Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
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Cette étude a été financée par NIH DK103166.

Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Caroline de l’Est (ECU) et menées conformément aux directives des National Institutes of Health et de l’ECU sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris knockout claudin-7 inductibles et intestinales spécifiques ont été générées en croisant des souris transgéniques claudin-7-flox C57BL6 avec des souris Villin-CreERT2<sup clas...

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	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

La culture organoïde est un excellent modèle pour étudier la fonction des cellules souches, la physiologie intestinale, la découverte de médicaments, les maladies intestinales humaines et la régénération et la réparation des tissus 7,8,9,10,11,26. Bien qu’il présente de nombreux avantages, il peut être difficile ...

La culture organoïde intestinale est un système ex vivo tridimensionnel (3D) dans lequel les cellules souches sont isolées des cryptes intestinales du tissu primaire et plaquées dans une matrice de gel 1,2. Ces cellules souches sont capables d’auto-renouvellement, d’auto-organisation et de fonctionnalité des organes2. Les organoïdes imitent le microenvironnement tissulaire et sont plus semblables aux modèles in vivo qu’aux modèles de culture cellulaire in vitro bidimensionnels (2D), bien que moins manipulables que les cellules 3,4. Ce modèle élimine les obstacles rencontrés dans les modèles 2D, tels que le manque d’adhérences cellule-cellule appropriées, les interactions cellule-matrice et les populations homogènes, et réduit également les limites des modèles animaux, y compris les coûts élevés et les longues périodes de temps5. Les organoïdes intestinaux - également appelés colonoïdes pour ceux cultivés à partir de cellules souches dérivées de cryptes du côlon - sont essentiellement des mini-organes qui contiennent un épithélium comprenant tous les types de cellules qui seraient présentes in vivo, ainsi qu’une lumière. Ce modèle permet de manipuler le système pour étudier de nombreux aspects de l’intestin, tels que la niche des cellules souches, la physiologie intestinale, la physiopathologie et la morphogenèse intestinale 3,5,6. Il fournit également un excellent modèle pour la découverte de médicaments, l’étude des troubles intestinaux humains tels que les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) et le cancer colorectal, le développement de traitements personnalisés spécifiques au patient et l’étude de la régénération tissulaire 4,7,8,9. En outre, le système organoïde peut également être utilisé pour étudier la communication cellulaire, le métabolisme des médicaments, la viabilité, la prolifération et la réponse aux stimuli 7,8. Bien que des modèles animaux puissent être utilisés pour tester des traitements potentiels pour les affections pathologiques intestinales, ils sont assez limités, car l’étude de plusieurs médicaments à la fois pose un défi. Il y a plus de variables confondantes in vivo, et le coût et le temps associés sont respectivement élevés et longs. D’autre part, le système de culture organoïde permet le criblage de nombreux produits thérapeutiques à la fois dans un laps de temps plus court et permet également un traitement personnalisé grâce à l’utilisation de cultures organoïdes dérivées du patient 4,8. La capacité des organoïdes du côlon à imiter l’organisation, le microenvironnement et la fonctionnalité des tissus en fait également un excellent modèle pour étudier la régénération et la réparation des tissus9. Notre laboratoire a mis en place un système de culture organoïde de l’intestin grêle pour étudier l’effet de la claudine-7 sur les fonctions des cellules souches de l’intestin grêle10. Dans cette étude, un système de culture organoïde intestinal de grande taille est établi pour étudier la capacité, ou l’absence de capacité, des cellules souches à s’auto-renouveler, à se différencier et à proliférer dans un modèle conditionnel de claudin-7 knockout (cKO).
La claudine-7 est une protéine de jonction serrée (TJ) très importante qui est fortement exprimée dans l’intestin et est essentielle au maintien de la fonction et de l’intégrité de TJ11. Les souris cKO souffrent d’un phénotype de type MII, présentant une inflammation sévère, des ulcérations, une desquamation des cellules épithéliales, des adénomes et une augmentation des taux de cytokines11,12. Bien qu’il soit largement admis que les claudines sont vitales pour la fonction de barrière épithéliale, de nouveaux rôles pour les claudines émergent; Ils sont impliqués dans la prolifération, la migration, la progression du cancer et la fonction des cellules souches 10,12,13,14,15,16,17. On ignore actuellement comment la claudine-7 affecte la niche des cellules souches et la fonction des cellules souches du côlon. Comme l’intestin s’auto-renouvelle rapidement environ tous les 5 à 7 jours, le maintien de la niche des cellules souches et le bon fonctionnement des cellules souches actives sont essentiels18. Ici, un système est établi pour examiner les effets régulateurs potentiels de la claudine-7 sur la niche des cellules souches du côlon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

