Name: autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology
Uploaded: 2023-02-17T13:25:00
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Diese Forschung wurde im Rahmen der Projekte TIN2015-68454-R und 20961/PI/18 durchgeführt, die vom spanischen Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit und der Séneca-Stiftung der Region Murcia finanziert wurden. Irene Hernández Martínez und Francisco Javier Ibáñez López von der Abteilung für statistische Unterstützung des Wissenschafts- und Forschungsbereichs der Universität Murcia (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (Abbildung 1 wurden unter Verwendung von Bildern von Servier Medical Art gezeichnet. Servier Medical Art von Servier ist lizenziert mit einer Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)

Für die vorliegende Studie wurde die Algenart Chroothece mobilis verwendet. Die Art stammt aus der Mikroalgen-Edaphic SE Spanien, MAESE 20.29 Kultursammlung. Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64533/64533fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über die Studie. Chroothece ...

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Einige einzellige oder koloniale Rotalgen, wie z. B. Chroothece, wachsen in vitro langsam, enthalten jedoch mehrere autofluoreszierende Verbindungen, die durch Spektralanalyse unter einem konfokalen Mikroskop analysiert werden können, wo Unterschiede in den Pigmentemissionsspitzen festgestellt werden können. Die spektrale konfokale Fluoreszenzmikroskopie hat es uns ermöglicht, In-vivo-Studien durchzuführen, um die Anpassung oder Akklimatisierung von photosynthetischen Organismen 8,10,17,18,...

