Name: autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology
Uploaded: 2023-02-17T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology at JoVE.com

Denne forskningen ble utført som en del av prosjektene TIN2015-68454-R og 20961/PI/18, finansiert av det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne og Seneca-stiftelsen i Murcia-regionen. Irene Hernández Martínez og Francisco Javier Ibáñez López fra seksjonen for statistisk støtte ved vitenskaps- og forskningsområdet ved Murcia universitet (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (figur 1 ) er tegnet med bilder fra Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier er lisensiert med Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)

Algearten Chroothece mobilis ble brukt i denne studien. Arten ble hentet fra kultursamlingen Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. En oversikt over protokollen er vist i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64533/64533fig01.jpg"> Figur 1: Oversikt over studien. Chroothece mobilis inkuberes under ekstreme habitatforhold, ...

<ol>
	<li>Vis, M. L., Necchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , (2021).</li><li>Aboal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+Chroothece+(Rhodophyta,+Stylonematales)+including+two+new+species.">Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species.</a> European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).</li><li>Millach, L., Obiol, A., Sol&#233;, A., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+analyse+in+vivo+the+physiological+state+and+cell+viability+of+phototrophic+microorganisms+by+confocal+laser+scanning+microscopy+using+a+dual+laser.">A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser.</a> Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).</li><li>Millach, L., Villagrasa, E., Sol&#233;, A., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+confocal+laser+scanning+microscopy+techniques+for+a+rapid+assessment+of+the+effect+and+cell+viability+of+Scenedesmus+sp.+DE2009+under+metal+stress.">Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress.</a> Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).</li><li>Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phytoplankton+pigments+by+excitation+spectra+of+fluorescence.">Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence.</a> Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , (2000).</li><li>Beutler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorometric+method+for+the+differentiation+of+algal+populations+in+vivo+and+in+situ.">A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ.</a> Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).</li><li>Grigoryeva, N., Chistyakova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopic+spectroscopy+for+investigation+and+monitoring+of+biological+diversity+and+physiological+state+of+cyanobacterial+cultures.">Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures.</a> Cyanobacteria. , (2018).</li><li>Grigoryeva, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).</li><li>Rold&#225;n, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hern&#225;ndez-Marin&#233;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+pigment+identification+in+single+cells+from+living+phototrophic+biofilms+by+confocal+imaging+spectrofluorometry.">Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).</li><li>Hense, B. A., Gais, P., J&#252;tting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescence+information+for+automated+phytoplankton+investigation+by+image+analysis.">Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis.</a> Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).</li><li>Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+absorbance+and+fluorescence+spectra+to+discriminate+microalgae.">Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae.</a> European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).</li><li>Richardson, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+fluorometric+characterization+of+phytoplankton+community+composition+using+the+Algae+Online+Analyser.">Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser.</a> Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).</li><li>Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+induced+fluorescence+imaging:+application+to+groups+of+macroalgae+identification.">Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).</li><li>Coronado-Parra, T., Rold&#225;n, M., Aboal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+in+ecophysiological+studies+of+algae:+a+door+to+understanding+autofluorescence+in+red+algae.">Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae.</a> Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).</li><li>Mulec, J., Kosi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampenflora+algae+and+methods+of+growth+control.">Lampenflora algae and methods of growth control.</a> Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).</li><li>Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+relationships+of+nonaxenic+filamentous+cyanobacterial+strains+based+on+16S+rRNA+sequence+analysis.">Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis.</a> Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).</li><li>Rold&#225;n, M., Oliva, F., G&#243;nzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hern&#225;ndez-Marin&#233;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+green+light+influence+the+fluorescence+properties+and+structure+of+phototrophic+biofilms.">Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).</li><li>Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+marine+macroalgae+by+fluorescence+signatures.">Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures.</a> International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).</li><li>Rold&#225;n, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+fingerprints+of+endolithic+phototrophic+cyanobacteria+living+within+halite+rocks+in+the+atacama+desert.">Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).</li><li>Sol&#233;, A., Diestra, E., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+image+analysis+for+cyanobacterial+biomass+determined+at+microscale+level+in+different+microbial+mats.">Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats.</a> Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).</li><li>Ram&#237;rez, O., Garc&#237;a, A., Rojas, R., Couve, A., H&#228;rtel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+displacement+algorithm+determines+true+and+random+colocalization+in+fluorescence+microscopy.">Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).</li><li>Universität Gottingen-Georg-August. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAG+Culture+Collection+of+Algae.">SAG Culture Collection of Algae.</a> Universität Gottingen-Georg-August. , (2022).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+cell+counting+method+for+Neubauer+counting+chamber.">Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).</li><li>Wolf, E., Sch&#252;&#223;ler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobiliprotein+fluorescence+of+Nostoc+punctiforme+changes+during+the+life+cycle+and+chromatic+adaptation:+Characterization+by+spectral+confocal+laser+scanning+microscopy+and+spectral+unmixing.">Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing.</a> Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).</li><li>Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+confocal+microscopy+spectral+imaging+systems:+Use+of+multispectral+beads.">Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads.</a> Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).</li><li>Field, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovering Statistics Using R. , (2013).</li><li>Linnet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+paired+t-test+for+evaluation+of+method+comparison+data.">Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data.</a> Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).</li><li>Rosner, B., Grove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Mann-Whitney+U-test+for+clustered+data.">Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data.</a> Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).</li><li>Colin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+living+plant+cell:+from+probes+to+quantification.">Imaging the living plant cell: from probes to quantification.</a> The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).</li><li>Borlinghaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+white+confical:+continuous+spectral+tuning+in+excitation+and+emission.">The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission.</a> Optical Fluorescence Microscopy. , (2011).</li></ol>

