Name: autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology
Uploaded: 2023-02-17T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology at JoVE.com

Esta investigación se ha realizado en el marco de los proyectos TIN2015-68454-R y 20961/PI/18, financiados por el Ministerio de Economía y Competitividad y la Fundación Séneca de la Región de Murcia. Irene Hernández Martínez y Francisco Javier Ibáñez López de la Sección de Apoyo Estadístico del Área Científica y de Investigación de la Universidad de Murcia (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (Figura 1 ) se dibujaron utilizando imágenes de Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier está bajo una licencia Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)

Para el presente estudio se utilizó la especie de alga Chroothece mobilis . La especie se obtuvo de la colección de cultivo de Microalgas Edáficas SE España, MAESE 20.29. En la figura 1 se muestra una descripción general del protocolo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64533/64533fig01.jpg"> Figura 1: Resumen del estudio. Chroothe...

<ol>
	<li>Vis, M. L., Necchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , (2021).</li><li>Aboal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+Chroothece+(Rhodophyta,+Stylonematales)+including+two+new+species.">Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species.</a> European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).</li><li>Millach, L., Obiol, A., Sol&#233;, A., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+analyse+in+vivo+the+physiological+state+and+cell+viability+of+phototrophic+microorganisms+by+confocal+laser+scanning+microscopy+using+a+dual+laser.">A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser.</a> Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).</li><li>Millach, L., Villagrasa, E., Sol&#233;, A., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+confocal+laser+scanning+microscopy+techniques+for+a+rapid+assessment+of+the+effect+and+cell+viability+of+Scenedesmus+sp.+DE2009+under+metal+stress.">Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress.</a> Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).</li><li>Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+phytoplankton+pigments+by+excitation+spectra+of+fluorescence.">Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence.</a> Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , (2000).</li><li>Beutler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorometric+method+for+the+differentiation+of+algal+populations+in+vivo+and+in+situ.">A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ.</a> Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).</li><li>Grigoryeva, N., Chistyakova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopic+spectroscopy+for+investigation+and+monitoring+of+biological+diversity+and+physiological+state+of+cyanobacterial+cultures.">Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures.</a> Cyanobacteria. , (2018).</li><li>Grigoryeva, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).</li><li>Roshchina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+autofluorescence:+application+to+the+study+of+plant+living+cells.">Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells.</a> International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).</li><li>Rold&#225;n, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hern&#225;ndez-Marin&#233;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+pigment+identification+in+single+cells+from+living+phototrophic+biofilms+by+confocal+imaging+spectrofluorometry.">Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).</li><li>Hense, B. A., Gais, P., J&#252;tting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescence+information+for+automated+phytoplankton+investigation+by+image+analysis.">Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis.</a> Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).</li><li>Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+absorbance+and+fluorescence+spectra+to+discriminate+microalgae.">Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae.</a> European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).</li><li>Richardson, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+fluorometric+characterization+of+phytoplankton+community+composition+using+the+Algae+Online+Analyser.">Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser.</a> Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).</li><li>Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+induced+fluorescence+imaging:+application+to+groups+of+macroalgae+identification.">Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).</li><li>Coronado-Parra, T., Rold&#225;n, M., Aboal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy+in+ecophysiological+studies+of+algae:+a+door+to+understanding+autofluorescence+in+red+algae.">Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae.</a> Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).</li><li>Mulec, J., Kosi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampenflora+algae+and+methods+of+growth+control.">Lampenflora algae and methods of growth control.</a> Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).</li><li>Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+relationships+of+nonaxenic+filamentous+cyanobacterial+strains+based+on+16S+rRNA+sequence+analysis.">Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis.</a> Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).</li><li>Rold&#225;n, M., Oliva, F., G&#243;nzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hern&#225;ndez-Marin&#233;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+green+light+influence+the+fluorescence+properties+and+structure+of+phototrophic+biofilms.">Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).</li><li>Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+marine+macroalgae+by+fluorescence+signatures.">Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures.</a> International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).</li><li>Rold&#225;n, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+fingerprints+of+endolithic+phototrophic+cyanobacteria+living+within+halite+rocks+in+the+atacama+desert.">Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).</li><li>Sol&#233;, A., Diestra, E., Esteve, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+image+analysis+for+cyanobacterial+biomass+determined+at+microscale+level+in+different+microbial+mats.">Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats.</a> Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).</li><li>Ram&#237;rez, O., Garc&#237;a, A., Rojas, R., Couve, A., H&#228;rtel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+displacement+algorithm+determines+true+and+random+colocalization+in+fluorescence+microscopy.">Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).</li><li>Universität Gottingen-Georg-August. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAG+Culture+Collection+of+Algae.">SAG Culture Collection of Algae.</a> Universität Gottingen-Georg-August. , (2022).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+cell+counting+method+for+Neubauer+counting+chamber.">Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).</li><li>Wolf, E., Sch&#252;&#223;ler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phycobiliprotein+fluorescence+of+Nostoc+punctiforme+changes+during+the+life+cycle+and+chromatic+adaptation:+Characterization+by+spectral+confocal+laser+scanning+microscopy+and+spectral+unmixing.">Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing.</a> Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).</li><li>Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+confocal+microscopy+spectral+imaging+systems:+Use+of+multispectral+beads.">Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads.</a> Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).</li><li>Field, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Discovering Statistics Using R. , (2013).</li><li>Linnet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+paired+t-test+for+evaluation+of+method+comparison+data.">Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data.</a> Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).</li><li>Rosner, B., Grove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Mann-Whitney+U-test+for+clustered+data.">Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data.</a> Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).</li><li>Colin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+living+plant+cell:+from+probes+to+quantification.">Imaging the living plant cell: from probes to quantification.</a> The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).</li><li>Borlinghaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+white+confical:+continuous+spectral+tuning+in+excitation+and+emission.">The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission.</a> Optical Fluorescence Microscopy. , (2011).</li></ol>

