Name: autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology
Uploaded: 2023-02-17T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology at JoVE.com

Denne forskning blev udført som led i projekterne TIN2015-68454-R og 20961/PI/18, finansieret af det spanske ministerium for økonomi og konkurrenceevne og Séneca Foundation i Murcia-regionen. Irene Hernández Martínez og Francisco Javier Ibáñez López fra sektionen for statistisk støtte på det videnskabelige område og forskningsområdet ved Murcia Universitet (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (figur 1 blev tegnet ved hjælp af billeder fra Servier Medical Art. Servier Medical Art af Servier er licenseret med en Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)

Algearten Chroothece mobilis blev anvendt til denne undersøgelse. Arten blev opnået fra Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29 kultursamling. En oversigt over protokollen er vist i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64533/64533fig01.jpg"> Figur 1: Oversigt over undersøgelsen. Chroothece mobilis inkuberes under ekstrem...

<ol>
	<li>Vis, M. L., Necchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , (2021).</li><li>Aboal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+Chroothece+(Rhodophyta,+Stylonematales)+including+two+new+species.">Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species.</a> European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).</li><li>Millach, L., Obiol, A., Sol&#233;, A., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+analyse+in+vivo+the+physiological+state+and+cell+viability+of+phototrophic+microorganisms+by+confocal+laser+scanning+microscopy+using+a+dual+laser.">A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser.</a> Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).</li><li>Millach, L., Villagrasa, E., Sol&#233;, A., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+confocal+laser+scanning+microscopy+techniques+for+a+rapid+assessment+of+the+effect+and+cell+viability+of+Scenedesmus+sp.+DE2009+under+metal+stress.">Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress.</a> Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).</li><li>Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phytoplankton+pigments+by+excitation+spectra+of+fluorescence.">Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence.</a> Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , (2000).</li><li>Beutler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorometric+method+for+the+differentiation+of+algal+populations+in+vivo+and+in+situ.">A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ.</a> Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).</li><li>Grigoryeva, N., Chistyakova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopic+spectroscopy+for+investigation+and+monitoring+of+biological+diversity+and+physiological+state+of+cyanobacterial+cultures.">Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures.</a> Cyanobacteria. , (2018).</li><li>Grigoryeva, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).</li><li>Rold&#225;n, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hern&#225;ndez-Marin&#233;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+pigment+identification+in+single+cells+from+living+phototrophic+biofilms+by+confocal+imaging+spectrofluorometry.">Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).</li><li>Hense, B. A., Gais, P., J&#252;tting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescence+information+for+automated+phytoplankton+investigation+by+image+analysis.">Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis.</a> Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).</li><li>Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+absorbance+and+fluorescence+spectra+to+discriminate+microalgae.">Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae.</a> European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).</li><li>Richardson, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+fluorometric+characterization+of+phytoplankton+community+composition+using+the+Algae+Online+Analyser.">Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser.</a> Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).</li><li>Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+induced+fluorescence+imaging:+application+to+groups+of+macroalgae+identification.">Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).</li><li>Coronado-Parra, T., Rold&#225;n, M., Aboal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+in+ecophysiological+studies+of+algae:+a+door+to+understanding+autofluorescence+in+red+algae.">Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae.</a> Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).</li><li>Mulec, J., Kosi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampenflora+algae+and+methods+of+growth+control.">Lampenflora algae and methods of growth control.</a> Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).</li><li>Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+relationships+of+nonaxenic+filamentous+cyanobacterial+strains+based+on+16S+rRNA+sequence+analysis.">Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis.</a> Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).</li><li>Rold&#225;n, M., Oliva, F., G&#243;nzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hern&#225;ndez-Marin&#233;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+green+light+influence+the+fluorescence+properties+and+structure+of+phototrophic+biofilms.">Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).</li><li>Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+marine+macroalgae+by+fluorescence+signatures.">Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures.</a> International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).</li><li>Rold&#225;n, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+fingerprints+of+endolithic+phototrophic+cyanobacteria+living+within+halite+rocks+in+the+atacama+desert.">Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).</li><li>Sol&#233;, A., Diestra, E., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+image+analysis+for+cyanobacterial+biomass+determined+at+microscale+level+in+different+microbial+mats.">Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats.</a> Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).</li><li>Ram&#237;rez, O., Garc&#237;a, A., Rojas, R., Couve, A., H&#228;rtel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+displacement+algorithm+determines+true+and+random+colocalization+in+fluorescence+microscopy.">Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).</li><li>Universität Gottingen-Georg-August. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAG+Culture+Collection+of+Algae.">SAG Culture Collection of Algae.</a> Universität Gottingen-Georg-August. , (2022).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+cell+counting+method+for+Neubauer+counting+chamber.">Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).</li><li>Wolf, E., Sch&#252;&#223;ler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobiliprotein+fluorescence+of+Nostoc+punctiforme+changes+during+the+life+cycle+and+chromatic+adaptation:+Characterization+by+spectral+confocal+laser+scanning+microscopy+and+spectral+unmixing.">Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing.</a> Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).</li><li>Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+confocal+microscopy+spectral+imaging+systems:+Use+of+multispectral+beads.">Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads.</a> Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).</li><li>Field, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovering Statistics Using R. , (2013).</li><li>Linnet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+paired+t-test+for+evaluation+of+method+comparison+data.">Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data.</a> Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).</li><li>Rosner, B., Grove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Mann-Whitney+U-test+for+clustered+data.">Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data.</a> Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).</li><li>Colin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+living+plant+cell:+from+probes+to+quantification.">Imaging the living plant cell: from probes to quantification.</a> The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).</li><li>Borlinghaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+white+confical:+continuous+spectral+tuning+in+excitation+and+emission.">The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission.</a> Optical Fluorescence Microscopy. , (2011).</li></ol>

