Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Deze studie werd gefinancierd door NIH DK103166.

Alle dierproeven en -procedures zijn goedgekeurd door de East Carolina University (ECU) Animal Care and Use Committee (IACUC) en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health en ECU voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Induceerbare, darmspecifieke claudine-7 knock-out muizen werden gegenereerd door C57BL6 claudine-7-flox transgene muizen te kruisen met Villin-CreERT2 muizen19. Mannelijke en vrouwelijke muizen van 3 maanden oud werden gebruikt i...

<ol>
	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

Organoïde cultuur is een uitstekend model voor het bestuderen van stamcelfunctie, darmfysiologie, medicijnontdekking, menselijke darmziekten en weefselregeneratie en -reparatie 7,8,9,10,11,26. Hoewel het veel voordelen heeft, kan het een uitdaging zijn om vast te stellen. Voorzichtigheid is geboden in alle stappen in het pro...

Intestinale organoïde cultuur is een driedimensionaal (3D) ex vivo systeem waarbij stamcellen worden geïsoleerd uit de darmcrypten van primair weefsel en verguld in een gelmatrix 1,2. Deze stamcellen zijn in staat tot zelfvernieuwing, zelforganisatie en orgaanfunctionaliteit2. Organoïden bootsen de micro-omgeving van het weefsel na en lijken meer op in vivo modellen dan tweedimensionale (2D) in vitro celkweekmodellen, hoewel minder manipulateerbaar dan cellen 3,4. Dit model elimineert obstakels die worden aangetroffen in 2D-modellen, zoals een gebrek aan goede cel-celverklevingen, cel-matrixinteracties en homogene populaties, en vermindert ook de beperkingen van diermodellen, waaronder hoge kosten en lange perioden van tijd5. Intestinale organoïden - ook wel colonoïden genoemd voor die gekweekt uit van coloncrypten afgeleide stamcellen - zijn in wezen mini-organen die een epitheel bevatten met alle celtypen die in vivo aanwezig zouden zijn, evenals een lumen. Dit model maakt manipulatie van het systeem mogelijk om vele aspecten van de darm te bestuderen, zoals de stamcelniche, darmfysiologie, pathofysiologie en darmmorfogenese 3,5,6. Het biedt ook een geweldig model voor het ontdekken van geneesmiddelen, het bestuderen van menselijke darmaandoeningen zoals inflammatoire darmaandoeningen (IBD) en colorectale kanker, patiëntspecifieke gepersonaliseerde behandelingsontwikkeling en het bestuderen van weefselregeneratie 4,7,8,9. Daarnaast kan het organoïde systeem ook worden gebruikt om cellulaire communicatie, medicijnmetabolisme, levensvatbaarheid, proliferatie en reactie op stimuli te bestuderen 7,8. Hoewel diermodellen kunnen worden gebruikt om potentiële therapieën voor intestinale pathologische aandoeningen te testen, zijn ze vrij beperkt, omdat het bestuderen van meerdere geneesmiddelen tegelijk een uitdaging vormt. Er zijn meer verstorende variabelen in vivo, en de bijbehorende kosten en tijd zijn respectievelijk hoog en lang. Aan de andere kant maakt het organoïde kweeksysteem de screening van veel therapeutica tegelijk in een kortere periode mogelijk en maakt het ook een gepersonaliseerde behandeling mogelijk door het gebruik van van de patiënt afgeleide organoïde cultuur 4,8. Het vermogen van colonorganoïden om weefselorganisatie, micro-omgeving en functionaliteit na te bootsen, maakt ze ook een uitstekend model voor het bestuderen van regeneratie en weefselherstel9. Ons lab heeft een organoïde kweeksysteem voor de dunne darm opgezet om het effect van claudine-7 op de stamcelfuncties van de dunne darm te bestuderen10. In deze studie wordt een groot intestinaal organoïde kweeksysteem opgezet om het vermogen of gebrek aan vermogen van stamcellen te bestuderen om zichzelf te vernieuwen, te differentiëren en te vermenigvuldigen in een voorwaardelijk claudine-7 knock-out (cKO) -model.
Claudin-7 is een zeer belangrijk tight junction (TJ) eiwit dat sterk tot expressie komt in de darm en essentieel is voor het behoud van de TJ-functie en integriteit11. cKO-muizen lijden aan een IBD-achtig fenotype, vertonen ernstige ontstekingen, ulceraties, epitheelcelschilfers, adenomen en verhoogde cytokinespiegels11,12. Hoewel het algemeen aanvaard is dat claudins van vitaal belang zijn voor de epitheliale barrièrefunctie, ontstaan er nieuwe rollen voor claudins; ze zijn betrokken bij proliferatie, migratie, kankerprogressie en stamcelfunctie 10,12,13,14,15,16,17. Het is momenteel onbekend hoe claudine-7 de stamcelniche en -functie van colonstamcellen beïnvloedt. Omdat de darm zichzelf ongeveer elke 5-7 dagen snel vernieuwt, is het behoud van de stamcelniche en de goede werking van de actieve stamcellen van vitaal belang18. Hier wordt een systeem opgezet om de potentiële regulerende effecten van claudine-7 op de colonstamcelniche te onderzoeken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

