Name: autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology
Uploaded: 2023-02-17T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology at JoVE.com

이 연구는 프로젝트 TIN2015-68454-R 및 20961/PI/18의 일환으로 수행되었으며, 스페인 경제 경쟁력부와 무르시아 지역의 세네카 재단이 자금을 지원했습니다. 무르시아 대학교 과학 및 연구 분야의 통계 지원 부서의 Irene Hernández Martínez와 Francisco Javier Ibáñez López (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia (그림 1 )는 Servier Medical Art의 그림을 사용하여 그려졌습니다. Servier의 Servier Medical Art는 Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)로 라이선스가 부여되었습니다.

조류 종인 Chroothece mobilis가 본 연구에 사용되었습니다. 상기 종은 스페인 미세조류 Edaphic SE, MAESE 20.29 배양물 수집으로부터 입수하였다. 프로토콜의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64533/64533fig01.jpg"> 그림 1 : 연구 개요. Chroothece mobi...

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	<li>Vis, M. 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Chroothece와 같은 일부 단세포 또는 식민지 홍조류는 시험관 내에서 천천히 성장하지만 안료 방출 피크의 차이를 감지할 수 있는 컨포칼 현미경 하에서 스펙트럼 분석으로 분석할 수 있는 여러 자가형광 화합물을 포함합니다. 스펙트럼 공초점 형광 현미경을 통해 광합성 유기체 8,10,17,18,19,20의 적응 또는 순응을 평가하기 위한<sup clas...

