Name: autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology
Uploaded: 2023-02-17T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology at JoVE.com

מחקר זה בוצע במסגרת פרויקטים TIN2015-68454-R ו- 20961/PI/18, במימון משרד הכלכלה והתחרותיות הספרדי וקרן Séneca של אזור מורסיה. איירין הרננדס מרטינז ופרנסיסקו חבייר איבנייס לופז מהמחלקה לתמיכה סטטיסטית באזור המדע והמחקר של אוניברסיטת מורסיה (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (איור 1 צוירו באמצעות תמונות מ-Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier הוא בעל רישיון Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)

מין האצות Chroothece mobilis שימש במחקר הנוכחי. המין התקבל מאוסף התרביות Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64533/64533fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של המחקר. <em...

<ol>
	<li>Vis, M. L., Necchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , (2021).</li><li>Aboal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+Chroothece+(Rhodophyta,+Stylonematales)+including+two+new+species.">Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species.</a> European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).</li><li>Millach, L., Obiol, A., Sol&#233;, A., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+analyse+in+vivo+the+physiological+state+and+cell+viability+of+phototrophic+microorganisms+by+confocal+laser+scanning+microscopy+using+a+dual+laser.">A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser.</a> Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).</li><li>Millach, L., Villagrasa, E., Sol&#233;, A., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+confocal+laser+scanning+microscopy+techniques+for+a+rapid+assessment+of+the+effect+and+cell+viability+of+Scenedesmus+sp.+DE2009+under+metal+stress.">Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress.</a> Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).</li><li>Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phytoplankton+pigments+by+excitation+spectra+of+fluorescence.">Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence.</a> Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , (2000).</li><li>Beutler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorometric+method+for+the+differentiation+of+algal+populations+in+vivo+and+in+situ.">A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ.</a> Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).</li><li>Grigoryeva, N., Chistyakova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopic+spectroscopy+for+investigation+and+monitoring+of+biological+diversity+and+physiological+state+of+cyanobacterial+cultures.">Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures.</a> Cyanobacteria. , (2018).</li><li>Grigoryeva, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).</li><li>Rold&#225;n, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hern&#225;ndez-Marin&#233;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+pigment+identification+in+single+cells+from+living+phototrophic+biofilms+by+confocal+imaging+spectrofluorometry.">Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).</li><li>Hense, B. A., Gais, P., J&#252;tting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescence+information+for+automated+phytoplankton+investigation+by+image+analysis.">Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis.</a> Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).</li><li>Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+absorbance+and+fluorescence+spectra+to+discriminate+microalgae.">Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae.</a> European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).</li><li>Richardson, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+fluorometric+characterization+of+phytoplankton+community+composition+using+the+Algae+Online+Analyser.">Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser.</a> Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).</li><li>Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+induced+fluorescence+imaging:+application+to+groups+of+macroalgae+identification.">Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).</li><li>Coronado-Parra, T., Rold&#225;n, M., Aboal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+in+ecophysiological+studies+of+algae:+a+door+to+understanding+autofluorescence+in+red+algae.">Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae.</a> Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).</li><li>Mulec, J., Kosi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampenflora+algae+and+methods+of+growth+control.">Lampenflora algae and methods of growth control.</a> Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).</li><li>Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+relationships+of+nonaxenic+filamentous+cyanobacterial+strains+based+on+16S+rRNA+sequence+analysis.">Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis.</a> Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).</li><li>Rold&#225;n, M., Oliva, F., G&#243;nzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hern&#225;ndez-Marin&#233;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+green+light+influence+the+fluorescence+properties+and+structure+of+phototrophic+biofilms.">Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).</li><li>Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+marine+macroalgae+by+fluorescence+signatures.">Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures.</a> International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).</li><li>Rold&#225;n, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+fingerprints+of+endolithic+phototrophic+cyanobacteria+living+within+halite+rocks+in+the+atacama+desert.">Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).</li><li>Sol&#233;, A., Diestra, E., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+image+analysis+for+cyanobacterial+biomass+determined+at+microscale+level+in+different+microbial+mats.">Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats.</a> Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).</li><li>Ram&#237;rez, O., Garc&#237;a, A., Rojas, R., Couve, A., H&#228;rtel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+displacement+algorithm+determines+true+and+random+colocalization+in+fluorescence+microscopy.">Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).</li><li>Universität Gottingen-Georg-August. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAG+Culture+Collection+of+Algae.">SAG Culture Collection of Algae.</a> Universität Gottingen-Georg-August. , (2022).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+cell+counting+method+for+Neubauer+counting+chamber.">Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).</li><li>Wolf, E., Sch&#252;&#223;ler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobiliprotein+fluorescence+of+Nostoc+punctiforme+changes+during+the+life+cycle+and+chromatic+adaptation:+Characterization+by+spectral+confocal+laser+scanning+microscopy+and+spectral+unmixing.">Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing.</a> Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).</li><li>Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+confocal+microscopy+spectral+imaging+systems:+Use+of+multispectral+beads.">Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads.</a> Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).</li><li>Field, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovering Statistics Using R. , (2013).</li><li>Linnet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+paired+t-test+for+evaluation+of+method+comparison+data.">Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data.</a> Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).</li><li>Rosner, B., Grove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Mann-Whitney+U-test+for+clustered+data.">Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data.</a> Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).</li><li>Colin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+living+plant+cell:+from+probes+to+quantification.">Imaging the living plant cell: from probes to quantification.</a> The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).</li><li>Borlinghaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+white+confical:+continuous+spectral+tuning+in+excitation+and+emission.">The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission.</a> Optical Fluorescence Microscopy. , (2011).</li></ol>