Nogle encellede eller koloniale rødalger, såsom Chroothece, vokser langsomt in vitro, men indeholder flere autofluorescerende forbindelser, der kan analyseres ved spektralanalyse under et konfokalmikroskop, hvor forskelle i pigmentemissionstoppe kan detekteres. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi har gjort det muligt for os at gennemføre in vivo-undersøgelser for at evaluere tilpasningen eller akklimatiseringen af fotosyntetiske organismer 8,10,17,18,19,20.<...

Rødalger, såsom slægten Chroothece, kan vokse i ekstreme levesteder, hvor de ofte skal klare markante miljøændringer1. Oversvømmelser og tørke er hyppige i halvtørre områder, hvor denne slægt kan findes, og nogle arter er blevet rapporteret i åer, klipper, huler eller endda termiske farvande2. Men det meste af tiden henviser biologiske variabler, såsom konkurrence eller græsning, arter til ikke-optimale betingelser for deres vækst. Da disse organismer ofte er vanskelige at dyrke og enten ikke vokser eller vokser meget langsomt under laboratorieforhold, er en væsentlig begrænsning den tilgængelige prøvestørrelse. Derfor er det meget vigtigt at følge ikke-destruktive metoder eller metoder, der involverer minimal prøvemanipulation 3,4.
De fysiologiske færdigheder, der er nødvendige for at overleve i disse barske miljøer, kan overvåges ved at følge ændringer i deres fotosyntetiske systemer. Metaboliske mekanismer, fotosyntetisk effektivitet og følsomhed over for lys- eller kulturbetingelser kan afsløres ved pigmentfluorescensemissionsprofiler på grund af nøjagtige ændringer i deres energioverførsel eller fangst 5,6,7,8.
Autofluorescens af cellulære forbindelser kan anvendes som markør for cytodiagnose eller som en naturlig indikator for cellulær tilstand eller metabolisme som reaktion på eksterne og interne signaler gennem ændringer i emission9. Det kan også bruges til at skelne taksonomisk forskellige grupper af fotosyntetiske organismer10. Afhængigt af den fylogenetiske position af fototrofe mikroorganismer kan man finde forskellige in vivo fluorescensegenskaber. Derfor er en taksonomisk identifikation baseret på in vivo-karakteristika for fototrofisk fluorescens (herunder fluorescensabsorption og emissionsspektre) blevet forsøgt ved flere lejligheder11,12. På grund af mangfoldigheden i tilbehørspigmenter blandt fytoplanktontaxa kan forskelle i bølgelængderne, ved hvilke klorofyl a (Chl a) fluorescens stimuleres, eller forskelle i emissionsspektre anvendes til at udlede taksonomi13. In vivo fluorescensexcitations- og emissionsspektrene for disse prøver er ikke kun afhængige af algernes phyla, men også af fotosystemtilpasning14. Effektiviteten af energioverførsel til Chl a eller forholdet mellem Chl a og tilbehørspigmenter og det cellulære pigmentindhold er følsomme over for vækstbetingelser5.
Rødalger, især Chroothece, har flere tilbehør fluorescerende pigmenter-phycobiliproteiner og carotenoider; Det førstnævnte koncentrat i phycobilisomer bundet til thylakoiderne af kloroplaster. Phycobiliproteiner (phycocyanin, phycoerythrin, og allophycocyanin) kan fange lys ved forskellige bølgelængder og overføre det til Chl a, hvilket gør fotosyntese i meget forskellige lys- og kulturforhold mulig15. For eksempel kan Chroothece-arter vokse inde i huler eller næsten dukke op i let saltholdige kalkholdige vandløb2.
Monokromatiske lys påvirker væksten og pigmentsammensætningen af fotosyntetiske organismer og er blevet undersøgt for at forhindre eller kontrollere væksten af fotosyntetiske organismer i huler. Mulec et al. viste, at rød beriget belysning fremmer væksten af cyanobakterier, alger og planter16. Tidligere undersøgelser har også rapporteret, at grønt lys påvirker pigmentsammensætningen af cyanobakterier17, mens andre har afsløret, at grønt lys forhindrer væksten af de fleste fotosyntetiske organismer, og nogle cyanobakterier udviser en reduktion i thylakoider og svagere gennemsnitlig fluorescensintensitet18.
For at forstå Chrootheces evne som modelorganisme til at overvinde barske forhold er dyrkede celler blevet udsat for stigende lysintensiteter og monokromatisk lys (grønt eller rødt)15 for at se, hvordan det håndterer de svage forhold i huler (hvor rødt lys dominerer). Protokollen præsenteret heri reproducerer effekten af ovennævnte variabler på Chroothece's phycobiliproteiner på celleniveau ved hjælp af sin egen autofluorescens.