Noen encellede eller koloniale røde alger, som Chroothece, vokser sakte in vitro, men inneholder flere autofluorescerende forbindelser som kan analyseres ved spektralanalyse under et konfokalmikroskop, hvor forskjeller i pigmentutslippstopper kan oppdages. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi har gitt oss mulighet til å gjennomføre in vivo-studier for å evaluere tilpasning eller akklimatisering av fotosyntetiske organismer 8,10,17,18,19,20.<sup class="x...

Rødalger, som slekten Chroothece, kan vokse i ekstreme habitater, hvor de ofte må takle markerte miljøendringer1. Flom og tørke er hyppige i halvtørre områder der denne slekten kan bli funnet, og noen arter har blitt rapportert i bekker, klipper, grotter eller til og med termisk vann2. Men mesteparten av tiden, biologiske variabler, som konkurranse eller beite, henviser arter til ikke-optimale forhold for deres vekst. Siden disse organismene ofte er vanskelige å dyrke og enten ikke vokser eller vokser veldig sakte under laboratorieforhold, er en stor begrensning den tilgjengelige prøvestørrelsen. Derfor er det svært viktig å følge ikke-destruktive metoder eller metoder som involverer minimal prøvemanipulasjon 3,4.
De fysiologiske ferdighetene som trengs for å overleve i disse tøffe miljøene, kan overvåkes ved å følge endringer i deres fotosyntetiske systemer. Metabolske mekanismer, fotosyntetisk effektivitet og følsomhet for lys- eller kulturforhold kan avsløres av pigmentfluorescensutslippsprofiler på grunn av nøyaktige endringer i energioverføring eller fangst 5,6,7,8.
Autofluorescens av cellulære forbindelser kan brukes som markør for cytodiagnose eller som en naturlig indikator på cellulær tilstand eller metabolisme som respons på eksterne og interne signaler gjennom endringer i utslipp9. Det kan også brukes til å diskriminere taksonomisk forskjellige grupper av fotosyntetiske organismer10. Avhengig av den fylogenetiske posisjonen til fototrofe mikroorganismer, kan man finne forskjellige in vivo fluorescensfunksjoner. Derfor har en taksonomisk identifikasjon basert på in vivo-egenskapene til fototrofisk fluorescens (inkludert fluorescensabsorpsjon og emisjonsspektra) blitt forsøkt ved flere anledninger11,12. På grunn av mangfoldet i tilbehørspigmenter blant fytoplankton taxa, kan forskjeller i bølgelengdene der klorofyll a (Chl a) fluorescens stimuleres, eller forskjeller i utslippsspektra, brukes til å utlede taksonomi13. In vivo fluorescenseksitasjon og utslippsspektra av disse prøvene er ikke bare avhengig av algerens fyla, men også på fotosystemtilpasning14. Effektiviteten av energioverføring til Chl a, eller forholdet mellom Chl a og tilbehørspigmenter, og det cellulære pigmentinnholdet er følsomt for vekstforhold5.
Røde alger, spesielt Chroothece, har flere tilbehør fluorescerende pigmenter-phycobiliproteins og karotenoider; Det tidligere konsentratet i fykobilisomer festet til thylakoider av kloroplaster. Phycobiliproteins (phycocyanin, phycoerythrin, og allophycocyanin) kan fange lys ved forskjellige bølgelengder og overføre det til Chl a, noe som gjør fotosyntese i svært forskjellige lys- og kulturforhold mulig15. For eksempel kan Chroothece-arter vokse inne i huler eller nesten dukke opp i litt saltholdige kalkholdige bekker2.
Monokromatiske lys påvirker veksten og pigmentsammensetningen av fotosyntetiske organismer, og har blitt studert for å forhindre eller kontrollere veksten av fotosyntetiske organismer i huler. Mulec et al. viste at rød beriket belysning fremmer veksten av cyanobakterier, alger og planter16. Tidligere studier har også rapportert at grønt lys påvirker pigmentsammensetningen av cyanobakterier17, mens andre har avslørt at grønt lys forhindrer veksten av de fleste fotosyntetiske organismer, og noen cyanobakterier viser en reduksjon i thylakoider og svakere gjennomsnittlig fluorescensintensitet18.
For å forstå Chrootheces evne som modellorganisme til å overvinne tøffe forhold, har dyrkede celler blitt utsatt for økende lysintensitet og monokromatisk lys (grønt eller rødt)15, for å se hvordan det takler de svake forholdene i huler (hvor rødt lys dominerer). Protokollen som presenteres her, reproduserer effekten av de ovennevnte variablene på Chrootheces fykobiliproteiner på cellenivå ved bruk av sin egen autofluorescens.