Het darmepitheel regenereert elke 5-7 dagen en wordt gecontroleerd door de intestinale epitheliale stamcelpopulatie (IESC) op de bodem van het cryptegebied. IESCs omvatten actieve stamcellen, die zichzelf vernieuwen en differentiëren in verschillende epitheelceltypen, en rustige stamcellen, die dienen als reservestamcellen in geval van letsel. Regeneratie van het darmepitheel wordt gecontroleerd door de zelfvernieuwende en onderscheidende mogelijkheden van deze actieve IESCs. Bovendien zijn de balans van de crypte stamcelpopulatie en het behoud van de stamcelniche essentieel voor darmregeneratie. Organoïde cultuur is een belangrijke en aantrekkelijke benadering voor het bestuderen van eiwitten, signaalmoleculen en omgevingssignalen die de overleving en functies van stamcellen reguleren. Dit model is goedkoper, minder tijdrovend en beter beheersbaar dan diermodellen. Organoïden bootsen ook de micro-omgeving van het weefsel na en bieden in vivo relevantie. Het huidige protocol beschrijft de isolatie van coloncrypten, het inbedden van deze geïsoleerde cryptecellen in een driedimensionaal gelmatrixsysteem en het kweken van cryptecellen om colonorganoïden te vormen die in staat zijn tot zelforganisatie, proliferatie, zelfvernieuwing en differentiatie. Dit model stelt iemand in staat om de omgeving te manipuleren - het uitschakelen van specifieke eiwitten zoals claudine-7, activerende / deactiverende signaalroutes, enz. - om te bestuderen hoe deze effecten de werking van colonstamcellen beïnvloeden. Specifiek werd de rol van tight junction eiwit claudin-7 in de darmstamcelfunctie onderzocht. Claudin-7 is van vitaal belang voor het behoud van intestinale homeostase en barrièrefunctie en integriteit. Knock-out van claudine-7 bij muizen induceert een inflammatoir darmziekte-achtig fenotype dat darmontsteking, epitheliale hyperplasie, gewichtsverlies, mucosale ulceraties, epitheelcelschimmel en adenomen vertoont. Eerder werd gemeld dat claudine-7 nodig is voor intestinale epitheelstamcelfuncties in de dunne darm. In dit protocol wordt een colon-organoïde kweeksysteem opgezet om de rol van claudine-7 in de dikke darm te bestuderen.