Rotalgen, wie die Gattung Chroothece, können in extremen Lebensräumen wachsen, wo sie häufig mit starken Umweltveränderungen zurechtkommen1. Überschwemmungen und Dürren sind in halbtrockenen Regionen, in denen diese Gattung vorkommt, häufig, und einige Arten wurden in Bächen, Klippen, Höhlen oder sogar Thermalwasser gemeldet2. In den meisten Fällen werden Arten jedoch aufgrund biologischer Variablen wie Konkurrenz oder Beweidung in nicht optimale Wachstumsbedingungen verbannt. Da diese Organismen oft schwer zu kultivieren sind und unter Laborbedingungen entweder nicht oder nur sehr langsam wachsen, ist eine wesentliche Einschränkung die verfügbare Stichprobengröße. Daher ist es sehr wichtig, zerstörungsfreie Methoden oder Methoden zu befolgen, die eine minimale Probenmanipulation erfordern 3,4.
Die physiologischen Fähigkeiten, die zum Überleben in diesen rauen Umgebungen erforderlich sind, können überwacht werden, indem Veränderungen in ihren photosynthetischen Systemen verfolgt werden. Stoffwechselmechanismen, photosynthetische Effizienz und Empfindlichkeit gegenüber Licht oder Kulturbedingungen können durch Pigmentfluoreszenz-Emissionsprofile aufgrund genauer Änderungen ihrer Energieübertragung oder ihres Einfangensaufgedeckt werden 5,6,7,8.
Die Autofluoreszenz zellulärer Verbindungen kann als Marker für die Zytodiagnostik oder als natürlicher Indikator für den zellulären Zustand oder den Metabolismus als Reaktion auf äußere und innere Signale durch Änderungen der Emissionverwendet werden 9. Es kann auch verwendet werden, um taxonomisch verschiedene Gruppen von photosynthetischen Organismen zu unterscheiden10. Abhängig von der phylogenetischen Position phototropher Mikroorganismen kann man unterschiedliche In-vivo-Fluoreszenzmerkmale finden. Daher wurde mehrfach versucht, eine taxonomische Identifizierung auf der Grundlage der in vivo Eigenschaften der phototrophen Fluoreszenz (einschließlich Fluoreszenzabsorptions- und Emissionsspektren) durchzuführen11,12. Aufgrund der Vielfalt der akzessorischen Pigmente unter den Phytoplankton-Taxa können Unterschiede in den Wellenlängen, bei denen die Chlorophyll a (Chl a)-Fluoreszenz stimuliert wird, oder Unterschiede in den Emissionsspektren verwendet werden, um auf die Taxonomie13 zu schließen. Die in vivo Fluoreszenzanregungs- und Emissionsspektren dieser Proben beruhen nicht nur auf dem Stamm der Algen, sondern auch auf der Anpassung des Photosystems14. Die Effizienz der Energieübertragung auf Chl a oder das Verhältnis von Chl a zu akzessorischen Pigmenten und der zelluläre Pigmentgehalt sind empfindlich gegenüber Wachstumsbedingungen5.
Rotalgen, insbesondere Chroothece, haben mehrere akzessorische fluoreszierende Pigmente - Phycobiliproteine und Carotinoide; Ersteres Konzentrat in Phycobilisomen, die an die Thylakoide von Chloroplasten gebunden sind. Phycobiliproteine (Phycocyanin, Phycoerythrin und Allophycocyanin) können Licht unterschiedlicher Wellenlängen einfangen und an Chl a weiterleiten, was die Photosynthese unter sehr unterschiedlichen Licht- und Kulturbedingungen ermöglicht15. Zum Beispiel können Chroothece-Arten in Höhlen wachsen oder fast in leicht salzhaltigen kalkhaltigen Bächen auftauchen2.
Monochromatisches Licht beeinflusst das Wachstum und die Pigmentzusammensetzung von photosynthetischen Organismen und wurde untersucht, um das Wachstum von photosynthetischen Organismen in Höhlen zu verhindern oder zu kontrollieren. Mulec et al. zeigten, dass rot angereichertes Licht das Wachstum von Cyanobakterien, Algen und Pflanzen fördert16. Frühere Studien haben auch berichtet, dass grünes Licht die Pigmentzusammensetzung von Cyanobakterien beeinflusst17, während andere gezeigt haben, dass grünes Licht das Wachstum der meisten photosynthetischen Organismen verhindert und einige Cyanobakterien eine Verringerung der Thylakoide und eine schwächere mittlere Fluoreszenzintensität aufweisen18.
Um die Fähigkeit von Chroothece als Modellorganismus zu verstehen, raue Bedingungen zu überwinden, wurden kultivierte Zellen zunehmenden Lichtintensitäten und monochromatischem Licht (grün oder rot) ausgesetzt15, um zu sehen, wie sie mit den dunklen Bedingungen von Höhlen (wo rotes Licht vorherrscht) zurechtkommen. Das hierin vorgestellte Protokoll reproduziert die Wirkung der oben genannten Variablen auf die Phycobiliproteine von Chroothece auf zellulärer Ebene unter Verwendung seiner eigenen Autofluoreszenz.
Heutzutage wird die Fluoreszenz häufig als Werkzeug verwendet, um die physiologischen Reaktionen von Gefäßpflanzen, Mikroalgen, Makroalgen und Cyanobakterien zu untersuchen13,14,16. Die spektrale konfokale Fluoreszenzmikroskopie ist ein hervorragendes Werkzeug für In-vivo-Studien zur Bewertung der Physiologie photosynthetischer Proben auf Einzelzellebene 10,17,18,19,20, indem Probleme im Zusammenhang mit der geringen Wachstumsrate im Labor und den Schwierigkeiten bei der Gewinnung von genügend Biomasse für die damit verbundenen Extraktions- und biochemischen Methoden vermiedenwerden 8 . Sobald die Zellen 2 Wochen lang unter verschiedenen Kulturbedingungen behandelt wurden, kann das Lambda-Scan-Profil in vivo gemessen werden. Obwohl es mehrere Veröffentlichungen gibt, in denen verschiedene Wellenlängen der Anregung durch konfokale Bildgebung verwendet wurden 3,4,10,17, können die meisten Phycobiliproteine und Chl a unter Verwendung einer Anregungslinie mit einer Wellenlänge von 561 nm nachgewiesen werden, und die detektierte Emission reicht von 570 bis 760 nm Wellenlänge. Diese Kriterien basieren auf einer zuvor durchgeführten Analyse 10 mit handelsüblichen reinen Pigmenten (Tabelle 1) durch konfokale Bildgebung und den erhaltenen Ergebnissen in verschiedenen Algenarten20,21,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Pigmente</td>
			<td rowspan="2">λflmax (nm)</td>
			<td colspan="8">λ EXC (nm)</td>
		</tr><tr><td>351</td>
			<td>364</td>
			<td>458</td>
			<td>476</td>
			<td>488</td>
			<td>514</td>
			<td>543</td>
			<td>633</td>
		</tr><tr><td>Chl a</td>
			<td>660.9-678.1</td>
			<td>43,4 ± 1,8</td>
			<td>11,2 ± 0,2</td>
			<td>1,8 ± 0,05</td>
			<td>2,0 ± 0,08</td>
			<td>12,2 ± 0,7</td>
			<td>6,0 ± 0,3</td>
			<td>4,2 ± 0,16</td>
			<td>80,7 ± 1,5</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">R-PE</td>
			<td>569.2-583.3</td>
			<td>5,9 ± 0,6</td>
			<td>5,9 ± 0,16</td>
			<td>11,1 ± 0,04</td>
			<td>42,2 ± 0,3</td>
			<td>100.0 ± 0</td>
			<td>90,0 ± 0,3</td>
			<td>99,2 ± 0,08</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>652.1-668.6</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1,5 ± 0,01</td>
			<td>3,7 ± 0,04</td>
			<td>26,7 ± 0,5</td>
			<td>8,7 ± 0,16</td>
			<td>11,1 ± 0,16</td>
			<td>11,3 ± 0,2</td>
		</tr><tr><td>C-PC</td>
			<td>636.2-676.4</td>
			<td>2,3 ± 0,04</td>
			<td>1,0 ± 0,01</td>
			<td>0,6 ± 0,004</td>
			<td>0,7 ± 0,008</td>
			<td>2,0 ± 0,08</td>
			<td>2,0 ± 0,04</td>
			<td>3,3 ± 0,16</td>
			<td>33,6 ± 0,9</td>
		</tr><tr><td>APC-XL</td>
			<td>667.3-683.8</td>
			<td>15,1 ± 1,5</td>
			<td>9,6 ± 0,98</td>
			<td>1,0 ± 0,04</td>
			<td>1,2 ± 0,08</td>
			<td>5,9 ± 0,7</td>
			<td>4,1 ± 0,5</td>
			<td>23,2 ± 3,5</td>
			<td>91,4 ± 2,3</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Die reinen Pigmentinformationen, die zur Durchführung der Lambda-Scan-Analyse verwendet werden. Diese Tabelle zeigt die Emissionsspitzen und Schulter-/Fluoreszenzbandmaxima verschiedener Fluorochrome/Pigmente durch konfokale bildgebende Spektrophotometrie für alle Anregungswellenlängen sowie den prozentualen Anteil der Lichtemission durch Pigmente/Fluorochrome. Die Werte wurden nach folgender Formel berechnet: = MFI*100/255. Jeder Wert ist der Mittelwert ± SE (Mittelwert ± Standardfehler aus dem Mittelwert). Reine Pigmente wurden zur Kalibrierung des konfokalen Rasterlasermikroskops wie folgt verwendet: 1,2,10. Chlorophyll a wurde aus Spinacia oleracea, R-Phycoerythrin (R-PE) aus Porphyra tenera und C-Phycocyanin (C-PE) aus Spirulina sp. Alle Arten wurden in gefiltertem destilliertem Wasser gelöst. Allophycocyanin-XL (APC-XL) wurde aus Mastigocladus laminosus gewonnen, das in Ammoniumsulfat (60%) und Kaliumphosphat (pH = 7) gelöst wurde, um eine Konzentration von 38 mM zu erreichen. Die Scans wurden mit 400 μl jeder Pigmentlösung (Konzentration von 1 mg/ml) unter Verwendung einer mit 8 Vertiefungen abgedeckten Glasbodenkammer durchgeführt.
Die Untersuchung einer einzelnen Anregungswellenlänge ist eine recht nützliche erste Näherung. In diesem Fall ist es jedoch notwendig, den relativen Beitrag der verschiedenen Komplexe im Fluoreszenzsignal aufzuklären, was unter anderem empfohlen wird, um ein Fluoreszenzverhältnis oder eine Spektrumanalyse bei mehreren Wellenlängen durchzuführen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>81158</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 black well plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>82406</td>
			<td>&#160;flat and clear bottom for high throughput microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algae Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15380591</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>506353</td>
			<td>Glycerol immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software. LAS X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>FL40SSENW/37MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum photoradiometer</td>
			<td>DeltaOhm&#160;</td>
			<td>DO 9721</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>R Core Team, 2020</td>
			<td>4.0.2.</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SWES medium</td>
			<td>University of Murcia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type G Immersion liquid</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11513910</td>
			<td>Glycerol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology

Rotalgen (Rhodophyta) enthalten Phycobiliproteine und besiedeln Lebensräume mit schwachem Licht, einige (z. B. einige Chroothece-Arten ) können sich jedoch auch bei voller Sonneneinstrahlung entwickeln. Die meisten Rhodophyten sind rot, einige können jedoch bläulich erscheinen, abhängig vom Anteil an blauen und roten Biliproteinen (Phycocyanin und Phycoerythrin). Verschiedene Phycobiliproteine können Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen einfangen und an Chlorophyll a weiterleiten, was die Photosynthese unter sehr unterschiedlichen Lichtbedingungen ermöglicht. Diese Pigmente reagieren auf Veränderungen des Lebensraums im Licht, und ihre Autofluoreszenz kann helfen, biologische Prozesse zu untersuchen. Unter Verwendung von Chroothece mobilis als Modellorganismus und dem spektralen Lambda-Scan-Modus in einem konfokalen Mikroskop wurde die Anpassung photosynthetischer Pigmente an verschiedene monochromatische Lichter auf zellulärer Ebene untersucht, um die optimalen Wachstumsbedingungen der Spezies zu erraten. Die Ergebnisse zeigten, dass sich der untersuchte Stamm, selbst wenn er aus einer Höhle isoliert wurde, sowohl an schwache als auch an mittlere Lichtintensitäten anpasste. Die vorgestellte Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung von photosynthetischen Organismen, die unter Laborbedingungen nicht oder nur sehr langsam wachsen, was normalerweise bei Menschen der Fall ist, die in extremen Lebensräumen leben.

