Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Denne undersøgelse blev finansieret af NIH DK103166.

Alle dyreforsøg og procedurer blev godkendt af East Carolina University (ECU) Animal Care and Use Committee (IACUC) og udført i overensstemmelse med retningslinjer fra National Institutes of Health og ECU om laboratoriedyrpleje og -brug. Uinducerbare, tarmspecifikke claudin-7 knockout-mus blev genereret ved at krydse C57BL6 claudin-7-flox transgene mus med Villin-CreERT2 mus19. Han- og hunmus i alderen 3 måneder blev anvendt i denne undersøgelse.
1. Forberedel...

<ol>
	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

Organoidkultur er en fremragende model til undersøgelse af stamcellefunktion, tarmfysiologi, lægemiddelopdagelse, menneskelige tarmsygdomme og vævsregenerering og reparation 7,8,9,10,11,26. Selvom det har mange fordele, kan det være udfordrende at etablere. Der skal udvises forsigtighed i alle trin i hele protokollen, men...

Intestinal organoidkultur er et tredimensionelt (3D) ex vivo-system, hvor stamceller isoleres fra tarmkrypterne i primært væv og belægges til en gelmatrix 1,2. Disse stamceller er i stand til selvfornyelse, selvorganisering og organfunktionalitet2. Organoider efterligner vævsmikromiljøet og ligner mere in vivo-modeller end todimensionelle (2D) in vitro-cellekulturmodeller, selvom de er mindre manipulerbare end celler 3,4. Denne model eliminerer forhindringer, der opstår i 2D-modeller, såsom mangel på korrekt celle-celle-adhæsioner, celle-matrix-interaktioner og homogene populationer, og reducerer også begrænsningerne ved dyremodeller, herunder høje omkostninger og lange perioder5. Intestinale organoider - også kaldet colonoider for dem, der dyrkes af kolonkryptafledte stamceller - er i det væsentlige mini-organer, der indeholder et epitel, herunder alle celletyper, der ville være til stede in vivo, samt et lumen. Denne model tillader manipulation af systemet til at studere mange aspekter af tarmen, såsom stamcelleniche, tarmfysiologi, patofysiologi og tarmmorfogenese 3,5,6. Det giver også en god model til lægemiddelopdagelse, studerer menneskelige tarmlidelser såsom inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og kolorektal cancer, patientspecifik personlig behandlingsudvikling og studerer vævsregenerering 4,7,8,9. Derudover kan organoidsystemet også bruges til at studere cellulær kommunikation, lægemiddelmetabolisme, levedygtighed, spredning og respons på stimuli 7,8. Mens dyremodeller kan bruges til at teste potentielle terapeutiske midler til tarmpatologiske tilstande, er de ret begrænsede, da det er en udfordring at studere flere lægemidler på én gang. Der er flere forvirrende variabler in vivo, og tilhørende omkostninger og tid er henholdsvis høje og lange. På den anden side giver organoidkultursystemet mulighed for screening af mange terapier på én gang i en kortere periode og giver også mulighed for personlig behandling ved brug af patientafledt organoidkultur 4,8. Colonic organoids evne til at efterligne vævsorganisation, mikromiljø og funktionalitet gør dem også til en fremragende model til at studere regenerering og vævsreparation9. Vores laboratorium har etableret et tyndtarmsorganoidkultursystem for at studere effekten af claudin-7 på tyndtarmens stamcellefunktioner10. I denne undersøgelse etableres et stort tarmorganoidkultursystem for at studere stamcellers evne eller manglende evne til selvfornyelse, differentiering og spredning i en betinget claudin-7 knockout (cKO) model.
Claudin-7 er et meget vigtigt TJ-protein (tight junction), der udtrykkes meget i tarmen og er afgørende for at opretholde TJ-funktion og integritet11. cKO-mus lider af en IBD-lignende fænotype, der udviser alvorlig betændelse, sårdannelser, epitelcellesloughing, adenomer og øgede cytokinniveauer11,12. Mens det er almindeligt accepteret, at claudiner er afgørende for epitelbarrierefunktion, opstår der nye roller for claudiner; de er involveret i spredning, migration, kræftprogression og stamcellefunktion 10,12,13,14,15,16,17. Det er på nuværende tidspunkt uvist, hvordan claudin-7 påvirker stamcellenichen og funktionen af kolonstamceller. Da tarmen hurtigt fornyer sig selv ca. hver 5-7 dag, er vedligeholdelse af stamcelleniche og korrekt funktion af de aktive stamceller afgørende18. Her etableres et system til at undersøge de potentielle regulatoriske virkninger af claudin-7 på den koloniske stamcelleniche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