Om de regulerende effecten van claudine-7 op darmstamcellen te onderzoeken, werden coloncrypten geïsoleerd uit muizenzwamweefsel zoals hierboven beschreven en weergegeven in figuur 1A. Nadat de crypten waren geïsoleerd van het primaire weefsel, werden ze in een 3D-matrix in een 96-well plaat geplaatst om gedurende 11 dagen te groeien (figuur 1). Normale gezonde crypten zullen het lumen sluiten en op dag 2 sferoïden worden en uiteindelijk beginnen te ontluiken...

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.

Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Dit protocol biedt een methode om de functie van darmstamcellen te bestuderen in een manipuleerbare omgeving met lagere kosten in de tijd dan diermodellen. Organoïde cultuur maakt de studie van stamcelfunctie in een immuunvrije omgeving mogelijk. Dit maakt het mogelijk om de effecten van een specifieke oorzaak te lokaliseren, zoals de knock-out van claudin-7.Het begrijpen van de mechanismen van stamcelfunctie kan licht werpen op nieuwe therapeutische doelen voor slopende ziekten zoals inflammatoire darmaandoeningen en colorectale kanker. Om de isolatie van coloncrypten van de geëuthanaseerde muis te beginnen, maakt u een incisie van ongeveer twee centimeter langs de middellijn van de muis. Speld vervolgens de huid terug om de buik bloot te leggen.Snijd de dikke darm net onder het coecum van de proximale kant en boven het rectum van de distale kant om de dikke darm te isoleren. Verwijder vervolgens het vetweefsel dat aan de dikke darm is bevestigd met behulp van een tang. Nadat u uitwerpselen uit de geïsoleerde dikke darm hebt geduwd met het platte uiteinde van de tang, snijdt u het weefsel in de lengterichting open.Was het weefsel 10 tot 15 keer met koude PBS door het weefsel in PBS rond te draaien tussen wasbeurten door met een tang. Snijd vervolgens met een schone, scherpe schaar het weefsel in kleine stukjes van ongeveer drie tot vijf millimeter. Nadat u de dikke darm van een andere geëuthanaseerde muis hebt geïsoleerd, combineert u alle weefselstukken in een centrifugebuis van 50 milliliter met koude epitheliale dissociatiemedia en incubeert u de darmweefselstukken in epitheliale dissociatiemedia gedurende 90 minuten bij vier graden Celsius met zacht schommelen.Laat na incubatie de weefselfragmenten naar de bodem van de buis zakken. Eenmaal gevestigd, gooit u de epitheliale dissociatiemedia weg zonder de weefselfragmenten te verstoren. Herhaal het proces bij het wassen van het weefsel 10 tot 15 keer met koude PBS.Gooi zoveel mogelijk PBS weg tijdens de laatste wasbeurt. Voeg vervolgens koude crypte dissociatiemedia toe aan de gewassen darmweefselstukken in een buis van 50 milliliter en schud gedurende vijf tot 10 minuten met de hand. Filter onder de celkweekkap de media die het weefsel bevatten met een 70-micron nylon celzeef in een verse centrifugebuis van 50 milliliter.Na filtratie centrifugeert u de buis gedurende 10 minuten op 200 G bij kamertemperatuur, gevolgd door het weggooien van het supernatant zonder de gepelletiseerde crypten te verstoren. Resuspendeer de pellet in drie tot vier milliliter koude PBS. Pipetteer 10 microliter van de crypte suspensie in een lijn op een microscoopglaasje.Tel met behulp van de microscoop het aantal volle, lange crypten om de crypteconcentratie te schatten en bereken het juiste volume crypten dat nodig is om 10 crypten per microliter in een 96-well plaat te plaatsen. Centrifugeer een geschikt volume geïsoleerde crypten in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter bij 200 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het supernatant met een pipet van 1.000 microliter zonder de gepelletiseerde crypten te verstoren.Voeg vervolgens 100 microliter gelmatrix toe aan de gepelletiseerde crypten zonder luchtbellen te introduceren. Wacht één tot twee minuten totdat de