Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

تم تمويل هذه الدراسة من قبل NIH DK103166.

تمت الموافقة على جميع التجارب والإجراءات على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة إيست كارولينا (ECU) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن المعاهد الوطنية للصحة ووحدة التحكم الإلكترونية بشأن رعاية المختبر واستخدامها. تم إنشاء فئران خروج المغلوب claudin-7 المحرضة والخاصة ب?...

<ol>
	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

تعد الزراعة العضوية نموذجا ممتازا لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية ، وعلم وظائف الأعضاء المعوية ، واكتشاف الأدوية ، والأمراض المعوية البشرية ، وتجديد الأنسجةوإصلاحها 7،8،9،10،11،26. في ?...

الثقافة العضوية المعوية هي نظام ثلاثي الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي يتم فيه عزل الخلايا الجذعية من الخبايا المعوية للأنسجة الأولية ومطلية في مصفوفة هلام 1,2. هذه الخلايا الجذعية قادرة على التجديد الذاتي والتنظيم الذاتي ووظائف الأعضاء2. تحاكي الكائنات العضوية البيئة المكروية للأنسجة وهي أكثر تشابها مع النماذج في الجسم الحي من نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) في المختبر ، على الرغم من أنها أقل قابلية للتلاعب من الخلايا 3,4. يزيل هذا النموذج العقبات التي تواجهها نماذج 2D ، مثل عدم وجود التصاقات مناسبة للخلايا الخلوية ، وتفاعلات مصفوفة الخلية ، والمجموعات المتجانسة ، ويقلل أيضا من قيود النماذج الحيوانية ، بما في ذلك التكاليف المرتفعة والفترات الزمنية الطويلة5. الكائنات العضوية المعوية - يشار إليها أيضا باسم القولون لتلك التي تزرع من الخلايا الجذعية المشتقة من سرداب القولون - هي في الأساس أعضاء صغيرة تحتوي على ظهارة بما في ذلك جميع أنواع الخلايا التي ستكون موجودة في الجسم الحي ، بالإضافة إلى التجويف. يسمح هذا النموذج بمعالجة النظام لدراسة العديد من جوانب الأمعاء ، مثل مكانة الخلايا الجذعية ، وعلم وظائف الأعضاء المعوية ، والفيزيولوجيا المرضية ، وتشكل الأمعاء3،5،6. كما يوفر نموذجا رائعا لاكتشاف الأدوية ، ودراسة الاضطرابات المعوية البشرية مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) وسرطان القولون والمستقيم ، وتطوير العلاج الشخصي الخاص بالمريض ، ودراسة تجديد الأنسجة4،7،8،9. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام النظام العضوي لدراسة الاتصالات الخلوية ، واستقلاب الدواء ، والجدوى ، والانتشار ، والاستجابة للمنبهات 7,8. في حين يمكن استخدام النماذج الحيوانية لاختبار العلاجات المحتملة للحالات المرضية المعوية ، إلا أنها محدودة للغاية ، حيث تشكل دراسة أدوية متعددة في وقت واحد تحديا. هناك المزيد من المتغيرات المربكة في الجسم الحي ، والتكلفة والوقت المرتبطان مرتفعان وطويلان ، على التوالي. من ناحية أخرى ، يسمح نظام الزراعة العضوية بفحص العديد من العلاجات في وقت واحد في فترة زمنية أقصر ويسمح أيضا بالعلاج الشخصي من خلال استخدام الثقافة العضوية المشتقة من المريض 4,8. كما أن قدرة الكائنات العضوية القولونية على تقليد تنظيم الأنسجة والبيئة المكروية والوظائف تجعلها أيضا نموذجا ممتازا لدراسة التجديد وإصلاح الأنسجة9. أنشأ مختبرنا نظام زراعة عضوي للأمعاء الدقيقة لدراسة تأثير claudin-7 على وظائف الخلايا الجذعية للأمعاء الدقيقة10. في هذه الدراسة ، تم إنشاء نظام زراعة عضوي معوي كبير لدراسة قدرة الخلايا الجذعية ، أو عدم قدرتها ، على التجديد الذاتي والتمايز والتكاثر في نموذج خروج المغلوب claudin-7 الشرطي (cKO).
Claudin-7 هو بروتين مهم جدا للوصلة الضيقة (TJ) يتم التعبير عنه بشكل كبير في الأمعاء وهو ضروري للحفاظ على وظيفة TJ وسلامته11. تعاني فئران cKO من نمط ظاهري يشبه IBD ، حيث تظهر التهابا شديدا ، وتقرحات ، وتقشير الخلايا الظهارية ، والأورام الغدية ، وزيادة مستويات السيتوكين11,12. في حين أنه من المقبول على نطاق واسع أن claudins حيوية لوظيفة الحاجز الظهاري ، فإن أدوارا جديدة للكلاودين آخذة في الظهور. يشاركون في الانتشار والهجرة وتطور السرطان ووظيفة الخلايا الجذعية 10،12،13،14،15،16،17. من غير المعروف حاليا كيف يؤثر claudin-7 على مكانة الخلايا الجذعية ووظيفة الخلايا الجذعية القولونية. نظرا لأن الأمعاء تتجدد ذاتيا بسرعة كل 5-7 أيام تقريبا ، فإن الحفاظ على مكانة الخلايا الجذعية والأداء السليم للخلايا الجذعية النشطة أمر حيوي18. هنا ، يتم إنشاء نظام لدراسة الآثار التنظيمية المحتملة ل claudin-7 على مكانة الخلايا الجذعية القولونية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