חלק מהאצות האדומות החד-תאיות או הקולוניאליות, כגון Chroothece, גדלות לאט במבחנה, אך מכילות תרכובות אוטופלואורסצנטיות מרובות שניתן לנתח באמצעות אנליזה ספקטרלית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, שם ניתן לזהות הבדלים בשיאי פליטת פיגמנטים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי ספקטרלי אפשר לנו לערוך מ...

אצות אדומות, כמו הסוג Chroothece, יכולות לגדול בבתי גידול קיצוניים, שם הן נאלצות להתמודד לעתים קרובות עם שינויים סביבתיים ניכרים1. שיטפונות ובצורות שכיחים באזורים צחיחים למחצה שבהם ניתן למצוא סוג זה, וכמה מינים דווחו בנחלים, צוקים, מערות או אפילו מים תרמיים2. עם זאת, רוב הזמן, משתנים ביולוגיים, כגון תחרות או מרעה, דוחקים מינים לתנאים לא אופטימליים לגידולם. מכיוון שאורגניזמים אלה לעתים קרובות קשים לתרבית ואינם גדלים או גדלים לאט מאוד בתנאי מעבדה, מגבלה עיקרית אחת היא גודל הדגימה הזמין. לכן, חשוב מאוד לעקוב אחר שיטות לא הרסניות או שיטות הכוללות מניפולציה מדגם מינימלי 3,4.
ניתן לעקוב אחר הכישורים הפיזיולוגיים הדרושים כדי לשרוד בסביבות קשות אלה על ידי מעקב אחר שינויים במערכות הפוטוסינתטיות שלהם. מנגנונים מטבוליים, יעילות פוטוסינתטית ורגישות לתנאי אור או תרבית יכולים להתגלות על ידי פרופילי פליטה פלואורסצנטיים של פיגמנטים, עקב שינויים מדויקים בהעברת האנרגיה שלהם או בלכידה 5,6,7,8.
Autofluorescence של תרכובות תאיות יכול לשמש סמן עבור cytodiagnosis או כאינדיקטור טבעי של מצב הסלולר או מטבוליזם בתגובה אותות חיצוניים ופנימיים באמצעות שינויים פליטה9. ניתן להשתמש בו גם כדי להבחין בין קבוצות שונות מבחינה טקסונומית של אורגניזמים פוטוסינתטיים10. בהתאם למיקום הפילוגנטי של מיקרואורגניזמים פוטוטרופיים, ניתן למצוא תכונות פלואורסצנטיות שונות in vivo. לכן, זיהוי טקסונומי המבוסס על מאפייני in vivo של פלואורסצנטיות פוטוטרופית (כולל ספיגה פלואורסצנטית וספקטרום פליטה) נוסה במספר הזדמנויות11,12. בגלל הגיוון בפיגמנטים הנלווים בין פיטופלנקטון טקסה, ניתן להשתמש בהבדלים באורכי הגל שבהם מגורה פלואורסצנטיות כלורופיל A (Chl a), או הבדלים בספקטרום הפליטה, כדי להסיק טקסונומיה13. ספקטרום העירור והפליטה הפלואורסצנטי in vivo של דגימות אלה מסתמך לא רק על פילה של אצות, אלא גם על הסתגלות פוטוסיסטם14. יעילות העברת האנרגיה ל- Chl a, או היחס בין Chl a לפיגמנטים אביזרים, ותכולת הפיגמנט התאית רגישים לתנאי גידול5.
לאצות אדומות, במיוחד Chroothece, יש מספר פיגמנטים פלואורסצנטיים נלווים - חלבוני פיקובילין וקרוטנואידים; הראשון מתרכז בפיקוביליזומים המחוברים לתילקואידים של כלורופלסטים. חלבוני פיקובילין (פיקוציאנין, פיקואריתרין ואלופיקוציאנין) יכולים ללכוד אור באורכי גל שונים ולהעבירו ל-Chl a, מה שמאפשר פוטוסינתזה בתנאי אור ותרבות שונים מאוד15. לדוגמה, מיני Chroothece יכולים לגדול בתוך מערות או כמעט להופיע בנחלים גירניים מלוחים מעט2.
אורות מונוכרומטיים משפיעים על הגדילה והרכב הפיגמנטים של אורגניזמים פוטוסינתטיים, ונחקרו כדי למנוע או לשלוט בגדילה של אורגניזמים פוטוסינתטיים במערות. Mulec et al. הראו כי תאורה מועשרת באדום מקדמת צמיחה של ציאנובקטריה, אצות וצמחים16. מחקרים קודמים דיווחו גם כי אור ירוק משפיע על הרכב הפיגמנטים של ציאנובקטריה17, בעוד שאחרים גילו כי אור ירוק מונע את צמיחתם של רוב האורגניזמים הפוטוסינתטיים וחלק מהציאנובקטריה מציגים ירידה בתילקואידים ועוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת חלשה יותר18.
כדי להבין את יכולתו של Chroothece כאורגניזם מודל להתגבר על תנאים קשים, תאים בתרבית נחשפו לעוצמות אור הולכות וגדלות ולאור מונוכרומטי (ירוק או אדום)15, כדי לראות כיצד הוא מתמודד עם התנאים העמומים של מערות (שבהן האור האדום שולט). הפרוטוקול המוצג כאן משחזר את ההשפעה של המשתנים הנ"ל על חלבוני הפיקובילין של Chroothece ברמה התאית באמצעות אוטופלואורסצנטיות משלו.
כיום, פלואורסצנטיות משמשת בדרך כלל ככלי לחקר התגובות הפיזיולוגיות של צמחים וסקולריים, מיקרו-אצות, מאקרו-אצות וציאנובקטריה13,14,16. מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי ספקטרלי הוא כלי מעולה למחקרי in vivo להערכת הפיזיולוגיה של דגימות פוטוסינתטיות ברמת התא הבודד 10,17,18,19,20, על ידי הימנעות מבעיות הקשורות לקצב הגידול הנמוך במעבדה ולקשיים בהשגת מספיק ביומסה למיצוי ולשיטות הביוכימיות הנלוות8 . לאחר טיפול בתאים בתנאי תרבית שונים במשך שבועיים, ניתן למדוד את פרופיל סריקת הלמבדה in vivo. למרות שישנם מספר פרסומים בהם נעשה שימוש באורכי גל שונים של עירור על ידי הדמיה קונפוקלית 3,4,10,17, ניתן לזהות את רוב חלבוני הפיקובילין ו- Chl a באמצעות קו עירור אורך גל של 561 ננומטר, וטווח הפליטה שזוהה נע בין 570 ל -760 ננומטר. קריטריונים אלה התבססו על ניתוח שבוצע בעבר 10 עם פיגמנטים טהורים מסחריים (טבלה 1) על ידי הדמיה קונפוקלית והתוצאות שהתקבלו במינים שונים של אצות20,21,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">פיגמנטים</td>