Tarmepitelet regenererer hver 5-7 dage og styres af tarmepitelstamcellepopulationen (IESC) placeret i bunden af kryptområdet. IESC'er omfatter aktive stamceller, som selvfornyer og differentierer sig til forskellige epitelcelletyper, og hvilende stamceller, der tjener som reservestamceller i tilfælde af skade. Regenerering af tarmepitelet styres af disse aktive IESC'ers selvfornyende og differentierende egenskaber. Derudover er balancen i kryptstamcellepopulationen og vedligeholdelsen af stamcellenichen afgørende for tarmregenerering. Organoidkultur er en vigtig og attraktiv tilgang til at studere proteiner, signalmolekyler og miljømæssige signaler, der regulerer stamcelleoverlevelse og funktioner. Denne model er billigere, mindre tidskrævende og mere manipulerbar end dyremodeller. Organoider efterligner også vævsmikromiljøet, hvilket giver in vivo relevans. Den nuværende protokol beskriver isoleringen af kolonkrypter, indlejring af disse isolerede kryptceller i et tredimensionelt gelmatrixsystem og dyrkning af kryptceller til dannelse af kolonorganiske oider, der er i stand til selvorganisering, spredning, selvfornyelse og differentiering. Denne model gør det muligt at manipulere miljøet - slå specifikke proteiner ud som claudin-7, aktivere / deaktivere signalveje osv. - for at studere, hvordan disse effekter påvirker funktionen af kolonstamceller. Specifikt blev rollen som tæt krydsprotein claudin-7 i kolon stamcellefunktion undersøgt. Claudin-7 er afgørende for at opretholde tarmhomeostase og barrierefunktion og integritet. Knockout af claudin-7 hos mus inducerer en inflammatorisk tarmsygdom-lignende fænotype, der udviser tarmbetændelse, epitelhyperplasi, vægttab, slimhindesårdannelser, epitelcellesloughing og adenomer. Tidligere blev det rapporteret, at claudin-7 er nødvendig for intestinal epitel stamcellefunktioner i tyndtarmen. I denne protokol etableres et kolonorganoidkultursystem for at studere claudin-7's rolle i tyktarmen.

For at undersøge de regulatoriske virkninger af claudin-7 på tyktarmsstamceller blev kolonkrypter isoleret fra murin tyktarmsvæv som beskrevet ovenfor og vist i figur 1A. Når krypterne var isoleret fra det primære væv, blev de belagt i en 3D-matrix i en 96-brøndplade for at vokse i 11 dage (figur 1). Normale sunde krypter lukker lumen og bliver sfæroider på dag 2 og begynder til sidst at spire og danne de forskellige epitelcelletyper på cirka dag 5 (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Den nuværende protokol beskriver etablering af et murine colonic organoid system til at studere aktiviteten og funktionen af kolon stamceller i en claudin-7 knockout model.