تتجدد ظهارة الأمعاء كل 5-7 أيام ، ويتم التحكم فيها بواسطة مجموعة الخلايا الجذعية الظهارية المعوية (IESC) الموجودة في الجزء السفلي من منطقة القبو. تشمل IESCs الخلايا الجذعية النشطة ، التي تتجدد ذاتيا وتتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية ، والخلايا الجذعية الهادئة ، والتي تعمل كخلايا جذعية احتياطية في حالة الإصابة. يتم التحكم في تجديد ظهارة الأمعاء من خلال قدرات التجديد الذاتي والتمايز لهذه IESCs النشطة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن توازن عدد الخلايا الجذعية القبو والحفاظ على مكانة الخلايا الجذعية ضروريان لتجديد الأمعاء. تعد الثقافة العضوية طريقة مهمة وجذابة لدراسة البروتينات وجزيئات الإشارات والإشارات البيئية التي تنظم بقاء الخلايا الجذعية ووظائفها. هذا النموذج أقل تكلفة وأقل استهلاكا للوقت وأكثر قابلية للتلاعب من النماذج الحيوانية. تحاكي الكائنات العضوية أيضا البيئة المكروية للأنسجة ، مما يوفر أهمية في الجسم الحي . يصف البروتوكول الحالي عزل خبايا القولون ، ودمج خلايا القبو المعزولة هذه في نظام مصفوفة هلام ثلاثي الأبعاد وزراعة خلايا القبو لتشكيل عضويات قولونية قادرة على التنظيم الذاتي والانتشار والتجديد الذاتي والتمايز. يسمح هذا النموذج للمرء بمعالجة البيئة - ضرب بروتينات معينة مثل claudin-7 ، وتنشيط / إلغاء تنشيط مسارات الإشارات ، وما إلى ذلك - لدراسة كيفية تأثير هذه التأثيرات على عمل الخلايا الجذعية القولونية. على وجه التحديد ، تم فحص دور بروتين الوصلة الضيقة claudin-7 في وظيفة الخلايا الجذعية القولونية. Claudin-7 أمر حيوي للحفاظ على التوازن المعوي ووظيفة الحاجز وسلامته. يؤدي خروج المغلوب من claudin-7 في الفئران إلى نمط ظاهري يشبه مرض التهاب الأمعاء يظهر التهابا معويا ، وتضخم ظهاري ، وفقدان الوزن ، وتقرحات الغشاء المخاطي ، وتقشير الخلايا الظهارية ، والأورام الغدية. في السابق ، أفيد أن claudin-7 مطلوب لوظائف الخلايا الجذعية الظهارية المعوية في الأمعاء الدقيقة. في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء نظام زراعة عضوي القولون لدراسة دور claudin-7 في الأمعاء الغليظة.

من أجل فحص الآثار التنظيمية للكلاودين -7 على الخلايا الجذعية للقولون ، تم عزل خبايا القولون من أنسجة القولون الفئران كما هو موضح أعلاه وموضح في الشكل 1 أ. بمجرد عزل الخبايا من الأنسجة الأولية ، تم طلاؤها في مصفوفة ثلاثية الأبعاد في لوحة 96 بئرا لتنمو لمدة 11 يوما (ال...