			<td rowspan="2">λflmax (NM)</td>
			<td colspan="8">λ exc (NM)</td>
		</tr><tr><td>351</td>
			<td>364</td>
			<td>458</td>
			<td>476</td>
			<td>488</td>
			<td>514</td>
			<td>543</td>
			<td>633</td>
		</tr><tr><td>צ'ל א</td>
			<td>660.9-678.1</td>
			<td>69.9 ± 1.8</td>
			<td>18.1 ± 0.2</td>
			<td>1.8 ± 0.05</td>
			<td>2.2 ± 0.08</td>
			<td>19.7 ± 0.7</td>
			<td>6.0 ± 0.3</td>
			<td>4.2 ± 0.16</td>
			<td>80.7 ± 1.5</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">R-PE</td>
			<td>569.2-583.3</td>
			<td>5.9 ± 0.6</td>
			<td>5.9 ± 0.16</td>
			<td>17.1 ± 0.04</td>
			<td>67.9 ± 0.3</td>
			<td>100.0 ± 0</td>
			<td>90.0 ± 0.3</td>
			<td>992.2 ± 0.08</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>652.1-668.6</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1.5 ± 0.01</td>
			<td>3.7 ± 0.04</td>
			<td>42.9 ± 0.5</td>
			<td>8.7 ± 0.16</td>
			<td>11.1 ± 0.16</td>
			<td>18.2 ± 0.2</td>
		</tr><tr><td>C-PC</td>
			<td>636.2-676.4</td>
			<td>2.3 ± 0.04</td>
			<td>1.0 ± 0.01</td>
			<td>0.6 ± 0.004</td>
			<td>0.7 ± 0.008</td>
			<td>2.2 ± 0.08</td>
			<td>2.2 ± 0.04</td>
			<td>3.3 ± 0.16</td>
			<td>54.1 ± 0.9</td>
		</tr><tr><td>APC-XL</td>
			<td>667.3-683.8</td>
			<td>19.8 ± 1.5</td>
			<td>9.6 ± 0.98</td>
			<td>1.0 ± 0.04</td>
			<td>1.2 ± 0.08</td>
			<td>5.9 ± 0.7</td>
			<td>4.6 ± 0.5</td>
			<td>37.3 ± 3.5</td>
			<td>91.9 ± 2.3</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: מידע הפיגמנט הטהור המשמש להפעלת ניתוח סריקת למדא. טבלה זו מציגה שיאי פליטה וכתפיים/פס פלואורסצנטי מקסימלי של פלואורוכרומים/פיגמנטים שונים על ידי ספקטרופוטומטריה של הדמיה קונפוקלית עבור כל אורכי גל העירור, ואחוז פליטת האור על ידי פיגמנטים/פלואורוכרומים. הערכים חושבו לפי הנוסחה: = MFI*100/255. כל ערך הוא הממוצע ± SE (ממוצע ± שגיאת תקן מהממוצע). פיגמנטים טהורים שימשו לכיול מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי כדלקמן 1,2,10. כלורופיל a התקבל מ-Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) מ-Porphyra tenera, ו-C-phycocyanin (C-PE) מ-Spirulina sp. כל המינים הומסו במים מזוקקים מסוננים. Allophycocyanin-XL (APC-XL) התקבל מ Mastigocladus laminosus, אשר היה מומס אמוניום סולפט (60%) ופוספט אשלגן (pH = 7) כדי להשיג ריכוז של 38 mM. הסריקות בוצעו עם 400 μL מכל תמיסת פיגמנט (ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל) באמצעות תא תחתון מזכוכית מכוסה 8 היטב.
המחקר של אורך גל עירור יחיד הוא קירוב ראשון שימושי למדי. במקרה זה, עם זאת, יש צורך להבהיר את התרומה היחסית של קומפלקסים שונים אות פלואורסצנטי, אשר מומלץ לבצע יחס פלואורסצנטי או ניתוח ספקטרום במספר אורכי גל, בין שיטות אחרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>81158</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 black well plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>82406</td>
			<td>&#160;flat and clear bottom for high throughput microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algae Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15380591</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>506353</td>
			<td>Glycerol immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software. LAS X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>FL40SSENW/37MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum photoradiometer</td>
			<td>DeltaOhm&#160;</td>
			<td>DO 9721</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>R Core Team, 2020</td>
			<td>4.0.2.</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SWES medium</td>
			<td>University of Murcia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type G Immersion liquid</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11513910</td>
			<td>Glycerol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology

אצות אדומות (Rhodophyta) מכילות חלבוני פיקובילין ומאכלסות בתי גידול באור עמום, אולם חלקן (למשל, כמה מיני Chroothece ) יכולות להתפתח גם בשמש מלאה. רוב הרודופיטים הם אדומים, אולם חלקם יכולים להיראות כחלחלים, בהתאם לחלקם של חלבוני ביליבואין כחולים ואדומים (פיקוציאנין ופיקואריתרין). חלבוני פיקובילין שונים יכולים ללכוד אור באורכי גל שונים ולהעביר אותו לכלורופיל a, מה שמאפשר פוטוסינתזה בתנאי אור שונים מאוד. פיגמנטים אלה מגיבים לשינויים בבתי גידול באור, והאוטופלואורסצנטיות שלהם יכולה לסייע בחקר תהליכים ביולוגיים. באמצעות Chroothece mobilis כאורגניזם מודל ומצב סריקת למבדה ספקטרלי במיקרוסקופ קונפוקלי, ההתאמה של פיגמנטים פוטוסינתטיים לאורות מונוכרומטיים שונים נחקרה ברמה התאית כדי לנחש את תנאי הגידול האופטימליים של המין. התוצאות הראו כי גם כאשר הזן הנחקר בודד ממערה, הוא הסתגל לעוצמות אור עמומות ובינוניות כאחד. השיטה המוצגת שימושית במיוחד לחקר אורגניזמים פוטוסינתטיים שאינם גדלים או גדלים לאט מאוד בתנאי מעבדה, וזה בדרך כלל המקרה עבור אלה החיים בבתי גידול קיצוניים.