Algunas algas rojas unicelulares o coloniales, como Chroothece, crecen lentamente in vitro, pero contienen múltiples compuestos autofluorescentes que pueden analizarse mediante análisis espectral bajo un microscopio confocal, donde se pueden detectar diferencias en los picos de emisión de pigmentos. La microscopía de fluorescencia confocal espectral nos ha permitido realizar estudios in vivo para evaluar la adaptación o aclimatación de organismos fotosintéticos 8,10,17,18,19,20.<sup clas...

Las algas rojas, como el género Chroothece, pueden crecer en hábitats extremos, donde con frecuencia tienen que hacer frente a cambios ambientales marcados1. Las inundaciones y sequías son frecuentes en las regiones semiáridas donde se puede encontrar este género, y algunas especies han sido reportadas en arroyos, acantilados, cuevas o incluso aguas termales2. Sin embargo, la mayoría de las veces, las variables biológicas, como la competencia o el pastoreo, relegan a las especies a condiciones no óptimas para su crecimiento. Como estos organismos a menudo son difíciles de cultivar y no crecen o crecen muy lentamente en condiciones de laboratorio, una limitación importante es el tamaño de la muestra disponible. Por lo tanto, es muy importante seguir métodos no destructivos o métodos que impliquen una manipulación mínima de la muestra 3,4.
Las habilidades fisiológicas necesarias para sobrevivir en estos ambientes hostiles pueden ser monitoreadas siguiendo los cambios en sus sistemas fotosintéticos. Los mecanismos metabólicos, la eficiencia fotosintética y la sensibilidad a la luz o a las condiciones de cultivo pueden ser revelados por los perfiles de emisión de fluorescencia de pigmentos, debido a cambios precisos en su transferencia de energía o atrapamiento 5,6,7,8.
La autofluorescencia de compuestos celulares puede ser utilizada como marcador para el citodiagnóstico o como indicador natural del estado celular o metabolismo en respuesta a señales externas e internas a través de cambios en la emisión9. También se puede utilizar para discriminar taxonómicamente diferentes grupos de organismos fotosintéticos10. Dependiendo de la posición filogenética de los microorganismos fototróficos, se pueden encontrar diferentes características de fluorescencia in vivo. Por lo tanto, se ha intentado en varias ocasiones una identificación taxonómica basada en las características in vivo de la fluorescencia fototrófica (incluyendo espectros de absorción y emisión de fluorescencia)11,12. Debido a la diversidad de pigmentos accesorios entre los taxones de fitoplancton, las diferencias en las longitudes de onda en las que se estimula la fluorescencia de la clorofila a (Chl a), o las diferencias en los espectros de emisión, pueden usarse para inferir la taxonomía13. Los espectros de excitación y emisión de fluorescencia in vivo de estos especímenes dependen no sólo de los filos de algas, sino también de la adaptación del fotosistema14. La eficiencia de la transferencia de energía a Chl a, o la relación de Chl a a pigmentos accesorios, y el contenido de pigmento celular son sensibles a las condiciones de crecimiento5.
Las algas rojas, particularmente Chroothece, tienen varios pigmentos fluorescentes accesorios: ficobiliproteínas y carotenoides; Los primeros se concentran en ficobilisomas unidos a los tilacoides de los cloroplastos. Las ficobiliproteínas (ficocianina, ficoeritrina y aloficocianina) pueden capturar la luz en diferentes longitudes de onda y transmitirla a Chl a, lo que hace posible la fotosíntesis en condiciones de luz y cultivo muy diferentes15. Por ejemplo, las especies de Chroothece pueden crecer dentro de cuevas o casi emerger en arroyos calcáreos ligeramente salinos2.
Las luces monocromáticas afectan el crecimiento y la composición pigmentaria de los organismos fotosintéticos, y se han estudiado para prevenir o controlar el crecimiento de organismos fotosintéticos en cuevas. Mulec et al. demostraron que la iluminación enriquecida con rojo promueve el crecimiento de cianobacterias, algas y plantas16. Estudios previos también han reportado que la luz verde afecta la composición pigmentaria de las cianobacterias17, mientras que otros han revelado que la luz verde impide el crecimiento de la mayoría de los organismos fotosintéticos y algunas cianobacterias exhiben una reducción en los tilacoides y una intensidad de fluorescencia media más débil18.
Para comprender la capacidad de Chroothece como organismo modelo para superar condiciones difíciles, las células cultivadas han sido expuestas a intensidades de luz crecientes y luz monocromática (verde o roja)15, para ver cómo hace frente a las condiciones oscuras de las cuevas (donde predomina la luz roja). El protocolo aquí presentado reproduce el efecto de las variables antes mencionadas sobre las ficobiliproteínas de Chroothece a nivel celular utilizando su propia autofluorescencia.