I dag bruges fluorescens almindeligvis som et værktøj til at studere de fysiologiske reaktioner hos vaskulære planter, mikroalger, makroalger og cyanobakterier13,14,16. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi er et fremragende værktøj til in vivo-undersøgelser til evaluering af fotosyntetiske prøvers fysiologi på enkeltcelleniveau 10,17,18,19,20 ved at undgå problemer forbundet med den lave væksthastighed i laboratoriet og vanskelighederne med at opnå tilstrækkelig biomasse til de tilknyttede ekstraktions- og biokemiske metoder 8 . Når cellerne er behandlet under forskellige dyrkningsbetingelser i 2 uger, kan lambdascanningsprofilen måles in vivo. Selv om der er flere publikationer, hvor forskellige bølgelængder af excitation ved konfokal billeddannelse er blevet anvendt 3,4,10,17, kan de fleste phycobiliproteiner og Chl a detekteres ved hjælp af en 561 nm bølgelængde excitationslinje, og den detekterede emission varierer fra 570 til 760 nm bølgelængde. Disse kriterier er baseret på en analyse, der tidligere er udført 10 med kommercielle rene pigmenter (tabel 1) ved konfokal billeddannelse og de opnåede resultater i forskellige algeart20,21,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Pigmenter</td>
			<td rowspan="2">λflmax (nm)</td>
			<td colspan="8">λ exc (nm)</td>
		</tr><tr><td>351</td>
			<td>364</td>
			<td>458</td>
			<td>476</td>
			<td>488</td>
			<td>514</td>
			<td>543</td>
			<td>633</td>
		</tr><tr><td>Chl a</td>
			<td>660.9-678.1</td>
			<td>43,4 ± 1,8</td>
			<td>11,2 ± 0,2</td>
			<td>1.8 ± 0.05</td>
			<td>2,0 ± 0,08</td>
			<td>12,2 ± 0,7</td>
			<td>6,0 ± 0,3</td>
			<td>4.2 ± 0.16</td>
			<td>80,7 ± 1,5</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">R-PE</td>
			<td>569.2-583.3</td>
			<td>5.9 ± 0.6</td>
			<td>5.9 ± 0.16</td>
			<td>11,1 ± 0,04</td>
			<td>42,2 ± 0,3</td>
			<td>100,0 ± 0</td>
			<td>90,0 ± 0,3</td>
			<td>99,2 ± 0,08</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>652.1-668.6</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1,5 ± 0,01</td>
			<td>3.7 ± 0.04</td>
			<td>26,7 ± 0,5</td>
			<td>8,7 ± 0,16</td>
			<td>11.1 ± 0.16</td>
			<td>11.3 ± 0.2</td>
		</tr><tr><td>C-PC</td>
			<td>636.2-676.4</td>
			<td>2.3 ± 0.04</td>
			<td>1,0 ± 0,01</td>
			<td>0,6 ± 0,004</td>
			<td>0.7 ± 0.008</td>
			<td>2,0 ± 0,08</td>
			<td>2,0 ± 0,04</td>
			<td>3.3 ± 0.16</td>
			<td>33,6 ± 0,9</td>
		</tr><tr><td>APC-XL</td>
			<td>667.3-683.8</td>
			<td>15.1 ± 1.5</td>
			<td>9,6 ± 0,98</td>
			<td>1,0 ± 0,04</td>
			<td>1.2 ± 0.08</td>
			<td>5.9 ± 0.7</td>
			<td>4.1 ± 0.5</td>
			<td>23.2 ± 3.5</td>
			<td>91,4 ± 2,3</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: De rene pigmentoplysninger, der bruges til at køre lambdascanningsanalysen. Denne tabel viser emissionstoppe og skuldre/fluorescensbåndmaksima for forskellige fluorkromer/pigmenter ved konfokal billedspektrofotometri for alle excitationsbølgelængder og procentdelen af lysemission fra pigmenter/fluorkromer. Værdierne blev beregnet ved hjælp af formlen: = MFI*100/255. Hver værdi er middelværdien ± SE (middelværdi ± standardfejl fra middelværdien). Rene pigmenter blev anvendt til kalibrering af det konfokale scanningslasermikroskop som følger: 1,2,10. Klorofyl a blev opnået fra Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) fra Porphyra tenera og C-phycocyanin (C-PE) fra Spirulina sp. Alle arterne blev opløst i filtreret destilleret vand. Allophycocyanin-XL (APC-XL) blev opnået fra Mastigocladus laminosus, som blev opløst i ammoniumsulfat (60%) og kaliumphosphat (pH = 7) for at opnå en koncentration på 38 mM. Scanningerne blev udført med 400 μL af hver pigmentopløsning (koncentration på 1 mg/ml) ved hjælp af et 8-brønds dækket glasbundkammer.
Undersøgelsen af en enkelt excitationsbølgelængde er en ganske nyttig første tilnærmelse. I dette tilfælde er det imidlertid nødvendigt at belyse det relative bidrag fra de forskellige komplekser i fluorescenssignalet, hvilket anbefales at udføre et fluorescensforhold eller spektrumanalyse ved flere bølgelængder blandt andre metoder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>81158</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 black well plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>82406</td>
			<td>&#160;flat and clear bottom for high throughput microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algae Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15380591</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>506353</td>
			<td>Glycerol immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software. LAS X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>FL40SSENW/37MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum photoradiometer</td>
			<td>DeltaOhm&#160;</td>
			<td>DO 9721</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>R Core Team, 2020</td>
			<td>4.0.2.</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SWES medium</td>
			<td>University of Murcia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type G Immersion liquid</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11513910</td>
			<td>Glycerol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology

Rødalger (Rhodophyta) indeholder phycobiliproteiner og koloniserer levesteder med svagt lys, men nogle (f.eks. Nogle Chroothece-arter ) kan også udvikle sig i fuld solskin. De fleste rhodophytes er røde, men nogle kan forekomme blålige, afhængigt af andelen af blå og røde biliproteiner (phycocyanin og phycoerythrin). Forskellige phycobiliproteiner kan fange lys ved forskellige bølgelængder og overføre det til klorofyl a, hvilket gør fotosyntese under meget forskellige lysforhold mulige. Disse pigmenter reagerer på habitatændringer i lys, og deres autofluorescens kan hjælpe med at studere biologiske processer. Ved hjælp af Chroothece mobilis som modelorganisme og spektral lambdascanningstilstand i et konfokalmikroskop blev tilpasningen af fotosyntetiske pigmenter til forskellige monokromatiske lys undersøgt på celleniveau for at gætte artens optimale vækstbetingelser. Resultaterne viste, at selv når den undersøgte stamme blev isoleret fra en hule, tilpassede den sig både svage og mellemstore lysintensiteter. Den præsenterede metode er især nyttig til at studere fotosyntetiske organismer, der ikke vokser eller vokser meget langsomt under laboratorieforhold, hvilket normalt er tilfældet for dem, der lever i ekstreme levesteder.