כלורופיל A בולע בדרך כלל אורכי גל כחולים ואדומים של אור נראה, בעוד שחלבוני פיקובילין משתמשים באורכי גל ירוקים, צהובים וכתומים7. האוטופלואורסצנטיות של פיגמנטים אלה מאפשרת את הגישה הראשונה לחקר חלבוני פיקובילין והתנהגות כלורופיל בתנאי ניסוי ושדה.
על-ידי השוואת ה...

Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology at JoVE.com

Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הדמיה אוטופלואורסצנטית שלב אחר שלב והערכה של שינויים בחלבון פיקובילין באצות אדומות בהתבסס על אנליזה ספקטרלית. זוהי שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת הסתגלות התאית לבתי גידול קיצוניים, כאשר רק חומר נדיר זמין ותאים גדלים לאט, או בכלל לא, בתנאי מעבדה.

הדמיה אוטופלואורסצנטית להערכת פיזיולוגיה של אצות אדומות

Red algae (Rhodophyta) contain phycobiliproteins and colonize habitats with dim light, however some (e.g., some Chroothece species) can also develop in ...

פרוטוקול מיקרוסקופי קונפוקלי זה יאפשר פרשנות של ההתנהגות האקולוגית וההתאמות של מיקרו-אצות מסביבות קיצוניות עם גידול איטי במעבדה באמצעות אוטופלואורסצנטיות של הפיגמנטים שלהן. טכניקה זו אינה פולשנית וממזערת ממצאים מכיוון שלא נעשה שימוש בתרכובות כימיות. לדעת את הביצועים של פיגמנטים של autotrophs וצמיחה מקבילה יאפשר את העיצוב של שיטות שליטה, שהוא העניין הגדול ביותר עבור מערות תיירותיות ומונומנטים אדריכליים.התחל להכין את החיסון של Chroothece mobilis על ידי העברתו מתרבית האגר למדיום מי הים או המדיום הנוזלי SWES. שמרו על כל התרביות במשך שבועיים עם תקופת צילום כהה בהירה של 16 עד 8 מעלות צלזיוס ב-20 מעלות צלזיוס בעוצמת אור לבנה נמוכה וללא רעידות עד לקבלת צפיפות התאים הרצויה. השתמש מיליליטר אחד של תרבית הפאזה המעריכית שיש פי חמש 10 לתאים השלישי לכל מיליליטר צפיפות התא כדי לחסן בצלחת של 24 בארות לניסויים שונים.כדי לשחזר את אפקט האור המונוכרומטי, השתמש במסנן הירוק המאפשר לאור ירוק לעבור מ-470 עד 570 ננומטר עם שיא באורך גל של 506 ננומטר ולאור אדום מותאם באמצעות מסנן בין 590 ל-720 ננומטר ושיא של 678 ננומטר. חשפו את תרביות התאים לאור זה במשך שבועיים. הפעל את כל רכיבי מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי ההפוך כולל הלייזר.הרכיבו את התאים במצע הגידול SWES מכל באר ניסויית של צלחת 24 בארות לצלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ להדמיה. בחר את מטרת הצמצם המספרי 63X או 1.30 או את מטרת הטבילה של גליצרול NA והנח את הגליצרול מעל העדשה. לאחר מכן, הניחו את צלחת הבאר על במת המיקרוסקופ וודאו שהדגימה אינה זזה במהלך רכישת התמונה.מרכז את הדגימה בנתיב האור והתמקד במרכז התא על ידי בחירת המישור בעל עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר. לאחר שתסיים, פתח את תוכנת רכישת התמונות ובחר XY lambda מהרשימה הנפתחת במצב רכישה. בחר את קו העירור של הלייזר 561 ננומטר, שמונה סיביות של טווח דינמי ו 1024 על 1024 פיקסלים.