Hoy en día, la fluorescencia se utiliza comúnmente como una herramienta para estudiar las respuestas fisiológicas de plantas vasculares, microalgas, macroalgas y cianobacterias13,14,16. La microscopía de fluorescencia confocal espectral es una excelente herramienta para estudios in vivo para evaluar la fisiología de las muestras fotosintéticas a nivel unicelular 10,17,18,19,20, evitando problemas asociados con la baja tasa de crecimiento en el laboratorio y las dificultades para obtener suficiente biomasa para los métodos de extracción y bioquímicos asociados8 . Una vez que las células se tratan bajo diferentes condiciones de cultivo durante 2 semanas, el perfil de exploración lambda se puede medir in vivo. Aunque hay varias publicaciones en las que se han utilizado diferentes longitudes de onda de excitación por imagen confocal 3,4,10,17, la mayoría de las ficobiliproteínas y Chl a se pueden detectar utilizando una línea de excitación de longitud de onda de 561 nm, y la emisión detectada varía de 570 a 760 nm de longitud de onda. Estos criterios se han basado en un análisis previamente realizado10 con pigmentos puros comerciales (Tabla 1) mediante imagen confocal y los resultados obtenidos en diferentes especies de algas20,21,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Pigmentos</td>
			<td rowspan="2">λflmáx. (nm)</td>
			<td colspan="8">λ exc (nm)</td>
		</tr><tr><td>351</td>
			<td>364</td>
			<td>458</td>
			<td>476</td>
			<td>488</td>
			<td>514</td>
			<td>543</td>
			<td>633</td>
		</tr><tr><td>Chl a</td>
			<td>660.9-678.1</td>
			<td>43,4 ± 1,8</td>
			<td>11,2 ± 0,2</td>
			<td>1,8 ± 0,05</td>
			<td>2,0 ± 0,08</td>
			<td>12,2 ± 0,7</td>
			<td>6,0 ± 0,3</td>
			<td>4.2 ± 0,16</td>
			<td>80,7 ± 1,5</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">R-PE</td>
			<td>569.2-583.3</td>
			<td>5,9 ± 0,6</td>
			<td>5,9 ± 0,16</td>
			<td>11,1 ± 0,04</td>
			<td>42,2 ± 0,3</td>
			<td>100,0 ± 0</td>
			<td>90,0 ± 0,3</td>
			<td>99,2 ± 0,08</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>652.1-668.6</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1,5 ± 0,01</td>
			<td>3,7 ± 0,04</td>
			<td>26,7 ± 0,5</td>
			<td>8,7 ± 0,16</td>
			<td>11,1 ± 0,16</td>
			<td>11,3 ± 0,2</td>
		</tr><tr><td>C-PC</td>
			<td>636.2-676.4</td>
			<td>2.3 ± 0.04</td>
			<td>1,0 ± 0,01</td>
			<td>0,6 ± 0,004</td>
			<td>0,7 ± 0,008</td>
			<td>2,0 ± 0,08</td>
			<td>2,0 ± 0,04</td>
			<td>3.3 ± 0.16</td>
			<td>33,6 ± 0,9</td>
		</tr><tr><td>APC-XL</td>
			<td>667.3-683.8</td>
			<td>15,1 ± 1,5</td>
			<td>9,6 ± 0,98</td>
			<td>1,0 ± 0,04</td>
			<td>1.2 ± 0.08</td>
			<td>5,9 ± 0,7</td>
			<td>4.1 ± 0.5</td>
			<td>23,2 ± 3,5</td>
			<td>91,4 ± 2,3</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: La información de pigmento puro utilizada para ejecutar el análisis de escaneo lambda. Esta tabla muestra los picos de emisión y los hombros / máximos de banda de fluorescencia de diferentes fluorocromos / pigmentos por espectrofotometría de imagen confocal para todas las longitudes de onda de excitación, y el porcentaje de emisión de luz por pigmentos / fluorocromos. Los valores se calcularon mediante la fórmula: = MFI*100/255. Cada valor es la media ± SE (media ± error estándar de la media). Se utilizaron pigmentos puros para calibrar el microscopio láser de barrido confocal de la siguiente manera 1,2,10. La clorofila a se obtuvo de Spinacia oleracea, R-ficoeritrina (R-PE) de Porphyra tenera y C-ficocianina (C-PE) de Spirulina sp. Todas las especies fueron disueltas en agua destilada filtrada. La aloficocianina-XL (APC-XL) se obtuvo de Mastigocladus laminosus, que se disolvió en sulfato de amonio (60%) y fosfato de potasio (pH = 7) para alcanzar una concentración de 38 mM. Las exploraciones se realizaron con 400 μL de cada solución pigmentaria (concentración de 1 mg/ml) utilizando una cámara inferior de vidrio cubierta de 8 pocillos.
El estudio de una sola longitud de onda de excitación es una primera aproximación bastante útil. En este caso, sin embargo, es necesario dilucidar la contribución relativa de los diferentes complejos en la señal de fluorescencia, lo que se recomienda para realizar una relación de fluorescencia o análisis de espectro a varias longitudes de onda, entre otros métodos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35 mm, high Glass Bottom</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>81158</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 black well plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>82406</td>
			<td>&#160;flat and clear bottom for high throughput microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algae Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15380591</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>green filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>506353</td>
			<td>Glycerol immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software. LAS X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8 TCS</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>FL40SSENW/37MLR-352-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum photoradiometer</td>
			<td>DeltaOhm&#160;</td>
			<td>DO 9721</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>R Core Team, 2020</td>
			<td>4.0.2.</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red filter</td>
			<td>PNTA, LEE filters</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SWES medium</td>
			<td>University of Murcia</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type G Immersion liquid</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11513910</td>
			<td>Glycerol&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate red algae physiology