Chlorophyll a absorbiert im Allgemeinen blaue und rote Wellenlängen des sichtbaren Lichts, während Phycobiliproteine grüne, gelbe und orangefarbene Wellenlängen verwenden7. Die Autofluoreszenz dieser Pigmente ermöglicht den ersten Ansatz zur Untersuchung des Verhaltens von Phycobiliproteinen und Chlorophyll unter Versuchs- und Feldbedingungen.
Durch den Vergleich der erhaltenen Daten und die Darstellung in verschiedenen Diagrammen können signifikante Änderungen d...

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Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology

Das vorliegende Protokoll beschreibt die schrittweise Autofluoreszenz-Bildgebung und Bewertung von Phycobiliprotein-Veränderungen in Rotalgen auf der Grundlage einer Spektralanalyse. Dies ist eine markierungsfreie und zerstörungsfreie Methode, um die zelluläre Anpassung an extreme Lebensräume zu bewerten, wenn nur knappes Material verfügbar ist und Zellen unter Laborbedingungen langsam oder gar nicht wachsen.

Autofluoreszenz-Bildgebung zur Bewertung der Rotalgenphysiologie

Red algae (Rhodophyta) contain phycobiliproteins and colonize habitats with dim light, however some (e.g., some Chroothece species) can also develop in ...