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

يصف البروتوكول الحالي إنشاء نظام عضوي قولوني للفئران لدراسة نشاط وعمل الخلايا الجذعية القولونية في نموذج خروج المغلوب claudin-7.

ثقافة ثلاثية الأبعاد لخبايا القولون الفئران لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية المعوية خارج الجسم الحي

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

يوفر هذا البروتوكول طريقة لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية للقولون في بيئة قابلة للتلاعب بتكلفة أقل في الوقت المناسب من النماذج الحيوانية. تسمح الثقافة العضوية بدراسة وظيفة الخلايا الجذعية في بيئة خالية من المناعة. هذا يسمح بتحديد آثار سبب معين ، مثل خروج المغلوب من claudin-7.إن فهم آليات وظيفة الخلايا الجذعية قد يلقي الضوء على أهداف علاجية جديدة للأمراض الموهنة مثل مرض التهاب الأمعاء وسرطان القولون والمستقيم. لبدء عزل خبايا القولون من الفأر الرحيم ، قم بعمل شق بوصتين تقريبا أسفل خط الوسط للماوس. ثم ، دبوس الجلد مرة أخرى لكشف البطن.قطع القولون أسفل coecum مباشرة من الجانب القريب وفوق المستقيم من الجانب البعيد لعزل القولون. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية المرفقة بالقولون باستخدام ملقط. بعد دفع البراز من القولون المعزول مع الطرف المسطح للملقط ، قم بقطع الأنسجة مفتوحة طوليا.اغسل المنديل من 10 إلى 15 مرة باستخدام برنامج تلفزيوني بارد عن طريق تحريك المنديل في برنامج تلفزيوني بين الغسلات بالملقط. ثم باستخدام زوج من المقصات النظيفة والحادة ، قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة تتراوح من حوالي ثلاثة إلى خمسة ملليمترات. بعد عزل القولون عن فأر آخر تم قتله رحيما ، ادمج جميع قطع الأنسجة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر يحتوي على وسائط تفكك ظهاري باردة واحتضان قطع أنسجة القولون في وسائط تفكك ظهاري لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف.بعد الحضانة ، اسمح لشظايا الأنسجة بالغرق في قاع الأنبوب. بمجرد الاستقرار ، تخلص من وسائط التفكك الظهاري دون تعطيل شظايا الأنسجة. كرر العملية عند غسل الأنسجة من 10 إلى 15 مرة باستخدام PBS البارد.تخلص من أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني أثناء الغسيل النهائي. بعد ذلك ، أضف وسائط تفكك القبو البارد إلى قطع أنسجة القولون المغسولة في أنبوب سعة 50 ملليلتر ورجها لمدة خمس إلى 10 دقائق باليد. تحت غطاء زراعة الخلايا ، قم بتصفية الوسائط التي تحتوي على الأنسجة باستخدام مصفاة خلية نايلون 70 ميكرون في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 ملليلتر.بعد الترشيح ، قم بجهاز طرد مركزي للأنبوب عند 200 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بالتخلص من المادة الطافية دون إزعاج الخبايا المحببة. أعد تعليق الحبيبات في ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من PBS البارد. ماصة 10 ميكرولتر من تعليق سرداب في خط على شريحة المجهر.باستخدام المجهر ، احسب عدد الخبايا الطويلة الكاملة لتقدير تركيز القبو وحساب الحجم المناسب للأقبية المطلوبة للوحة 10 أقبية لكل ميكرولتر في لوحة 96 بئرا. الطرد المركزي حجم مناسب من الخبايا المعزولة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر عند 200 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر دون تعطيل الخبايا المحببة.ثم أضف 100 ميكرولتر من مصفوفة الهلام إلى الخبايا المحببة دون إدخال فقاعات هواء. انتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى تصلب مصفوفة الهلام جزئيا. بعد ذلك ، يتم خلط لوحة 10 ميكرولتر من مصفوفة الهلام مع الخبايا في كل بئر من لوحة استزراع 96 بئرا تم تسخينها مسبقا لتشكيل شكل قبة.