Klorofyl a absorberer generelt blå og røde bølgelængder af synligt lys, mens phycobiliproteiner bruger grønne, gule og orange bølgelængder7. Autofluorescensen af disse pigmenter gør den første tilgang til at studere phycobiliproteiner og klorofyladfærd under eksperimentelle og feltbetingelser mulig.
Ved at sammenligne de opnåede data og plotte på forskellige grafer kan der skelnes mellem signifikante ændringer i gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology at JoVE.com

Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology

Denne protokol beskriver trin-for-trin autofluorescensbilleddannelse og evaluering af fykobiliproteinændringer i rødalger baseret på spektralanalyse. Dette er en etiketfri og ikke-destruktiv metode til evaluering af cellulær tilpasning til ekstreme levesteder, når kun knappe materialer er tilgængelige, og celler vokser langsomt eller slet ikke under laboratorieforhold.

Autofluorescensbilleddannelse til evaluering af rødalgerfysiologi

Red algae (Rhodophyta) contain phycobiliproteins and colonize habitats with dim light, however some (e.g., some Chroothece species) can also develop in ...

Denne konfokale mikroskopiske protokol vil muliggøre fortolkning af den økologiske adfærd og tilpasninger af mikroalger fra ekstreme miljøer med langsom vækst i laboratoriet ved hjælp af autofluorescens af deres pigmenter. Denne teknik er ikke invasiv og minimerer artefakter, da kemiske forbindelser ikke anvendes. Kendskab til ydeevnen af pigmenter af autotrofer og tilsvarende vækst vil gøre det muligt at designe de kontrolmetoder, der er den største interesse for turisthuler og arkitektoniske monumenter.Begynd at forberede inokulum af Chroothece mobilis ved at overføre det fra agarkulturen til havvandsmediet eller SWES flydende medium. Oprethold alle kulturer i to uger med en 16 til 8 lys mørk fotoperiode ved 20 grader Celsius under lav hvid lysintensitet og uden at ryste, indtil den ønskede celletæthed er opnået. Brug en milliliter af den eksponentielle fasekultur med fem gange 10 til de tredje celler pr. milliliter celletæthed til at inokulere i en 24-brøndplade til forskellige eksperimenter.For at gengive den monokromatiske lyseffekt skal du bruge det grønne filter, der tillader grønt lys at passere igennem fra 470 til 570 nanometer med en top ved 506 nanometer bølgelængde og til rødt lys justeret ved hjælp af et filter mellem 590 og 720 nanometer og toppe ved 678 nanometer. Udsæt cellekulturerne for dette lys i to uger. Tænd for alle komponenterne i det inverterede konfokale laserscanningsmikroskop inklusive laseren.Monter cellerne i SWES-vækstmediet fra hver eksperimentel brønd i 24-brøndpladen til en 35 millimeter glasbundskål til billeddannelse. Vælg 63X eller 1.30 numerisk blænde eller NA glycerol nedsænkningsmål, og placer glycerol over linsen. Placer derefter brøndpladen på mikroskoptrinnet, så prøven ikke bevæger sig under billedoptagelse.Centrer prøven i lysbanen og fokuser på midten af cellen ved at vælge planet med den højeste fluorescensintensitet. Når du er færdig, skal du åbne billedoptagelsessoftwaren og vælge XY lambda fra rullelisten i erhvervelsestilstand. Vælg excitationslinjen for laseren 561 nanometer, otte bit dynamisk rækkevidde og 1024 x 1024 pixels.Saml fluorescensemissionsspektrene i 10 nanometer båndbredde og lambda-trinstørrelsen på fire nanometer inden for 570 til 760 nanometerområdet. Sæt pinhole på en luftenhed og kør lambda scan erhvervelse. Når du har gentaget denne proces i forskellige synsfelter og under de forskellige betingelser