I dag brukes fluorescens ofte som et verktøy for å studere de fysiologiske responsene til karplanter, mikroalger, makroalger og cyanobakterier13,14,16. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi er et ypperlig verktøy for in vivo-studier for å evaluere fotosyntetiske prøvers fysiologi på enkeltcellenivå 10,17,18,19,20, ved å unngå problemer forbundet med den lave veksthastigheten i laboratoriet og vanskelighetene med å skaffe nok biomasse til tilhørende ekstraksjon og biokjemiske metoder8 . Når cellene er behandlet under forskjellige dyrkningsbetingelser i 2 uker, kan lambda-skanningsprofilen måles in vivo. Selv om det er flere publikasjoner der forskjellige bølgelengder av eksitasjon ved konfokal avbildning har blitt brukt 3,4,10,17, kan de fleste fykobiliproteiner og Chl a detekteres ved hjelp av en 561 nm bølgelengde eksitasjonslinje, og den oppdagede utslippet varierer fra 570 til 760 nm bølgelengde. Disse kriteriene er basert på en analyse tidligere utført 10 med kommersielle rene pigmenter (tabell 1) ved konfokal avbildning og de oppnådde resultatene i forskjellige algearter20,21,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Pigmenter</td>
			<td rowspan="2">λflmax (nm)</td>
			<td colspan="8">λ exc (nm)</td>
		</tr><tr><td>351</td>
			<td>364</td>
			<td>458</td>
			<td>476</td>
			<td>488</td>
			<td>514</td>
			<td>543</td>
			<td>633</td>
		</tr><tr><td>Chl en</td>
			<td>660.9-678.1</td>
			<td>43,4 ± 1,8</td>
			<td>11,2 ± 0,2</td>
			<td>1,8 ± 0,05</td>
			<td>2,0 ± 0,08</td>
			<td>12,2 ± 0,7</td>
			<td>6,0 ± 0,3</td>
			<td>4,2 ± 0,16</td>
			<td>80,7 ± 1,5</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">R-PE</td>
			<td>569.2-583.3</td>
			<td>5,9 ± 0,6</td>
			<td>5,9 ± 0,16</td>
			<td>11,1 ± 0,04</td>
			<td>42,2 ± 0,3</td>
			<td>100,0 ± 0</td>
			<td>90,0 ± 0,3</td>
			<td>99,2 ± 0,08</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>652.1-668.6</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1,5 ± 0,01</td>
			<td>3,7 ± 0,04</td>
			<td>26,7 ± 0,5</td>
			<td>8,7 ± 0,16</td>
			<td>11,1 ± 0,16</td>
			<td>11,3 ± 0,2</td>
		</tr><tr><td>C-PC</td>
			<td>636.2-676.4</td>
			<td>2,3 ± 0,04</td>
			<td>1,0 ± 0,01</td>
			<td>0,6 ± 0,004</td>
			<td>0,7 ± 0,008</td>
			<td>2,0 ± 0,08</td>
			<td>2,0 ± 0,04</td>
			<td>3,3 ± 0,16</td>
			<td>33,6 ± 0,9</td>
		</tr><tr><td>APC-XL</td>
			<td>667.3-683.8</td>
			<td>15.1 ± 1.5</td>
			<td>9,6 ± 0,98</td>
			<td>1,0 ± 0,04</td>
			<td>1,2 ± 0,08</td>
			<td>5,9 ± 0,7</td>
			<td>4,1 ± 0,5</td>
			<td>23,2 ± 3,5</td>
			<td>91,4 ± 2,3</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Den rene pigmentinformasjonen som ble brukt til å kjøre lambda-skanningsanalysen. Denne tabellen viser utslippstopper og skuldre/fluorescensbåndmaksima for forskjellige fluorokromer/pigmenter ved konfokal avbildningsspektrofotometri for alle eksitasjonsbølgelengder, og prosentandelen lysutslipp fra pigmenter/fluorokrom. Verdiene ble beregnet med formelen: = MFI*100/255. Hver verdi er gjennomsnittet ± SE (gjennomsnitt ± standardfeil fra gjennomsnittet). Rene pigmenter ble brukt til kalibrering av konfokalskanningslasermikroskopet som følger: 1,2,10. Klorofyll a ble hentet fra Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) fra Porphyra tenera, og C-phycocyanin (C-PE) fra Spirulina sp. Alle artene ble oppløst i filtrert destillert vann. Allophycocyanin-XL (APC-XL) ble oppnådd fra Mastigocladus laminosus, som ble oppløst i ammoniumsulfat (60%) og kaliumfosfat (pH = 7) for å oppnå en konsentrasjon på 38 mM. Skanningene ble utført med 400 μL av hver pigmentløsning (konsentrasjon på 1 mg/ml) ved bruk av et bunnkammer med 8 brønner i glass.
Studien av en enkelt eksitasjonsbølgelengde er ganske nyttig første tilnærming. I dette tilfellet er det imidlertid nødvendig å belyse det relative bidraget til de forskjellige kompleksene i fluorescenssignalet, som anbefales å utføre et fluorescensforhold eller spektrumanalyse ved flere bølgelengder, blant andre metoder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>81158</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 black well plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>82406</td>
			<td>&#160;flat and clear bottom for high throughput microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algae Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15380591</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>506353</td>
			<td>Glycerol immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software. LAS X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>FL40SSENW/37MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum photoradiometer</td>
			<td>DeltaOhm&#160;</td>
			<td>DO 9721</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>R Core Team, 2020</td>
			<td>4.0.2.</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SWES medium</td>
			<td>University of Murcia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type G Immersion liquid</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11513910</td>
			<td>Glycerol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology

Røde alger (Rhodophyta) inneholder phycobiliproteins og koloniserer habitater med svakt lys, men noen (f.eks. Noen Chroothece-arter ) kan også utvikle seg i fullt solskinn. De fleste rhodofytter er røde, men noen kan virke blåaktige, avhengig av andelen blå og røde biliproteiner (phycocyanin og phycoerythrin). Ulike phycobiliproteiner kan fange lys ved forskjellige bølgelengder og overføre det til klorofyll a, noe som gjør fotosyntese under svært forskjellige lysforhold mulig. Disse pigmentene reagerer på habitatendringer i lys, og deres autofluorescens kan bidra til å studere biologiske prosesser. Ved å bruke Chroothece mobilis som modellorganisme og spektral lambda-skanningsmodus i et konfokalmikroskop, ble tilpasningen av fotosyntetiske pigmenter til forskjellige monokromatiske lys studert på mobilnivå for å gjette artens optimale vekstforhold. Resultatene viste at selv når den studerte stammen ble isolert fra en hule, tilpasset den seg både svake og middels lysintensiteter. Den presenterte metoden er spesielt nyttig for å studere fotosyntetiske organismer som ikke vokser eller vokser veldig sakte under laboratorieforhold, noe som vanligvis er tilfelle for de som bor i ekstreme habitater.

