Name: autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology
Uploaded: 2023-02-17T13:25:00
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この研究は、スペイン経済競争力省とムルシア地域のセネカ財団が資金提供するプロジェクトTIN2015-68454-Rおよび20961 / PI / 18の一環として実施されました。ムルシア大学科学研究エリア統計支援セクションのアイリーン・エルナンデス・マルティネスとフランシスコ・ハビエル・イバニェス・ロペス(Sección de Apoyo Estadístico (SAE)、Área Científica y de Investigación(ACTI)、ムルシア大学(図1 はセルヴィエ・メディカル・アートの写真を使用して描かれました。セルヴィエによるセルヴィエ・メディカル・アートは、クリエイティブ・コモンズ 表示 3.0 非移植ライセンス (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/) でライセンスされています。

藻類種 Chroothece mobilis が本研究に使用された。この種は、微細藻類Edaphic SEスペイン、MAESE 20.29培養コレクションから入手しました。プロトコルの概要を 図 1 に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64533/64533fig01.jpg"> 図1:研究の概要。 Chroothece mobilis は...

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Chrootheceなどの一部の単細胞またはコロニーの紅藻は、in vitroでゆっくりと成長しますが、色素発光ピークの違いを検出できる共焦点顕微鏡でのスペクトル分析によって分析できる複数の自己蛍光化合物が含まれています。スペクトル共焦点蛍光顕微鏡法により、光合成生物の適応または順応を評価するためのin vivo研究を実施することができました8,10,17,18,19,20。<sup class="xr...