Chroothece 속과 같은 홍조류는 극한의 서식지에서 자랄 수 있으며, 극한의 서식지에서 자주 나타나 뚜렷한 환경 변화에 대처해야 한다1. 홍수와 가뭄은 이 속이 발견되는 반건조 지역에서 빈번하며, 일부 종은 개울, 절벽, 동굴 또는 심지어 온천수에서도 보고되었다2. 그러나 대부분의 경우 경쟁이나 방목과 같은 생물학적 변수는 종을 성장을위한 최적이 아닌 조건으로 강등시킵니다. 이러한 유기체는 종종 배양하기 어렵고 실험실 조건에서 성장하지 않거나 매우 느리게 성장하기 때문에 한 가지 주요 제한 사항은 사용 가능한 샘플 크기입니다. 따라서 비파괴 방법 또는 최소한의 샘플 조작을 포함하는 방법을 따르는 것이 매우 중요합니다 3,4.
이러한 혹독한 환경에서 생존하는 데 필요한 생리적 기술은 광합성 시스템의 변화를 추적하여 모니터링 할 수 있습니다. 대사 기전, 광합성 효율 및 빛 또는 배양 조건에 대한 민감도는 에너지 전달 또는 포획의 정확한 변화로 인해 색소 형광 방출 프로파일에 의해 밝혀질 수 있습니다 5,6,7,8.
세포 화합물의 자가형광은 세포 진단을 위한 마커로 사용되거나, 방출의 변화를 통한 외부 및 내부 신호에 반응하여 세포 상태 또는 대사의 자연 지표로 사용될 수 있다9. 또한 분류학적으로 다른 광합성 생물 그룹을 구별하는 데 사용할 수 있다10. 광영양 미생물의 계통발생학적 위치에 따라 다양한 생체 내 형광 특징을 찾을 수 있습니다. 그러므로, 광영양 형광(형광 흡수 및 방출 스펙트럼 포함)의 생체 내 특성에 기초한 분류학적 동정이 여러 차례 시도되었다11,12. 식물성 플랑크톤 분류군 간의 부속 색소의 다양성 때문에, 엽록소 a(Chla) 형광이 자극되는 파장의 차이 또는 방출 스펙트럼의 차이를 사용하여 분류법을 추론할 수 있다13. 이 표본의 생체 내 형광 여기 및 방출 스펙트럼은 조류의 문뿐만 아니라 광계 적응에도 의존한다14. Chla에 대한 에너지 전달 효율, 또는 부속 색소에 대한 Chla의 비율, 세포 색소 함량은 성장 조건에 민감하다5.
홍조류, 특히 Chroothece는 몇 가지 보조 형광 색소 인 phycobiliproteins와 카로티노이드를 가지고 있습니다. 전자는 엽록체의 틸라코이드에 부착 된 phycobilisomes에 집중합니다. 피코빌리단백질(피코시아닌, 피코에리트린, 알로피코시아닌)은 서로 다른 파장의 빛을 포착하여 Chl a로 투과시킬 수 있으며, 이는 매우 다른 빛과 배양 조건에서 광합성을 가능하게 한다15. 예를 들어, Chroothece 종은 동굴 내부에서 자라거나 약간 염분이 많은 석회질 개울에서 거의 출현할 수 있다2.
단색광은 광합성 유기체의 성장과 색소 구성에 영향을 미칩니다., 동굴에서 광합성 유기체의 성장을 방지하거나 제어하기 위해 연구되었습니다. Mulec et al. 적색 농축 조명이 시아노박테리아, 조류 및 식물의 성장을 촉진한다는 것을 보여주었다16. 이전 연구에서는 녹색광이 시아노박테리아의 색소 조성에 영향을 미친다고 보고한 바 있으며17, 다른 연구에서는 녹색광이 대부분의 광합성 유기체의 성장을 방해하고 일부 시아노박테리아는 틸라코이드의 감소와 약한 평균 형광 강도를 나타낸다고 보고했다18.
모델 유기체로서 Chroothece 가 가혹한 조건을 극복하는 능력을 이해하기 위해 배양된 세포는 증가하는 빛의 강도와 단색광(녹색 또는 적색)15에 노출되어 동굴의 희미한 조건(적색광이 우세함)에 어떻게 대처하는지 확인했습니다. 본원에 제시된 프로토콜은 자체 자가형광을 사용하여 세포 수준에서 Chroothece의 phycobiliproteins에 대한 상기 언급된 변수의 효과를 재현합니다.
오늘날 형광은 혈관 식물, 미세 조류, 거대 조류 및 시아 노 박테리아의 생리적 반응을 연구하는 도구로 일반적으로 사용됩니다13,14,16. 스펙트럼 컨포칼 형광 현미경은 실험실의 낮은 성장률과 관련된 문제와 관련 추출 및 생화학적 방법을 위한 충분한 바이오매스 확보의 어려움을 방지함으로써 단일 세포 수준 10,17,18,19,20에서 광합성 표본의 생리를 평가하기 위한 생체 내 연구를 위한 탁월한 도구입니다8 . 세포가 2주 동안 상이한 배양 조건 하에서 처리되면, 람다 스캔 프로파일은 생체 내에서 측정될 수 있다. 공초점 이미징에 의한 다양한 여기파장이 사용된 여러 논문이 있지만3,4,10,17, 대부분의 피코빌리단백질과 Chla는 561nm 파장 여기선을 사용하여 검출할 수 있으며, 검출된 방출 범위는 570 내지 760nm 파장이다. 이러한 기준은 공초점 이미징에 의해 상업적인 순수 안료(표 1)로 이전에 수행된 분석 10과 상이한 조류 종(20,21,22)에서 얻어진 결과를 기반으로 한다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">안료</td>
			<td rowspan="2">λflmax (nm)</td>
			<td colspan="8">λ exc (nm)</td>
		</tr><tr><td>351</td>
			<td>364</td>
			<td>458</td>
			<td>476</td>
			<td>488</td>
			<td>514</td>
			<td>543</td>
			<td>633</td>
		</tr><tr><td>Chl a</td>
			<td>660.9-678.1</td>
			<td>43.4 ± 1.8</td>
			<td>11.2 ± 0.2</td>
			<td>1.8 ± 0.05</td>
			<td>2.0 ± 0.08</td>
			<td>12.2 ± 0.7</td>
			<td>6.0 ± 0.3</td>
			<td>4.2 ± 0.16</td>