Klorofyll a absorberer generelt blå og røde bølgelengder av synlig lys, mens phycobiliproteiner bruker grønne, gule og oransje bølgelengder7. Autofluorescensen av disse pigmentene gjør den første tilnærmingen til å studere fykobiliproteiner og klorofylladferd under eksperimentelle og feltforhold mulig.
Ved å sammenligne de oppnådde dataene og plotte på forskjellige grafer, kan man skille mellom signifikante endringer i gjennomsnittlig fluorescensintensitet (...

Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology at JoVE.com

Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology

Denne protokollen beskriver trinnvis autofluorescensavbildning og evaluering av fykobiliproteinendringer i rødalger basert på spektralanalyse. Dette er en etikettfri og ikke-destruktiv metode for å evaluere cellulær tilpasning til ekstreme habitater, når bare knappe materialer er tilgjengelige og celler vokser sakte, eller ikke i det hele tatt, under laboratorieforhold.

Autofluorescensavbildning for å evaluere rødalgefysiologi

Red algae (Rhodophyta) contain phycobiliproteins and colonize habitats with dim light, however some (e.g., some Chroothece species) can also develop in ...

Denne konfokale mikroskopiske protokollen vil tillate tolkning av økologisk oppførsel og tilpasninger av mikroalger fra ekstreme miljøer med sakte voksende i laboratoriet ved bruk av autofluorescens av deres pigmenter. Denne teknikken er ikke invasiv og minimerer artefakter da kjemiske forbindelser ikke brukes. Å vite ytelsen til pigmenter av autotrofer og tilsvarende vekst vil tillate utforming av kontrollmetoder, som er den største interessen for turistgrotter og arkitektoniske monumenter.Begynn å forberede inokulumet til Chroothece mobilis ved å overføre det fra agarkulturen til sjøvannsmediet eller SWES flytende medium. Oppretthold alle kulturer i to uker med en 16 til 8 lys mørk fotoperiode ved 20 grader Celsius under lav hvit lysintensitet og uten å riste til ønsket celletetthet er oppnådd. Bruk en milliliter av eksponentiell fasekultur som har fem ganger 10 til de tredje cellene per milliliter celletetthet for å inokulere i en 24-brønnplate for forskjellige eksperimenter.For å reprodusere den monokromatiske lyseffekten, bruk det grønne filteret slik at grønt lys kan passere gjennom fra 470 til 570 nanometer med en topp på 506 nanometer bølgelengde og til rødt lys justert ved hjelp av et filter mellom 590 og 720 nanometer og topper ved 678 nanometer. Utsett cellekulturer for dette lyset i to uker. Slå på alle komponentene i det inverterte konfokale laserskanningsmikroskopet, inkludert laseren.Monter cellene i SWES-vekstmediet fra hver eksperimentelle brønn på 24-brønnsplaten til en 35 millimeter glassbunnskål for avbildning. Velg 63X eller 1.30 numerisk blenderåpning eller NA glyserol nedsenking mål og plasser glyserol over linsen. Deretter plasserer du brønnplaten på mikroskoptrinnet slik at prøven ikke beveger seg under bildeopptaket.Sentrer prøven i lysbanen og fokuser på midten av cellen ved å velge planet med høyest fluorescensintensitet. Når du er ferdig, åpner du programvaren for bildeinnsamling og velger XY lambda fra rullegardinlisten i anskaffelsesmodus. Velg eksitasjonslinjen til laseren 561 nanometer, åtte biter dynamisk område og 1024 x 1024 piksler.Samle fluorescensutslippsspektrene i 10 nanometer båndbredde og lambda-trinnstørrelsen på fire nanometer innenfor 570 til 760 nanometerområdet. Sett knappenålshullet på en luftenhet og kjør