for røde og grønne lys, skal du gemme alle data.Når lambdascanningen er erhvervet, skal du klikke på kvantificeringsvinduet øverst i softwaren for at evaluere de indsamlede fluorescensemissionsspektre. Gå til det åbne projektvindue, og vælg en XY lambda-fil. Vælg stablet profilanalyse i billedbehandlingssoftwaren, og definer et interesseområde på fire mikrometer kvadrat i midten af en celle for at analysere den gennemsnitlige fluorescensintensitet.Eksporter dataene og CSV, før du gentager processen med forskellige celler under forskellige forhold. Åbn derefter CSV-filerne for at vælge de forskellige fluorescensemissionstoppe for alle de målte interesseområder ved at vælge de maksimale fluorescensdata for henholdsvis phycoerythrin phycocyanobilin, C.phycocyanin, allophycocyanin og chlorophyll A i CSV-filen. Når du er færdig, skal du oprette en ny tabel med alle de maksimale fluorescensværdier opnået fra hver phycobiliprotein og chlorophyll peak og plotte dataene på en graf.Der blev observeret signifikante forskelle i gennemsnitlig fluorescensintensitet. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af phycoerythrin phycocyanobilin faldt signifikant, når cellerne blev udsat for monokromatisk grønt lys. I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen forskel i rødt lys sammenlignet med kontrollen.Det grønne lys havde den modsatte effekt på allophycocyanin og klorofyl A, hvor den gennemsnitlige fluorescensintensitet steg signifikant på grund af tilpasningen af antennekomplekser på grund af øget mængde eller forbedret tilslutning af antennekomplekserne blandt andre. Det røde lys producerede en ikke-signifikant stigning i allophycocyanin og klorofylfluorescens. For at undersøge effekten af forskellige vækstbetingelser på celler i kultur er det afgørende at udføre målingerne med præcis de samme mikroskopindstillinger.Det er muligt at analysere andre miljøparametre, der er relevante for kulturen af autofluorescensorganismer, såvel som fluorescenssignalet inden for det synlige spektrum. Denne teknik er en meget kraftfuld tilgang til en undersøgelse af livsorganismer med flere autofluorescenspigmenter.

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserede Måling af Store betjente Calcium indtastning i levende celler: fra kulturperler kræftcellen til at Skeletmuskel Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Giant liposomfremstilling for billedbehandling og Patch-Clamp Elektrofysiologi

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In vitro Rekonstituering af lys-høst komplekser af planter og grønne alger

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Fysiologi Lab Demonstration: glomerulær filtrationshastighed Rate i en rotte

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Intracavernosal Pressure Recording to Evaluate Erectile Function in Rodents

Intracavernosal pres optagelse til at evaluere erektil funktion hos gnavere

Erectile dysfunction (ED) is defined as the inability to attain or keep an erection of the penis, and this has become a prevalent male sexual disorder. ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Kvantificering af Lipid overflod og evaluering af Lipid Distribution i Caenorhabditis elegans af Nilen rød og olie røde O farvning

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Etablering af en klonal kultur af encellede de tråddannende alger

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolering af retinale arterioler for Ex Vivo celle fysiologi undersøgelser

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...