Chroothece属などの紅藻は、極端な生息地で成長する可能性があり、そこでは頻繁に顕著な環境変化に対処しなければなりません1。洪水や干ばつは、この属が見られる半乾燥地域で頻繁に発生し、一部の種は小川、崖、洞窟、さらには温泉水で報告されています2。しかし、ほとんどの場合、競争や放牧などの生物学的変数は、種を成長に最適な条件に追いやっています。これらの生物は培養が困難なことが多く、実験室条件下では成長しないか、成長が非常に遅いため、大きな制限の1つは利用可能なサンプルサイズです。したがって、非破壊的な方法または最小限のサンプル操作を伴う方法に従うことが非常に重要です3,4。
これらの過酷な環境で生き残るために必要な生理学的スキルは、光合成システムの変化を追跡することによって監視することができます。代謝メカニズム、光合成効率、および光または培養条件に対する感受性は、それらのエネルギー伝達またはトラップの正確な変化による色素蛍光発光プロファイルによって明らかにすることができる5、6、7、8。
細胞化合物の自家蛍光は、細胞診断のためのマーカーとして、または発光の変化を介した外部および内部シグナルに応答する細胞状態または代謝の自然な指標として使用することができる9。また、分類学的に異なる光合成生物群を区別するためにも用いることができる10。光合成微生物の系統発生的位置に応じて、異なる in vivo 蛍光の特徴を見つけることができます。そのため、光合成蛍光の インビボ 特性(蛍光吸収および発光スペクトルを含む)に基づく分類学的同定が何度か試みられている11、12。植物プランクトン分類群間の副色素の多様性のために、クロロフィルa(Chl a)蛍光が刺激される波長の違い、または発光スペクトルの違いは、分類法を推測するために使用することができます13。これらの標本の in vivo 蛍光励起および発光スペクトルは、藻類門だけでなく、光化学系の適応にも依存しています14。Chl aへのエネルギー移動の効率、または付属色素に対するChlaの比率、および細胞色素含有量は、成長条件に敏感です5。
紅藻、特に Chrootheceは、いくつかの副蛍光色素 - フィコビリタンパク質およびカロテノイドを有する。前者は葉緑体のチラコイドに付着したフィコビリソームに集中する。フィコビリタンパク質(フィコシアニン、フィコエリスリン、およびアロフィコシアニン)は、さまざまな波長の光を捕捉してChl aに伝達できるため、非常に異なる光と培養条件での光合成が可能になります15。たとえば、 Chroothece 種は洞窟内で成長したり、わずかに塩分の多い石灰質の流れにほとんど出現したりする可能性があります2。
単色光は、光合成生物の成長と色素組成に影響を与え、洞窟での光合成生物の成長を防止または制御することが研究されています。Mulecら赤色濃縮照明がシアノバクテリアの成長を促進することを示した, 藻類, と植物16.以前の研究では、緑色光がシアノバクテリアの色素組成に影響を与えることも報告されています17, 他の研究では、緑色光がほとんどの光合成生物の成長を妨げ、一部のシアノバクテリアはチラコイドの減少と弱い平均蛍光強度を示すことが明らかになりました18.
モデル生物としての Chroothece が過酷な条件を克服する能力を理解するために、培養細胞は増加する光強度と単色光(緑または赤)15にさらされ、洞窟の薄暗い条件(赤色光が優勢)にどのように対処するかを調べました。本明細書に提示されるプロトコルは、 Chrootheceのフィコビリタンパク質に対する上記の変数の効果を、それ自身の自己蛍光を用いて細胞レベルで再現する。
今日、蛍光は維管束植物、微細藻類、大型藻類、およびシアノバクテリアの生理学的応答を研究するためのツールとして一般的に使用されています13,14,16。分光共焦点蛍光顕微鏡は、実験室での低成長率に関連する問題や、関連する抽出および生化学的方法に十分なバイオマスを得ることの難しさを回避することにより、光合成標本の生理機能を単一細胞レベルで評価するためのin vivo研究に最適なツールです10、17、18、19、208.細胞を異なる培養条件下で2週間処理すると、ラムダスキャンプロファイルをin vivoで測定できます。共焦点イメージングによる励起の異なる波長が用いられているいくつかの出版物があるが3、4、10、17、ほとんどのフィコビリタンパク質およびChl aは、561nmの波長励起線を用いて検出することができ、検出される発光は570〜760nmの波長の範囲である。これらの基準は、共焦点イメージングによる市販の純粋な顔料(表1)を用いて以前に行われた分析10、および異なる藻類種20、21、22で得られた結果に基づいている。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">顔料</td>
			<td rowspan="2">λFL最大 (nm)</td>
			<td colspan="8">λ エクスクセプタ (nm)</td>
		</tr><tr><td>351</td>
			<td>364</td>
			<td>458</td>
			<td>476</td>
			<td>488</td>
			<td>514</td>
			<td>543</td>
			<td>633</td>
		</tr><tr><td>Chl a</td>
			<td>660.9-678.1</td>
			<td>43.4 ± 1.8</td>
			<td>11.2 ± 0.2</td>
			<td>1.8 ± 0.05</td>
			<td>2.0 ± 0.08</td>
			<td>12.2 ± 0.7</td>
			<td>6.0± 0.3</td>
			<td>4.2 ± 0.16</td>
			<td>80.7 ± 1.5</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">R-PE</td>
			<td>569.2-583.3</td>
			<td>5.9 ± 0.6</td>
			<td>5.9 ± 0.16</td>
			<td>11.1 ± 0.04</td>
			<td>42.2±0.3</td>
			<td>100.0 ± 0</td>
			<td>90.0± 0.3</td>
			<td>99.2 ± 0.08</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>652.1-668.6</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1.5 ± 0.01</td>
			<td>3.7 ± 0.04</td>
			<td>26.7± 0.5</td>
			<td>8.7 ± 0.16</td>
			<td>11.1 ± 0.16</td>
			<td>11.3 ± 0.2</td>
		</tr><tr><td>C-PC</td>
			<td>636.2-676.4</td>
			<td>2.3 ± 0.04</td>
			<td>1.0 ± 0.01</td>
			<td>0.6 ± 0.004</td>
			<td>0.7 ± 0.008</td>
			<td>2.0 ± 0.08</td>
			<td>2.0 ± 0.04</td>
			<td>3.3 ± 0.16</td>
			<td>33.6± 0.9</td>
		</tr><tr><td>APC-XL</td>
			<td>667.3-683.8</td>
			<td>15.1 ± 1.5</td>
			<td>9.6 ± ±0.98</td>
			<td>1.0 ± 0.04</td>
			<td>1.2 ± 0.08</td>
			<td>5.9 ± 0.7</td>
			<td>4.1 ± 0.5</td>
			<td>23.2 ± 3.5</td>
			<td>91.4 ± 2.3</td>
		</tr></tbody></table>表1:ラムダスキャン分析の実行に使用される純粋な顔料情報。 この表は、すべての励起波長の共焦点イメージング分光光度法による異なる蛍光色素/顔料の発光ピークと肩/蛍光バンドの最大値、および顔料/蛍光色素による発光の割合を示しています。値は、= MFI * 100/255の式で計算しました。各値はSE±平均値(平均値±平均からの標準誤差)です。共焦点走査型レーザー顕微鏡の校正には純顔料を以下の1、2、10で使用した。クロロフィルaはスピ ナシアオレラセアから、R-フィコエリスリン(R-PE)はポルフィ ラテネラから、 C-フィコシアニン(C-PE)は スピルリナspから得られた。 全ての種を濾過蒸留水に溶解した。アロフィコシアニン-XL(APC-XL)は、硫酸アンモニウム(60%)およびリン酸カリウム(pH = 7)に溶解して38 mMの濃度を達成した マスティゴクラドゥスラミノサスから得られました。スキャンは、8ウェルカバーガラスボトムチャンバーを使用して、各顔料溶液(濃度1 mg / mL)400 μLで実行されました。
単一の励起波長の研究は、非常に有用な最初の近似です。ただし、この場合、蛍光シグナルにおける異なる複合体の相対的な寄与を解明する必要があり、他の方法の中でもとりわけ、いくつかの波長で蛍光比またはスペクトル分析を実行することをお勧めします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>81158</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 black well plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>82406</td>
			<td>&#160;flat and clear bottom for high throughput microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algae Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15380591</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>506353</td>
			<td>Glycerol immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software. LAS X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>FL40SSENW/37MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum photoradiometer</td>
			<td>DeltaOhm&#160;</td>
			<td>DO 9721</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>R Core Team, 2020</td>
			<td>4.0.2.</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SWES medium</td>
			<td>University of Murcia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type G Immersion liquid</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11513910</td>
			<td>Glycerol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology

紅藻(Rhodophyta)にはフィコビリタンパク質が含まれており、薄暗い光で生息地にコロニーを形成しますが、一部(たとえば、一部の Chroothece 種)は完全な日光の下でも発達する可能性があります。ほとんどのシャクナゲは赤ですが、青と赤のビリタンパク質(フィコシアニンとフィコエリスリン)の割合によっては青みがかったように見えるものもあります。異なるフィコビリタンパク質は、異なる波長の光を捕捉し、それをクロロフィルaに伝達することができるため、非常に異なる光条件下での光合成が可能になります。これらの色素は光の生息地の変化に反応し、それらの自家蛍光は生物学的プロセスの研究に役立ちます。 Chroothece mobilis をモデル生物として使用し、共焦点顕微鏡でスペクトルラムダスキャンモードを使用して、光合成色素の異なる単色光への適応を細胞レベルで研究し、種の最適な成長条件を推測しました。結果は、研究された株が洞窟から分離された場合でも、薄暗い光強度と中程度の光強度の両方に適応することを示しました。提示された方法は、極端な生息地に住んでいる人々に通常当てはまる、実験室条件下で成長しないかまたは非常にゆっくりと成長する光合成生物を研究するのに特に有用である。

クロロフィルaは一般に可視光の青と赤の波長を吸収しますが、フィコビリタンパク質は緑、黄、オレンジの波長7を使用します。これらの色素の自家蛍光により、実験および野外条件下でフィコビリタンパク質とクロロフィル挙動を研究する最初のアプローチが可能になります。
得られたデータを比較し、異なるグラフにプロットすることにより、平均...

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Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology

本プロトコルは、スペクトル分析に基づく紅藻におけるフィコビリタンパク質変化の段階的な自己蛍光イメージングおよび評価を記載する。これは、希少な材料しか利用できず、実験室条件下で細胞がゆっくりと成長するか、まったく成長しない場合に、極端な生息地への細胞の適応を評価するためのラベルフリーで非破壊的な方法です。

紅藻生理機能を評価するための自己蛍光イメージング

Red algae (Rhodophyta) contain phycobiliproteins and colonize habitats with dim light, however some (e.g., some Chroothece species) can also develop in ...