lambda-skanningen. Etter å ha gjentatt denne prosessen i forskjellige synsfelt og under de forskjellige forholdene med røde og grønne lys, lagrer du alle dataene.Når lambda-skanningen er anskaffet, klikker du på kvantifiseringsvinduet øverst i programvaren for å evaluere de innsamlede fluorescensutslippsspektrene. Gå til det åpne prosjektvinduet og velg en XY lambda-fil. Velg stablet profilanalyse i bildebehandlingsprogramvaren og definer et interesseområde på fire mikrometer kvadrat i midten av en celle for å analysere gjennomsnittlig fluorescensintensitet.Eksporter dataene og CSV før du gjentar prosessen med forskjellige celler under forskjellige forhold. Deretter åpner du CSV-filene for å velge de forskjellige fluorescensutslippstoppene for alle de målte områdene av interesse ved å velge maksimale fluorescensdata for henholdsvis phycoerythrin, phycocyanobilin, C.phycocyanin, allophycocyanin og chlorophyll A i CSV-filen. Når du er ferdig, opprett en ny tabell med alle maksimale fluorescensverdier oppnådd fra hver phycobiliprotein og klorofylltopp og plott dataene på en graf.Signifikante forskjeller i gjennomsnittlig fluorescensintensitet ble observert. Den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten av phycoerythrin phycocyanobilin ble signifikant redusert når cellene ble utsatt for monokromatisk grønt lys. Derimot ble det ikke observert noen forskjell i rødt lys sammenlignet med kontrollen.Det grønne lyset hadde motsatt effekt på allophycocyanin og klorofyll A, hvor gjennomsnittlig fluorescensintensitet økte betydelig på grunn av tilpasning av antennekomplekser på grunn av økt mengde eller forbedret tilkobling av antennekompleksene, blant andre. Det røde lyset ga en ikke-signifikant økning i allophycocyanin og klorofyllfluorescens. For å studere effekten av forskjellige vekstbetingelser på celler i kultur, er det avgjørende å utføre målingene med nøyaktig de samme mikroskopinnstillingene.Det er mulig å analysere andre miljøparametere som er relevante for kulturen av autofluorescensorganismer, samt fluorescenssignalet innenfor det synlige spektret. Denne teknikken er en veldig kraftig tilnærming til et studielivsorganismer med flere autofluorescenspigmenter.

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-basert Måling av Store-opererte Calcium Entry i levende celler: fra Helstøpt Cancer Cell til Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Giant Liposome Forberedelse til Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Rekonstituering of Light innhøsting Komplekser av planter og grønne alger

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Fysiologi Lab demonstrasjon: glomerulusfiltrasjon i en rotte

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Intracavernosal Pressure Recording to Evaluate Erectile Function in Rodents

Intracavernosal press opptak evaluere erektil funksjon i gnagere

Erectile dysfunction (ED) is defined as the inability to attain or keep an erection of the penis, and this has become a prevalent male sexual disorder. ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Kvantifisering av Lipid overflod og evaluering av Lipid distribusjon i Caenorhabditis elegans av Nilen rød og olje Red O flekker

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Av en klonal kultur av encellede bøye alger

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolering av netthinnen arterioler for Ex Vivo celle fysiologi studier

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...