Dieses konfokalmikroskopische Protokoll wird die Interpretation des ökologischen Verhaltens und der Anpassungen von Mikroalgen aus extremen Umgebungen mit langsamem Wachstum im Labor unter Verwendung der Autofluoreszenz ihrer Pigmente ermöglichen. Diese Technik ist nicht invasiv und minimiert Artefakte, da keine chemischen Verbindungen verwendet werden. Die Kenntnis der Leistung von Pigmenten von Autotrophen und des entsprechenden Wachstums ermöglicht die Entwicklung der Kontrollmethoden, die für touristische Höhlen und Baudenkmäler von größtem Interesse sind.Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Inokulums von Chroothece mobilis, indem Sie es aus der Agarkultur in das Meerwassermedium oder das flüssige SWES-Medium überführen. Halten Sie alle Kulturen zwei Wochen lang mit einer Fotoperiode von 16 bis 8 Helldunkel bei 20 Grad Celsius unter einer niedrigen Weißlichtintensität und ohne Schütteln aufrecht, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist. Verwenden Sie einen Milliliter der exponentiellen Phasenkultur mit fünf mal 10 bis dritten Zellen pro Milliliter Zelldichte, um in einer 24-Well-Platte für verschiedene Experimente zu impfen.Um den monochromatischen Lichteffekt zu reproduzieren, verwenden Sie den Grünfilter, der grünes Licht von 470 bis 570 Nanometern mit einem Peak bei einer Wellenlänge von 506 Nanometern und rotem Licht mit einem Filter zwischen 590 und 720 Nanometern und Peaks bei 678 Nanometern durchlässt. Setzen Sie die Zellkulturen zwei Wochen lang diesem Licht aus. Schalten Sie alle Komponenten des inversen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops einschließlich des Lasers ein.Montieren Sie die Zellen im SWES-Wachstumsmedium aus jeder experimentellen Vertiefung der 24-Well-Platte zur Bildgebung auf eine 35-Millimeter-Glasbodenschale. Wählen Sie das numerische Aperturobjektiv mit 63-facher oder 1,30-facher numerischer Apertur oder das NA-Glycerin-Immersionsobjektiv und platzieren Sie Glycerin über dem Objektiv. Legen Sie anschließend die Well-Platte auf den Mikroskoptisch, um sicherzustellen, dass sich die Probe während der Bildaufnahme nicht bewegt.Zentrieren Sie die Probe im Lichtweg und fokussieren Sie auf das Zentrum der Zelle, indem Sie die Ebene mit der höchsten Fluoreszenzintensität auswählen. Wenn Sie fertig sind, öffnen Sie die Bilderfassungssoftware und wählen Sie XY Lambda aus der Dropdown-Liste im Aufnahmemodus. Wählen Sie die Anregungslinie des Lasers 561 Nanometer, acht Bit Dynamikumfang und 1024 x 1024 Pixel.Sammeln Sie die Fluoreszenzemissionsspektren in der 10-Nanometer-Bandbreite und die Lambda-Schrittweite von vier Nanometern im Bereich von 570 bis 760 Nanometern. Stellen Sie die Lochblende auf eine Lufteinheit ein und führen Sie die Lambda-Scan-Erfassung durch. Nachdem Sie diesen Vorgang in verschiedenen Sichtfeldern und unter den unterschiedlichen Bedingungen von rotem und grünem Licht wiederholt haben, speichern Sie alle Daten.Sobald der Lambda-Scan erfasst ist, klicken Sie auf das Quantifizierungsfenster oben in der Software, um die gesammelten Fluoreszenzemissionsspektren auszuwerten. Gehen Sie zum geöffneten Projektfenster und wählen Sie eine XY-Lambda-Datei aus. Wählen Sie die gestapelte Profilanalyse in der Bildgebungssoftware und definieren Sie einen interessierenden Bereich von vier Mikrometern im Quadrat in der Mitte einer Zelle, um die mittlere Fluoreszenzintensität zu analysieren.Exportieren Sie die Daten und CSV, bevor Sie den Vorgang mit verschiedenen Zellen unter verschiedenen Bedingungen wiederholen. Öffnen Sie als Nächstes die CSV-Dateien, um die verschiedenen Fluoreszenzemissionsspitzen aller gemessenen Regionen von Interesse auszuwählen, indem Sie die maximalen Fluoreszenzdaten von Phycoerythrin, Phycocyanobilin, C.phycocyanin, Allophycocyanin bzw. Chlorophyll A in der CSV-Datei auswählen. Wenn Sie fertig sind, erstellen Sie eine neue Tabelle mit allen maximalen Fluoreszenzwerten, die von jedem Phycobiliprotein- und Chlorophyll-Peak erhalten wurden, und zeichnen Sie die Daten in einem Diagramm auf.Es wurden signifikante Unterschiede in der mittleren Fluoreszenzintensität beobachtet. Die mittlere Fluoreszenzintensität von Phycoerythrin Phycocyanobilin nahm signifikant ab, wenn die Zellen monochromatischem grünem Licht ausgesetzt wurden. Im Gegensatz dazu wurde bei rotem Licht kein Unterschied im Vergleich zur Kontrolle beobachtet.Das grüne Licht hatte den gegenteiligen Effekt auf Allophycocyanin und Chlorophyll A, bei denen die mittlere Fluoreszenzintensität unter anderem aufgrund der Anpassung von Antennenkomplexen aufgrund erhöhter Menge oder verbesserter Konnektivität der Antennenkomplexe signifikant zunahm. Das rote Licht führte zu einem nicht signifikanten Anstieg der Allophycocyanin- und Chlorophyllfluoreszenz. Um die Auswirkungen unterschiedlicher Wachstumsbedingungen auf Zellen in Kultur zu untersuchen, ist es wichtig, die Messungen mit genau den gleichen Mikroskopeinstellungen durchzuführen.Es ist möglich, andere Umweltparameter zu analysieren, die für die Kultur von Autofluoreszenzorganismen relevant sind, sowie das Fluoreszenzsignal innerhalb des sichtbaren Spektrums. Diese Technik ist ein sehr leistungsfähiger Ansatz, um lebende Organismen mit mehreren Autofluoreszenzpigmenten zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

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