この共焦点顕微鏡プロトコルは、色素の自家蛍光を使用して、実験室でゆっくりと成長する極端な環境からの微細藻類の生態学的行動と適応の解釈を可能にします。この技術は侵襲的ではなく、化合物を使用しないためアーチファクトを最小限に抑えます。独立栄養生物の色素の性能とそれに対応する成長を知ることで、観光洞窟や建築記念碑にとって最大の関心事である制御方法の設計が可能になります。Chroothece mobilisの接種材料を寒天培養物から海水培地またはSWES液体培地に移すことによって準備を開始します。すべての培養物を、低い白色光強度の下で、所望の細胞密度が得られるまで振とうすることなく、摂氏20度で16〜8の明るい暗い写真期間で2週間維持する。1ミリリットルの細胞密度につき10〜3番目の細胞密度の5倍を有する1ミリリットルの指数相培養物を使用して、異なる実験のために24ウェルプレートに接種する。単色光の効果を再現するには、緑色フィルターを使用して、506ナノメートルの波長にピークを持つ470〜570ナノメートルの緑色光を通過させ、590〜720ナノメートルのフィルターを使用して調整された赤色光と678ナノメートルのピークを通過させます。細胞培養物をこの光に2週間さらします。レーザーを含む倒立共焦点レーザー走査型顕微鏡のすべてのコンポーネントの電源を入れます。SWES増殖培地中の細胞を、24ウェルプレートの各実験ウェルから35ミリメートルのガラス底皿にマウントしてイメージングします。63Xまたは1.30の絞り数またはNAグリセロール液浸対物レンズを選択し、グリセロールをレンズの上に置きます。次に、ウェルプレートを顕微鏡ステージに置き、画像取得中に標本が動かないようにします。標本を光路の中心に配置し、蛍光強度が最も高い平面を選択して細胞の中心に焦点を合わせます。完了したら、画像取得ソフトウェアを開き、取得モードのドロップダウンリストからXYラムダを選択します。レーザーの励起線561ナノメートル、8ビットのダイナミックレンジ、1024 x 1024ピクセルを選択します。10ナノメートル帯域幅の蛍光発光スペクトルと、570〜760ナノメートルの範囲内の4ナノメートルのラムダステップサイズを収集します。ピンホールを1つのエアユニットに設定し、ラムダスキャン取得を実行します。このプロセスをさまざまな視野で、赤と緑のライトのさまざまな条件下で繰り返した後、すべてのデータを保存します。ラムダスキャンが取得されたら、ソフトウェアの上部にある定量ウィンドウをクリックして、収集された蛍光発光スペクトルを評価します。開いているプロジェクトウィンドウに移動し、XYラムダファイルを1つ選択します。イメージングソフトウェアでスタックプロファイル解析を選択し、細胞の中心に4マイクロメートル四方の関心領域を定義して、平均蛍光強度を分析します。データとCSVをエクスポートしてから、さまざまな条件下でさまざまなセルでプロセスを繰り返す。次に、CSVファイルを開き、CSVファイル内のフィコエリスリンフィコシアノビリン、C.フィコシアニン、アロフィコシアニン、クロロフィルAの最大蛍光データをそれぞれ選択することにより、すべての測定対象領域の異なる蛍光発光ピークを選択します。完了したら、各フィコビリタンパク質とクロロフィルピークから得られたすべての最大蛍光値を含む新しいテーブルを作成し、データをグラフにプロットします。平均蛍光強度に有意差は認められなかった。フィコエリスリンフィコシアノビリンの平均蛍光強度は、細胞が単色緑色光にさらされると有意に減少した。対照的に、対照と比較して赤色光に差は認められなかった。緑色光は、アロフィコシアニンとクロロフィルAに逆の効果をもたらし、とりわけアンテナ複合体の量の増加または接続性の改善によるアンテナ複合体の適応により、平均蛍光強度が大幅に増加しました。赤色光は、アロフィコシアニンおよびクロロフィル蛍光の有意でない増加をもたらした。培養中の細胞に対するさまざまな増殖条件の影響を調べるには、まったく同じ顕微鏡設定で測定を行うことが重要です。自家蛍光生物の培養に関連する他の環境パラメータや、可視スペクトル内の蛍光シグナルを分析することが可能です。この技術は、いくつかの自己蛍光色素を有する生命生物を研究するための非常に強力なアプローチである。

Research

JoVE Journal

Biology

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