אסוף את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית ברוחב פס של 10 ננומטר ואת גודל מדרגת למדא של ארבעה ננומטר בטווח של 570 עד 760 ננומטר. הגדר את חור הסיכה ביחידת אוויר אחת והפעל את רכישת סריקת למדא. לאחר חזרה על תהליך זה בשדות ראייה שונים ובתנאים שונים של אורות אדומים וירוקים, שמור את כל הנתונים.לאחר רכישת סריקת הלמדא, לחץ על חלון הכימות בחלק העליון של התוכנה כדי להעריך את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטי שנאסף. עבור אל חלון הפרויקט הפתוח ובחר קובץ XY lambda אחד. בחר ניתוח פרופיל מוערם בתוכנת ההדמיה והגדר אזור עניין של ארבעה מיקרומטר מרובע במרכז התא כדי לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת.יצא את הנתונים ואת CSV לפני חזרה על התהליך עם תאים שונים בתנאים שונים. לאחר מכן, פתח את קובצי CSV כדי לבחור את שיאי הפלואורסצנטיות השונים של כל אזורי העניין הנמדדים על ידי בחירת הנתונים הפלואורסצנטיים המרביים של פיקואריתרין פיקוציאנובילין, C.phycocyanin, allophycocyanin וכלורופיל A בהתאמה בקובץ CSV. לאחר שתסיים, צור טבלה חדשה עם כל ערכי הפלואורסצנטיות המרביים המתקבלים מכל שיא של פיקובילין וכלורופיל והתווה את הנתונים על גרף.נצפו הבדלים משמעותיים בעוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת. עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של פיקואריתרין פיקוציאנובילין ירדה באופן משמעותי כאשר התאים נחשפו לאור ירוק מונוכרומטי. לעומת זאת, לא נצפה הבדל באור אדום לעומת קבוצת הביקורת.לאור הירוק הייתה השפעה הפוכה על אלופיקוציאנין וכלורופיל A, שבהם עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת גדלה באופן משמעותי עקב הסתגלות של מתחמי אנטנות עקב כמות מוגברת או קישוריות משופרת של מתחמי האנטנות, בין היתר. האור האדום גרם לעלייה לא משמעותית באלופיקוציאנין ובכלורופיל פלואורסצנטי. כדי לחקור את ההשפעה של תנאי גדילה שונים על תאים בתרבית, חיוני לבצע את המדידות עם אותן הגדרות מיקרוסקופ בדיוק.ניתן לנתח פרמטרים סביבתיים אחרים הרלוונטיים לתרבית של אורגניזמים אוטופלואורסצנטיים, כמו גם את האות הפלואורסצנטי בתוך הספקטרום הנראה. טכניקה זו היא גישה חזקה מאוד לחקר אורגניזמים חיים עם מספר פיגמנטים אוטופלואורסצנטיים.

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

צפה היסטורי הפגנה לפיזיולוגיה NMJ של השריר פותחן סרטן הנהרות

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

הפגנת מעבדה לפיזיולוגיה: גלומרולרי סינון שיעור בחולדה

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Intracavernosal Pressure Recording to Evaluate Erectile Function in Rodents

הקלטה Intracavernosal לחץ כדי להעריך את תפקוד זיקפה אצל מכרסמים

Erectile dysfunction (ED) is defined as the inability to attain or keep an erection of the penis, and this has become a prevalent male sexual disorder. ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

הקמתה של תרבות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו Conjugating

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

בידוד של רבים ברשתית ללימודי פיזיולוגיה של התא Vivo לשעבר

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...