Las algas rojas (Rhodophyta) contienen ficobiliproteínas y colonizan hábitats con poca luz, sin embargo, algunas (por ejemplo, algunas especies de Chroothece ) también pueden desarrollarse a pleno sol. La mayoría de las rodófitas son rojas, sin embargo, algunas pueden aparecer azuladas, dependiendo de la proporción de biliproteínas azules y rojas (ficocianina y ficoeritrina). Diferentes ficobiliproteínas pueden capturar la luz en diversas longitudes de onda y transmitirla a la clorofila a, lo que hace posible la fotosíntesis en condiciones de luz muy diferentes. Estos pigmentos responden a los cambios de hábitat en la luz, y su autofluorescencia puede ayudar a estudiar los procesos biológicos. Utilizando Chroothece mobilis como organismo modelo y el modo de escaneo lambda espectral en un microscopio confocal, se estudió la adaptación de pigmentos fotosintéticos a diferentes luces monocromáticas a nivel celular para adivinar las condiciones óptimas de crecimiento de la especie. Los resultados mostraron que, incluso cuando la cepa estudiada se aisló de una cueva, se adaptó a intensidades de luz tenue y media. El método presentado es especialmente útil para estudiar organismos fotosintéticos que no crecen o crecen muy lentamente en condiciones de laboratorio, que suele ser el caso de aquellos que viven en hábitats extremos.

