisyon dalga boyunu seçin ve ardından Kaydet'e tıklayın. Deneme kurulumuna devam edin. Edinme sekmesine tıklayın, Yeni bir deneme açın/oluşturun ve istediğiniz floresan etiketlerini denemeye ekleyin.Deneme için bir başvuru grubu ve yeni bir örnek grup oluşturun ve her iki grubu da etiketleyin. Almalar sekmesi altında, olayları 10 milyonda en fazla 10 milyona, durdurma ses düzeyini en fazla 3000 mikrolitre hacme ve durma süresini en fazla 36.000 saniyeye kaydedecek şekilde ayarlayın. Çok renkli panelde bulunan kullanıcı tanımlı konjuge antikorlar ve Indo-1 fonksiyonel boya için tek lekeli kontroller elde edin.Kalsiyuma bağlı Hint-1 pozitif kontrol ve vortekse 50 mikromol iyonomisin ekleyin. Akış tüpünü numune enjeksiyon panosuna ekleyin ve Kaydet'e tıklayın. Ardından akış sitometresine kalsiyumsuz Indo-1 negatif kontrolü ekleyin ve Kaydet'e tıklayın.Tek lekeli kontrollerin karışımını Karıştır düğmesine tıklayarak çıkarın. Karıştırmayı kaldırma işlemi tamamlandıktan sonra, karıştırılmamış çalışma sayfasını kullanarak örnekteki kalıntıları kaldırmak için SSC-A ve SSC-A ile SSC-H gibi sıralı grafikler oluşturun. Ardından Arsa'ya tıklayarak kapılar oluşturun.Çalışma sayfasına bir grafik ekleyin ve aşağı akış kapılı bir popülasyon oluşturmak için kapının içine çift tıklayın. İlgilenilen tüm popülasyonlar hesaba katılana kadar devam edin. Daha sonra, sıralı analiz için önceden hazırlanmış tek lekeli kontrol numunelerini 37 santigrat dereceye ısıtın.Akış sitometri yazılımını kurun ve akış sitometresinin akışkan stabilitesini sağlamak için DI'yi buzlu suda iki ila üç dakika çalıştırın. İlgilenilen popülasyonu dahil etmek için çokgen dikdörtgenini veya elips kapısı düğmelerini kullanarak kapılar oluşturarak karıştırılmamış çalışma sayfasında sıralı grafikler ayarlayın. Kapının içine çift tıklayın ve y ve x ekseni parametrelerini SSC-A ve SSC-H olarak değiştirin.Eksene sol tıklayarak eksen parametrelerini tanımlamayı tamamlayın. SSC-A ve canlılık boya sinyali ile bir grafik oluşturun. Amin boyası boyaması için negatif olan canlı hücreleri açın.Canlı ölü boyama için negatif olan canlı hücreler hem y hem de x ekseninde sıfır işaretinde kümelenecektir. Sadece tek hücreli canlı lenfositleri içeren yeni bir arsa oluşturmak için iç grafiğe çift tıklayın. Kalsiyum akışının görselleştirilmesi için Y eksenini X eksenindeki zamana karşı Hint-1 olarak değiştirin.Daha sonra ısıtılmış biyolojik numuneyi makinenin SIT içine yerleştirin. Sınırlı sayıda hücre popülasyonunda kalsiyum akışını görselleştirmek için örnekleri orta akış hızında saniyede 2.500 ila 3000 olayda çalıştırın. Bir sonraki tüpü satın alma kontrolünde boncuk banyosuna ekleyin.Numunede bazal düzeyde kalsiyum sinyallemesi elde etmek üzere ilk verileri 30 saniye boyunca kaydetmek için Kaydet'e basın. Ardından Durdur'a tıklayın ve tüpü numune enjeksiyon portundan çıkarın. Kalsiyum akışını başlatmak için 30 mikrogram konjuge edilmemiş anti-CD3'ü doğrudan numune tüpüne ekleyin.Tüpü hızlı bir şekilde numune enjeksiyon portuna geri yerleştirin ve yazılımda Kaydet'e basın. Yazılımdaki edinme kontrolleri altında geçen süreyi izleyerek yedi dakika boyunca verileri kaydedin. Ardından yazılımda Durdur'a basın.Mililitre iyonomisin başına bir mikrogram ekleyin ve ilgili hücrelerde maksimum kalsiyum sinyalini elde etmek için 30 saniye boyunca kaydedin. Sonraki örneğe geçin ve tüm örnekler toplanana kadar iş akışını yineleyin. Denemeyi kaydedin ve dışa aktarma zip dosyasına tıklayın.Karıştırılmamış dosyalar harici akış sitometri analiz yazılımına yüklenir. Yan saçılmaya karşı bir zaman grafiğindeki kararlı tutarlı bir sinyal, akışkan stabiliteyi gösterdi. Lenfosit popülasyonu kapılıydı ve bunu takiben, yan saçılma yüksekliği ile alan arasındaki bir arsa üzerinde singletlerin ayırt edilmesi izledi.Singlet'lar uygulanabilirlik açısından değerlendirildi. Daha sonra CD19-negatif popülasyonda geçit uygulandı. Bu T-hücresi alt kümeleri, kalsiyuma bağlı Hint-1 floresansını zamana karşı görselleştirerek CD4 ve CD8'e karşı antikorlar kullanılarak değerlendirildi.Bireysel hücre popülasyonlarında, kalsiyuma bağlı Hint-1'in zamana karşı grafiği, stimülasyondan önce bir taban çizgisi gösterdi. Hücre içi kalsiyum seviyeleri azaldıkça pik yanıt ve iyonomisin eklenerek kalsiyum yanıtı ortaya çıktı. Anti-CD3 antikor ilavesinden önce, zayıf bir kalsiyuma bağlı Indo-1 sinyali tespit edildi.Tepe tepkisi sırasında, hücreler güçlü bir kalsiyuma bağlı Hint-1 sinyali gösterdi ve kalsiyumsuz Hint-1'i azalttı. Zirveden beş dakika sonra, Hint-1 floresansı neredeyse taban çizgisine geri döndü. İyonomisin ilavesinden sonra, hücrelerin yeterli boya yüklemesini gösteren sağlam bir kalsiyum bağlı Hint-1 sinyali görselleştirildi.Nadir popülasyonların analizi, ilgilenilen her popülasyona geçit verdikten sonra kalsiyuma bağlı Hint-1'e karşı kalsiyumsuz Hint-1'i çizerek gerçekleştirildi. Ve her bir alt küme için tüm zaman boyunca kalsiyum tepkisini analiz etmek. Tam spektrum profillemesi kullanan kalsiyum akısı, çeşitli immün alt kümelerde yüksek parametreli akış sitometrik analizine yol açabilir.T-hücresi alt kümelerinin tarafsız kümelenmesi için yüksek boyutlu analiz, gelişmiş analiz için yüksek parametreli akış sitometrisi ile birlikte kullanılabilir. Bu teknik, toplu bir numunede birbirleriyle bağlantılı olarak çoklu bağışıklık alt kümelerinin analizi için geliştirilmiştir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...