			<td>80.7 ± 1.5</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">R-PE (알-PE)</td>
			<td>569.2-583.3</td>
			<td>5.9 ± 0.6</td>
			<td>5.9 ± 0.16</td>
			<td>11.1 ± 0.04</td>
			<td>42.2 ± 0.3</td>
			<td>100.0 ± 0</td>
			<td>90.0 ± 0.3</td>
			<td>99.2 ± 0.08</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>652.1-668.6</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1.5 ± 0.01</td>
			<td>3.7 ± 0.04</td>
			<td>26.7 ± 0.5</td>
			<td>8.7 ± 0.16</td>
			<td>11.1 ± 0.16</td>
			<td>11.3 ± 0.2</td>
		</tr><tr><td>씨-PC</td>
			<td>636.2-676.4</td>
			<td>2.3 ± 0.04</td>
			<td>1.0 ± 0.01</td>
			<td>0.6 ± 0.004</td>
			<td>0.7 ± 0.008</td>
			<td>2.0 ± 0.08</td>
			<td>2.0 ± 0.04</td>
			<td>3.3 ± 0.16</td>
			<td>33.6 ± 0.9</td>
		</tr><tr><td>APC-XL〈블랙〉</td>
			<td>667.3-683.8</td>
			<td>15.1 ± 1.5</td>
			<td>9.6 ± 0.98</td>
			<td>1.0 ± 0.04</td>
			<td>1.2 ± 0.08</td>
			<td>5.9 ± 0.7</td>
			<td>4.1 ± 0.5</td>
			<td>23.2 ± 3.5</td>
			<td>91.4 ± 2.3</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 람다 스캔 분석을 실행하는 데 사용되는 순수 안료 정보. 이 표는 모든 여기 파장에 대한 컨포칼 이미징 분광 광도법에 의한 다양한 형광색소/안료의 발광 피크 및 숄더/형광 대역 최대값과 안료/형광 색소에 의한 발광 비율을 보여줍니다. 값은 공식에 의해 계산되었습니다: = MFI*100/255. 각 값은 평균 ± SE(평균에서 평균 ± 표준 오차)입니다. 순수 안료는 공초점 주사 레이저 현미경의 보정을 위해 하기 1,2,10과 같이 사용하였다. 엽록소 a는 Spinacia oleracea에서, R-피코에리트린(R-PE)은 포르피라 테네라에서, C-피코시아닌(C-PE)은 스피룰리나 sp.에서 얻었습니다. 모든 종을 여과된 증류수에 용해시켰다. 알로피코시아닌-XL(APC-XL)은 황산암모늄(60%)과 인산칼륨(pH = 7)에 용해시켜 38mM의 농도를 달성한 Mastigocladus laminosus로부터 얻었습니다. 스캔은 8웰 덮개 유리 바닥 챔버를 사용하여 각 안료 용액(농도 1mg/mL)의 400μL로 수행되었습니다.
단일 여기 파장에 대한 연구는 매우 유용한 첫 번째 근사치입니다. 그러나 이 경우 형광 신호에서 서로 다른 복합체의 상대적 기여도를 설명할 필요가 있으며, 이는 다른 방법 중에서 여러 파장에서 형광 비율 또는 스펙트럼 분석을 수행하는 것이 좋습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>81158</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 black well plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>82406</td>
			<td>&#160;flat and clear bottom for high throughput microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algae Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15380591</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>506353</td>
			<td>Glycerol immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software. LAS X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>FL40SSENW/37MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum photoradiometer</td>
			<td>DeltaOhm&#160;</td>
			<td>DO 9721</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>R Core Team, 2020</td>
			<td>4.0.2.</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SWES medium</td>
			<td>University of Murcia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type G Immersion liquid</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11513910</td>
			<td>Glycerol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology

홍조류 (Rhodophyta)는 phycobiliproteins를 함유하고 희미한 빛으로 서식지를 식민지화하지만 일부 (예 : 일부 Chroothece 종)는 햇빛이 가득한 곳에서도 자랄 수 있습니다. 대부분의 rhodophytes는 빨간색이지만 일부는 파란색과 빨간색 담즙 단백질 (phycocyanin 및 phycoerythrin)의 비율에 따라 푸르스름하게 보일 수 있습니다. 다른 phycobiliproteins는 다양한 파장에서 빛을 포착하여 엽록소 a로 전달할 수 있으며, 이는 매우 다른 빛 조건에서 광합성을 가능하게합니다. 이 색소는 빛의 서식지 변화에 반응하며 자가 형광은 생물학적 과정을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. Chroothece mobilis 를 모델 유기체로 사용하고 컨포칼 현미경의 스펙트럼 람다 스캔 모드를 사용하여 종의 최적 성장 조건을 추측하기 위해 세포 수준에서 다양한 단색광에 대한 광합성 색소의 적응을 연구했습니다. 결과는 연구 된 균주가 동굴에서 분리 된 경우에도 희미하고 중간 정도의 광도에 적응한다는 것을 보여주었습니다. 제시된 방법은 일반적으로 극한 서식지에 사는 사람들의 경우인 실험실 조건에서 매우 느리게 성장하거나 성장하지 않는 광합성 유기체를 연구하는 데 특히 유용합니다.