La clorofila a generalmente absorbe longitudes de onda azules y rojas de la luz visible, mientras que las ficobiliproteínas usan longitudes de onda verde, amarilla y naranja7. La autofluorescencia de estos pigmentos hace posible el primer enfoque para estudiar las ficobiliproteínas y el comportamiento de la clorofila en condiciones experimentales y de campo.
Al comparar los datos obtenidos y trazar en diferentes gráficos, se pueden distinguir cambios significativos e...

Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology at JoVE.com

Autofluorescence Imaging to Evaluate Red Algae Physiology

El presente protocolo describe imágenes de autofluorescencia paso a paso y la evaluación de los cambios de ficobiliproteína en algas rojas basadas en análisis espectral. Este es un método no destructivo y sin etiquetas para evaluar la adaptación celular a hábitats extremos, cuando solo hay material escaso disponible y las células crecen lentamente, o no crecen en absoluto, en condiciones de laboratorio.

Imágenes de autofluorescencia para evaluar la fisiología de las algas rojas

Red algae (Rhodophyta) contain phycobiliproteins and colonize habitats with dim light, however some (e.g., some Chroothece species) can also develop in ...

Este protocolo microscópico confocal permitirá la interpretación del comportamiento ecológico y las adaptaciones de microalgas de ambientes extremos con crecimiento lento en el laboratorio utilizando la autofluorescencia de sus pigmentos. Esta técnica no es invasiva y minimiza los artefactos ya que no se utilizan compuestos químicos. Conocer el rendimiento de los pigmentos de los autótrofos y el crecimiento correspondiente permitirá diseñar los métodos de control que son los de mayor interés para las cuevas turísticas y los monumentos arquitectónicos.Comience a preparar el inóculo de Chroothece mobilis transfiriéndolo del cultivo de agar al medio de agua de mar o medio líquido SWES. Mantener todos los cultivos durante dos semanas con un fotoperiodo de 16 a 8 claros oscuros a 20 grados centígrados bajo una baja intensidad de luz blanca y sin agitar hasta obtener la densidad celular deseada. Utilice un mililitro del cultivo de fase exponencial que tiene cinco veces 10 a la tercera células por mililitro de densidad celular para inocular en una placa de 24 pocillos para diferentes experimentos.Para reproducir el efecto de luz monocromática, use el filtro verde que permite que la luz verde pase de 470 a 570 nanómetros con un pico en la longitud de onda de 506 nanómetros y a la luz roja ajustada usando un filtro entre 590 y 720 nanómetros y picos a 678 nanómetros. Exponga los cultivos celulares a esta luz durante dos semanas. Encienda todos los componentes del microscopio de escaneo láser confocal invertido, incluido el láser.Monte las células en el medio de crecimiento SWES desde cada pocillo experimental de la placa de 24 pocillos en un plato de fondo de vidrio de 35 milímetros para obtener imágenes. Elija el objetivo de inmersión en glicerol de apertura numérica 63X o 1.30 o NA y coloque glicerol sobre la lente. A continuación, coloque la placa del pozo en la etapa del microscopio asegurándose de que la muestra no se mueva durante la adquisición de la imagen.Centra la muestra en la trayectoria de la luz y enfócate en el centro de la celda seleccionando el plano con la mayor intensidad de fluorescencia. Una vez hecho esto, abra el software de adquisición de imágenes y elija XY lambda de la lista desplegable en el modo de adquisición. Seleccione la línea de excitación del láser 561 nanómetros, ocho bits de rango dinámico y 1024 por 1024 píxeles.Recopile los espectros de emisión de fluorescencia en el ancho de banda de 10 nanómetros y el tamaño del paso lambda de cuatro nanómetros dentro del rango de 570 a 760 nanómetros. Coloque el orificio en una