Tredimensionel kultur af Murine Colonic Crypts til undersøgelse af tarmstamcellefunktion Ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Denne protokol giver en metode til at studere funktionen af tyktarmsstamceller i et manipulerbart miljø med lavere omkostninger i tide end dyremodeller. Organoidkultur tillader undersøgelse af stamcellefunktion i et immunfrit miljø. Dette gør det muligt at lokalisere virkningerne af en bestemt årsag, såsom knockout af claudin-7.Forståelse af mekanismerne for stamcellefunktion kan kaste lys over nye terapeutiske mål for invaliderende sygdomme som inflammatorisk tarmsygdom og kolorektal cancer. For at begynde isoleringen af kolonkrypter fra den aflivede mus, lav et snit på cirka to inches ned ad musens midterlinje. Fastgør derefter huden for at udsætte maven.Skær tyktarmen lige under coecum fra den proksimale side og over endetarmen fra den distale side for at isolere tyktarmen. Fjern derefter fedtvævet, der er fastgjort til tyktarmen, ved hjælp af tang. Efter at have skubbet afføring ud fra den isolerede tyktarm med den flade ende af tangen, skal du skære vævet åbent i længderetningen.Vask vævet 10 til 15 gange med kold PBS ved at hvirvle vævet rundt i PBS mellem vaske med tang. Brug derefter en ren og skarp saks til at skære vævet i små stykker fra cirka tre til fem millimeter. Efter isolering af tyktarmen fra en anden aflivet mus kombineres alle vævsstykkerne i et 50 milliliter centrifugerør indeholdende koldt epiteldissociationsmedium og inkuberer tyktarmsvævstykkerne i epiteldissociationsmedier i 90 minutter ved fire grader Celsius med blid rocking.Efter inkubation skal vævsfragmenterne synke til bunden af røret. Når det er afgjort, skal du kassere epiteldissociationsmediet uden at forstyrre vævsfragmenterne. Gentag processen, når du vasker vævet 10 til 15 gange med kold PBS.Kassér så meget PBS som muligt under den sidste vask. Tilsæt derefter kolde kryptdissociationsmedier til de vaskede tyktarmsvævsstykker i et 50 milliliter rør og ryst i fem til 10 minutter i hånden. Under cellekulturhætten filtreres mediet, der indeholder vævet med en 70 mikron nyloncellesi, i et frisk-50 milliliter centrifugerør.Efter filtrering centrifugeres røret ved 200 G i 10 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af kassation af supernatanten uden at forstyrre de pelleterede krypter. Resuspender pelleten i tre til fire milliliter kold PBS. Pipetter 10 mikroliter af kryptophænget i en linje på et mikroskopglas.Brug mikroskopet til at tælle antallet af fulde, lange krypter for at estimere kryptkoncentrationen og beregne det passende volumen krypter, der kræves for at plade 10 krypter pr. Mikroliter i en 96-brøndsplade. Centrifuge et passende volumen isolerede krypter i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør ved 200 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern derefter supernatanten ved hjælp af en 1.000 mikroliter pipette uden at forstyrre de pelleterede krypter.Tilsæt derefter 100 mikroliter gelmatrix til de pelleterede krypter uden at indføre luftbobler. Vent i et til to minutter, indtil gelmatrixen er delvist størknet. Derefter blandes plade 10 mikroliter af gelmatrixen med krypterne i hver brønd i en forvarmet kulturplade med 96 brønde for at danne en kuppelform.Der er 10 til 20 minutter, før gelmatrixen indstilles helt, ved at placere pladen i en inkubator ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid. Til sidst tilsættes 100 mikroliter af den frisklavede arbejdsløsning af L-WRN-medier suppleret med antibiotika til hver brønd og inkuberes pladen ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid i 24 timer. For at høste organoiderne skal du fjerne gamle medier fra brøndene ved at anvende vakuumsugning og fastgøre organoiderne med 4% paraformaldehyd i en time ved stuetemperatur.Fjern derefter 4% paraformaldehyd fra brøndene ved vakuumsugning og behandl organoiderne med 100 mikroliter 30% saccharose pr. Brønd ved fire grader Celsius. Efter 24 timer fjernes 30% saccharose fra brøndene ved vakuumsugning, før der tilsættes 10 mikroliter PBS til hver brønd. Brug en pipettespids til forsigtigt at ridse bunden af brønden for at adskille de kuppelholdige organoider.Fjern derefter PBS, der indeholder de dissocierede organoider, fra brønden med en pipette og overfør den til en mærket plastform fyldt 90% med optimal skæretemperatur eller OCT-forbindelse. Fortsæt processen, indtil alle organoider er fjernet fra alle brønde. Tilsæt 2-methylbutan til en Dewar-kolbe i rustfrit stål, der indeholder tørispiller, nok til at dække pellets.Flash-frys organoiden indeholdende OCT-blok ved støt at holde den over 2-methylbutan. Til sidst opbevares den organoidholdige OCT-blok ved minus 80 grader Celsius, indtil den er klar til sektion. Det repræsentative billede fremhæver den vellykkede vækst af kolonoider fra normale krypter indeholdende claudin-7.Krypterne, der indeholdt claudin-7, begyndte at danne sfæroider på dag to, begyndte at spire på dag fem og fortsatte med at vokse og spire, indtil de blev høstet på dag ni. I modsætning hertil undlod krypter, der manglede claudin-7, at danne ordentlige kolonoider. Efter behandling med 4-hydroxytamoxifen i to til tre dage optrådte claudin-7 knockout-krypterne som cirkulære klumper af celler.I modsætning til kontrollen voksede krypterne ikke til sunde sfæroider. Immunofluorescensfarvning for claudin-7 i den høstede kontrol og de betingede knockout-organoider bekræftede den vellykkede knockout af claudin-7 i kultur. Kontrolkolonoiderne udviste meget lidt apoptotisk signal på dag ni.Imidlertid viste claudin-7 knockout colonoids høj apoptose på samme tid. Sørg for delvis størkning inden plettering. Plating før delvis størkning vil få gelmatrixen til at sprede sig, og kuplen vil ikke blive dannet, hvilket påvirker krypternes overlevelse og vækst.Denne protokol kan bruges til lægemiddelopdagelse, studere cellulær kommunikation, lægemiddelmetabolisme, levedygtighed, spredning og udvikle patientspecifik personlig behandling. Etableringen af organoid kultur har revolutioneret studiet af sygdomme og personlig medicin.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Undersøgelse af virusvektorer i et tredimensionalt Lever Model genbefolket med Human hepatocellulært carcinom HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokol til Rapid Post-mortem Cell Culture af Diffus Intrinsic Pontine gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Bevæger sig opad: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensionale Invasion Assay protokol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

En tredimensionel Thymisk kultur system til at generere murine induceret pluripotente stamcelle-afledte tumor antigen-specifikke Thymisk emigranter

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tre-dimensionelle knogle ekstracellulære Matrix Model for osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow Cytometrisk analyse af mitokondrie reaktive oxygen arter i murine hæmatopoietiske stamceller og Progenitorcellerne og MLL-AF9 drevet leukæmi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering cell død ved hjælp af cellefri supernatant af probiotika i tre-dimensionelle sfæroid kulturer colorectal cancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

En tre-dimensionel model af sfæroider til undersøgelse tyktarmskræft stamceller

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...