엽록소 a는 일반적으로 가시광선의 청색과 적색 파장을 흡수하는 반면, 피코빌리단백질은 녹색, 황색, 주황색 파장을 사용한다7. 이러한 색소의 자가형광은 실험 및 현장 조건에서 phycobiliproteins 및 엽록소 거동을 연구하는 첫 번째 접근 방식을 가능하게 합니다.
얻은 데이터를 비교하고 다른 그래프에 플로팅하면 평균 형광 강도(MFI)의 유의미한 변화를 구별?...

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Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology

본 프로토콜은 스펙트럼 분석을 기반으로 홍조류의 phycobiliprotein 변화의 단계별 자가형광 이미징 및 평가를 설명합니다. 이것은 실험실 조건에서 희소한 물질만 사용할 수 있고 세포가 천천히 성장하거나 전혀 성장하지 않는 극한 서식지에 대한 세포 적응을 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴 방법입니다.

홍조류 생리학을 평가하기 위한 자가형광 이미징

Red algae (Rhodophyta) contain phycobiliproteins and colonize habitats with dim light, however some (e.g., some Chroothece species) can also develop in ...

이 컨포칼 현미경 프로토콜은 안료의 자가형광을 사용하여 실험실에서 느리게 성장하는 극한 환경에서 미세조류의 생태학적 거동과 적응을 해석할 수 있도록 합니다. 이 기술은 침습적이지 않으며 화합물이 사용되지 않기 때문에 인공물을 최소화합니다. 독립 영양 생물의 색소의 성능과 그에 상응하는 성장을 알면 관광 동굴과 건축 기념물에 가장 큰 관심을 갖는 제어 방법을 설계 할 수 있습니다.Chroothece mobilis의 접종물을 한천 배양에서 해수 배지 또는 SWES 액체 배지로 옮겨 준비하기 시작합니다. 모든 배양물을 낮은 백색광 강도 하에서 섭씨 20도에서 16 내지 8의 밝은 어두운 사진 주기로 2주 동안 유지하고 원하는 세포 밀도가 얻어질 때까지 진탕하지 않고 유지한다. 1 밀리리터의 지수 페이즈 배양물을 사용하여 10 내지 3 밀리리터 당 세포 밀도를 5배로 하여 상이한 실험을 위해 24-웰 플레이트에 접종한다.단색 조명 효과를 재현하려면 녹색 필터를 사용하여 녹색 빛이 470에서 570 나노 미터까지 통과하고 506 나노 미터 파장에서 피크가 있고 590에서 720 나노 미터 사이의 필터를 사용하여 조정 된 적색광과 678 나노 미터에서 피크를 사용합니다. 세포 배양액을 이 빛에 2주 동안 노출시킨다. 레이저를 포함한 도립 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경의 모든 구성 요소를 켭니다.이미징을 위해 24-웰 플레이트의 각 실험 웰에서 SWES 성장 배지의 세포를 35mm 유리 바닥 접시에 장착합니다. 63X 또는 1.30 개구수 조리개 또는 NA 글리세롤 이멀젼 대물렌즈를 선택하고 렌즈 위에 글리세롤을 놓습니다. 다음으로, 현미경 스테이지에 웰 플레이트를 놓아 이미지 획득 중에 표본이 움직이지 않도록 합니다.표본을 빛의 경로 중앙에 놓고 형광 강도가 가장 높은 평면을 선택하여 세포 중심에 초점을 맞춥니다. 완료되면 이미지 획득 소프트웨어를 열고 획득 모드의 드롭다운 목록에서 XY lambda를 선택합니다. 레이저 561 나노 미터, 8 비트의 다이내믹 레인지 및 1024 x 1024 픽셀의 여기 라인을 선택하십시오.570 내지 760 나노미터 범위 내에서 10 나노미터 대역폭 및 4 나노미터의 람다 스텝 크기에서 형광 방출 스펙트럼을 수집한다. 하나의 에어 유닛에 핀홀을 설정하고 람다 스캔 수집을 실행합니다. 다른 시야와 빨간색과 녹색 표시등의 다른 조건에서 이 과정을 반복한 후 모든 데이터를 저장합니다.람다 스캔이 수집되면 소프트웨어 상단의 정량화 창을 클릭하여 수집된 형광 방출 스펙트럼을 평가합니다. 열려 있는 프로젝트 창으로 이동하여 하나의 XY 람다 파일을 선택합니다. 이미징 소프트웨어에서 스택형 프로파일 분석을 선택하고 셀 중앙에 4마이크로미터 정사각형의 관심 영역을 정의하여 평균 형광 강도를 분석합니다.다른 조건에서 다른 셀로 프로세스를 반복하기 전에 데이터와 CSV를 내보냅니다. 그런 다음 CSV 파일을 열어 CSV 파일에서 각각 phycoerythrin phycocyanobilin, C.phycocyanin, allophycocyanin 및 chlorophyll A의 최대 형광 데이터를 선택하여 측정된 모든 관심 영역의 다른 형광 방출 피크를 선택합니다. 완료되면 각 phycobiliprotein 및 엽록소 피크에서 얻은 모든 최대 형광 값이 포함된 새 테이블을 만들고 데이터를 그래프에 표시합니다.평균 형광 강도의 유의한 차이가 관찰되었습니다. phycoerythrin phycocyanobilin의 평균 형광 강도는 세포가 단색 녹색광에 노출되었을 때 유의하게 감소했습니다. 대조적으로, 대조군과 비교하여 적색광에서는 차이가 관찰되지 않았다.녹색 빛은 알로피코시아닌과 엽록소 A에 반대 효과를 나타냈는데, 이는 특히 안테나 복합체의 양 증가 또는 연결성 향상으로 인한 안테나 복합체의 적응으로 인해 평균 형광 강도가 크게 증가했습니다. 적색광은 알로피코시아닌과 엽록소 형광의 유의하지 않은 증가를 일으켰습니다. 다양한 성장 조건이 배양 중인 세포에 미치는 영향을 연구하려면 정확히 동일한 현미경 설정으로 측정을 수행하는 것이 중요합니다.자가형광 유기체의 배양과 관련된 다른 환경 파라미터와 가시광선 스펙트럼 내의 형광 신호를 분석할 수 있습니다. 이 기술은 여러 자가형광 색소를 갖는 연구 생명체 유기체에 대한 매우 강력한 접근 방식입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

연구

생물학

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

크레이 피쉬 오프너 근육의 NMJ에서 역사보기 및 생리학 시범

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

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식물과 녹조류의 빛 수확 단지의 체외의 재구성에

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

생리학 실험실 데모 : 쥐의 사구체 여과 속도

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

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Intracavernosal 압력 기록 설치류에 발기 기능을 평가 하

Erectile dysfunction (ED) is defined as the inability to attain or keep an erection of the penis, and this has become a prevalent male sexual disorder. ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

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Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

단 세포 변화 조류의 클론 문화 설립

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Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...