gelmatrix gedeeltelijk is gestold. Vervolgens werd plaat 10 microliter van de gelmatrix gemengd met de crypten in elke put van een voorverwarmde 96-well kweekplaat om een koepelvorm te vormen.Wacht 10 tot 20 minuten voordat de gelmatrix volledig is ingesteld door de plaat in een incubator te plaatsen op 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide. Voeg ten slotte 100 microliter van de vers bereide werkoplossing van L-WRN-media aangevuld met antibiotica toe aan elke put en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur. Om de organoïden te oogsten, verwijdert u oude media uit de putten door vacuümafzuiging toe te passen en fixeert u de organoïden gedurende een uur met 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur.Verwijder vervolgens 4% paraformaldehyde uit de putten door vacuümafzuiging en behandel de organoïden met 100 microliter van 30% sucrose per put bij vier graden Celsius. Verwijder na 24 uur 30% sucrose uit de putten door vacuümafzuiging voordat u 10 microliter PBS aan elke put toevoegt. Gebruik een pipetpunt om voorzichtig de bodem van de put te krassen om de koepelbevattende organoïden te dissociëren.Verwijder vervolgens de PBS met de gedissocieerde organoïden uit de put met een pipet en breng deze over in een gelabelde plastic mal die voor 90% is gevuld met een optimale snijtemperatuur, of OCT, verbinding. Ga door met het proces totdat alle organoïden uit alle putten zijn verwijderd. Voeg 2-methylbutaan toe aan een roestvrijstalen Dewar-kolf met droogijskorrels, genoeg om de pellets te bedekken.Flash-freeze het organoïde bevattende OCT-blok door het gestaag boven het 2-methylbutaan te houden. Bewaar ten slotte het organoïde-bevattende OCT-blok bij min 80 graden Celsius totdat het klaar is om te worden doorgesneden. De representatieve afbeelding benadrukt de succesvolle groei van colonoïden uit normale crypten die claudine-7 bevatten.De crypten met claudin-7 begonnen op dag twee sferoïden te vormen, begonnen op dag vijf te ontluiken en bleven groeien en ontluiken totdat ze op dag negen werden geoogst. Daarentegen slaagden crypten zonder claudin-7 er niet in om goede colonoïden te vormen. Na behandeling met 4-hydroxytamoxifen gedurende twee tot drie dagen verschenen de claudine-7 knock-outcrypten als cirkelvormige klonten cellen.In tegenstelling tot de controle groeiden de crypten niet uit tot gezonde sferoïden. Immunofluorescentiekleuring voor claudine-7 in de geoogste controle en de voorwaardelijke knock-out organoïden bevestigden de succesvolle knock-out van claudine-7 in cultuur. De controlekolonoïden vertoonden op dag negen zeer weinig apoptotisch signaal.Claudin-7 knock-out colonoïden vertoonden echter tegelijkertijd een hoge apoptose. Zorg voor gedeeltelijke stolling voorafgaand aan de beplating. Plating vóór gedeeltelijke stolling zal ervoor zorgen dat de gelmatrix zich verspreidt en de koepel niet wordt gevormd, wat de overleving en groei van de crypten beïnvloedt.Dit protocol kan worden gebruikt voor het ontdekken van geneesmiddelen, het bestuderen van cellulaire communicatie, medicijnmetabolisme, levensvatbaarheid, proliferatie en het ontwikkelen van patiëntspecifieke gepersonaliseerde behandeling. De oprichting van organoïde cultuur heeft een revolutie teweeggebracht in de studie van ziekten en gepersonaliseerde geneeskunde.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studie van virale vectoren in een drie-dimensionale lever Model herbevolkt met de menselijke hepatocellulair carcinoom cellijn HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Driedimensionale bot extracellulaire Matrix Model voor Osteosarcoom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Celdood evalueren met celvrije supernatant van probiotica in driedimensionale sferoïde culturen van colorectale kankercellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...