unidad de aire y ejecute la adquisición de escaneo lambda. Después de repetir este proceso en diferentes campos de visión y bajo las diferentes condiciones de luces rojas y verdes, guarde todos los datos.Una vez adquirido el escaneo lambda, haga clic en la ventana de cuantificación en la parte superior del software para evaluar los espectros de emisión de fluorescencia recopilados. Vaya a la ventana de abrir proyecto y seleccione un archivo lambda XY. Seleccione el análisis de perfiles apilados en el software de imágenes y defina una región de interés de cuatro micrómetros cuadrados en el centro de una celda para analizar la intensidad media de fluorescencia.Exporte los datos y CSV antes de repetir el proceso con diferentes celdas en diferentes condiciones. A continuación, abra los archivos CSV para seleccionar los diferentes picos de emisión de fluorescencia de todas las regiones de interés medidas seleccionando los datos de fluorescencia máxima de ficoeritrina ficocianobilina, C.ficocianina, aloficocianina y clorofila A respectivamente en el archivo CSV. Una vez hecho esto, cree una nueva tabla con todos los valores máximos de fluorescencia obtenidos de cada pico de ficobiliproteína y clorofila y trace los datos en un gráfico.Se observaron diferencias significativas en la intensidad media de fluorescencia. La intensidad media de fluorescencia de la ficoeritrina ficocianobilina disminuyó significativamente cuando las células fueron expuestas a luz verde monocromática. Por el contrario, no se observaron diferencias en la luz roja en comparación con el control.La luz verde tuvo el efecto opuesto sobre la aloficocianina y la clorofila A en las que la intensidad media de fluorescencia aumentó significativamente debido a la adaptación de los complejos de antenas debido al aumento de la cantidad o la mejora de la conectividad de los complejos de antenas, entre otros. La luz roja produjo un aumento no significativo de la fluorescencia de aloficocianina y clorofila. Para estudiar el efecto de diferentes condiciones de crecimiento en las células en cultivo, es crucial realizar las mediciones con exactamente la misma configuración de microscopio.Es posible analizar otros parámetros ambientales relevantes para el cultivo de organismos de autofluorescencia, así como la señal de fluorescencia dentro del espectro visible. Esta técnica es un enfoque muy poderoso para estudiar organismos de vida con varios pigmentos de autofluorescencia.

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Investigación

Biología

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Ver histórico y demostración de Fisiología en la UNM de los músculos inaugural cangrejo de río

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Preparación de liposomas gigantes de la Imagen y Patch-Clamp Electrofisiología

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

En Vitro Reconstitución de complejos captadores de luz de Plantas y Algas

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Demostración Laboratorio Fisiología: tasa de filtración glomerular en una rata

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Intracavernosal Pressure Recording to Evaluate Erectile Function in Rodents

Grabación de la presión intracavernosa para evaluar la función eréctil en roedores

Erectile dysfunction (ED) is defined as the inability to attain or keep an erection of the penis, and this has become a prevalent male sexual disorder. ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Establecimiento de una cultura clónica de algas unicelulares de conjugación

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

Enfoque Experimental para Examinar la Señalización de la leptina en los cuerpos carótidos y sus efectos en el control de la respiración

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...