اترك من 10 إلى 20 دقيقة حتى يتم ضبط مصفوفة الجل بالكامل عن طريق وضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من محلول العمل الطازج لوسائط L-WRN المكملة بالمضادات الحيوية إلى كل بئر واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. لحصاد المواد العضوية ، قم بإزالة الوسائط القديمة من الآبار عن طريق تطبيق شفط فراغي وإصلاح المواد العضوية بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.ثم قم بإزالة 4٪ بارافورمالدهيد من الآبار عن طريق الشفط الفراغي ومعالجة المواد العضوية ب 100 ميكرولتر من 30٪ سكروز لكل بئر عند أربع درجات مئوية. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة 30٪ سكروز من الآبار عن طريق الشفط الفراغي قبل إضافة 10 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر. استخدم طرف ماصة لخدش قاع البئر برفق لفصل المواد العضوية المحتوية على القبة.بعد ذلك ، قم بإزالة PBS الذي يحتوي على المواد العضوية المنفصلة من البئر باستخدام ماصة وانقله إلى قالب بلاستيكي مسمى مملوء بنسبة 90٪ بدرجة حرارة القطع المثلى ، أو مركب OCT. استمر في العملية حتى تتم إزالة جميع المواد العضوية من جميع الآبار. أضف 2-ميثيل بوتان إلى قارورة ديوار المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ والتي تحتوي على كريات ثلج جافة, بما يكفي لتغطية الكريات.قم بتجميد العضو العضوي الذي يحتوي على كتلة OCT عن طريق تثبيته بثبات فوق 2-methylbutane. أخيرا ، قم بتخزين كتلة OCT المحتوية على عضوي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للتقسيم. تسلط الصورة التمثيلية الضوء على النمو الناجح للقولونات من الخبايا العادية التي تحتوي على claudin-7.بدأت الخبايا التي تحتوي على claudin-7 في تكوين كرويات بحلول اليوم الثاني ، وبدأت في التبرعم في اليوم الخامس ، واستمرت في النمو والتبرعم حتى تم حصادها في اليوم التاسع. في المقابل ، فشلت الخبايا التي تفتقر إلى claudin-7 في تكوين القولون المناسب. بعد العلاج ب 4-هيدروكسيتاموكسيفين لمدة يومين إلى ثلاثة أيام ، ظهرت خبايا كلاودين -7 بالضربة القاضية ككتل دائرية من الخلايا.على عكس عنصر التحكم ، لم تنمو الخبايا لتصبح كرويات صحية. أكد تلطيخ التألق المناعي للكلاودين -7 في السيطرة المحصودة وعضويات الضربة القاضية الشرطية نجاح خروج المغلوب من claudin-7 في الثقافة. أظهرت القولونات الضابطة إشارة موت الخلايا المبرمج قليلة جدا في اليوم التاسع.ومع ذلك ، أظهر القولون بالضربة القاضية claudin-7 موت الخلايا المبرمج العالي في نفس الوقت. ضمان التصلب الجزئي قبل الطلاء. سيؤدي الطلاء قبل التصلب الجزئي إلى انتشار مصفوفة الهلام ولن تتشكل القبة ، مما يؤثر على بقاء ونمو الخبايا.يمكن استخدام هذا البروتوكول لاكتشاف الأدوية ، ودراسة الاتصالات الخلوية ، واستقلاب الدواء ، وصلاحيته ، وانتشاره ، وتطوير علاج شخصي خاص بالمريض. أحدث إنشاء ثقافة عضوية ثورة في دراسة الأمراض والطب الشخصي.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

دراسة ناقلات فيروسية في الكبد نموذج إسكانها ثلاثي الأبعاد مع الخط خلية الإنسان سرطان الكبد HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

بروتوكول للثقافة السريع بعد الوفاة خلية من منتشر الجوهرية جسري بالورم الدبقي (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

نظام ثقافة ثيميك ثلاثي الأبعاد لتوليد المهاجرين الثيمة المضادة للخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

نموذج المصفوفة خارج الخلية العظام ثلاثية الأبعاد ل Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

تحليل مقياس التدفق لأنواع الأكسجين التفاعلي الميتوكوندريا في الجذعية المكونة للدم وخلايا البروجينوتريو وابيضاض الدم المدفوع MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

نموذج ثلاثي الأبعاد من كرويدات لدراسة الخلايا الجذعية سرطان القولون

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...