L’épithélium intestinal se régénère tous les 5 à 7 jours et est contrôlé par la population de cellules souches épithéliales intestinales (IESC) située au fond de la région de la crypte. Les CSEI comprennent les cellules souches actives, qui s’auto-renouvellent et se différencient en divers types de cellules épithéliales, et les cellules souches quiescentes, qui servent de cellules souches de réserve en cas de blessure. La régénération de l’épithélium intestinal est contrôlée par les capacités d’auto-renouvellement et de différenciation de ces IESC actifs. De plus, l’équilibre de la population de cellules souches cryptiques et le maintien de la niche des cellules souches sont essentiels à la régénération intestinale. La culture organoïde est une approche importante et attrayante pour étudier les protéines, les molécules de signalisation et les signaux environnementaux qui régulent la survie et les fonctions des cellules souches. Ce modèle est moins cher, moins long et plus manipulable que les modèles animaux. Les organoïdes imitent également le microenvironnement tissulaire, fournissant une pertinence in vivo . Le présent protocole décrit l’isolement des cryptes du côlon, l’intégration de ces cellules cryptiques isolées dans un système de matrice de gel tridimensionnel et la culture de cellules cryptiques pour former des organoïdes du côlon capables d’auto-organisation, de prolifération, d’auto-renouvellement et de différenciation. Ce modèle permet de manipuler l’environnement - éliminer des protéines spécifiques telles que la claudine 7, activer / désactiver les voies de signalisation, etc. - pour étudier comment ces effets influencent le fonctionnement des cellules souches du côlon. Plus précisément, le rôle de la protéine de jonction serrée claudin-7 dans la fonction des cellules souches du côlon a été examiné. Claudin-7 est vital pour maintenir l’homéostasie intestinale et la fonction et l’intégrité de la barrière. L’élimination de la claudine-7 chez la souris induit un phénotype semblable à une maladie inflammatoire de l’intestin présentant une inflammation intestinale, une hyperplasie épithéliale, une perte de poids, des ulcérations des muqueuses, une desquamation des cellules épithéliales et des adénomes. Auparavant, il a été rapporté que la claudine-7 est nécessaire pour les fonctions des cellules souches épithéliales intestinales dans l’intestin grêle. Dans ce protocole, un système de culture organoïde du côlon est établi pour étudier le rôle de la claudine-7 dans le gros intestin.

Afin d’examiner les effets régulateurs de la claudine-7 sur les cellules souches du côlon, des cryptes du côlon ont été isolées à partir de tissu murin du côlon, comme décrit ci-dessus et illustré à la figure 1A. Une fois les cryptes isolées du tissu primaire, elles ont été plaquées dans une matrice 3D dans une plaque de 96 puits pour croître pendant 11 jours (Figure 1). Les cryptes saines normales fermeront la lumière et deviendront des sphé...

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Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Le présent protocole décrit l’établissement d’un système organoïde du côlon murin pour étudier l’activité et le fonctionnement des cellules souches du côlon dans un modèle knockout claudin-7.

Culture tridimensionnelle de cryptes coliques murines pour étudier la fonction des cellules souches intestinales ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Ce protocole fournit une méthode pour étudier la fonction des cellules souches du côlon dans un environnement manipulable avec un coût de temps inférieur à celui des modèles animaux. La culture organoïde permet l’étude de la fonction des cellules souches dans un environnement sans immunité. Cela permet d’identifier les effets d’une cause spécifique, comme le KO de claudin-7.La compréhension des mécanismes de la fonction des cellules souches peut faire la lumière sur de nouvelles cibles thérapeutiques pour des maladies débilitantes telles que les maladies inflammatoires de l’intestin et le cancer colorectal. Pour commencer l’isolement des cryptes du côlon de la souris euthanasiée, faites une incision d’environ deux pouces le long de la ligne médiane de la souris. Ensuite, épinglez la peau pour exposer l’abdomen.Coupez le côlon juste en dessous du cœcum du côté proximal et au-dessus du rectum du côté distal pour isoler le côlon. Ensuite, retirez le tissu adipeux attaché au côlon à l’aide d’une pince. Après avoir expulsé les matières fécales du côlon isolé avec l’extrémité plate de la pince, coupez le tissu longitudinalement.Lavez le mouchoir 10 à 15 fois avec du PBS froid en faisant tourbillonner le tissu dans le PBS entre les lavages avec une pince. Ensuite, à l’aide d’une paire de ciseaux propres et tranchants, coupez le tissu en petits morceaux allant d’environ trois à cinq millimètres. Après avoir isolé le côlon d’une autre souris euthanasiée, combiner tous les morceaux de tissu dans un tube centrifuge de 50 millilitres contenant un milieu de dissociation épithélial froid et incuber les morceaux de tissu du côlon dans un milieu de dissociation épithéliale pendant 90 minutes à quatre degrés Celsius avec un léger balancement.Après l’incubation, laissez les fragments de tissu couler au fond du tube. Une fois réglé, jeter le milieu de dissociation épithéliale sans perturber les fragments de tissu. Répétez le processus lors du lavage du mouchoir 10 à 15 fois avec du PBS froid.Jetez autant de PBS que possible pendant le lavage final. Ensuite, ajoutez un milieu de dissociation cryptique froid aux morceaux de tissu du côlon lavés dans un tube de 50 millilitres et agitez pendant cinq à 10 minutes à la main. Sous le capot de culture cellulaire, filtrer le média contenant le tissu avec une crépine à cellules en nylon de 70 microns dans un tube centrifuge frais de 50 millilitres.Après filtration, centrifuger le tube à 200 G pendant 10 minutes à température ambiante, puis jeter le surnageant sans perturber les cryptes granulées. Remettez la pastille en suspension dans trois à quatre millilitres de PBS froid. Pipette 10 microlitres de la suspension cryptique dans une ligne sur une lame de microscope.À l’aide du microscope, comptez le nombre de cryptes longues et complètes pour estimer la concentration de cryptes et calculez le volume approprié de cryptes nécessaires pour plaquer 10 cryptes par microlitre dans une plaque de 96 puits. Centrifuger un volume approprié de cryptes isolées dans un tube à microcentrifugation de 1,5 millilitre à 200 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres sans perturber les cryptes granulées.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de matrice de gel aux cryptes granulées sans introduire de bulles d’air. Attendez une à deux minutes jusqu’à ce que la matrice de gel soit partiellement solidifiée. Ensuite, plaquez 10 microlitres de la matrice de gel mélangée aux cryptes dans chaque puits d’une plaque de culture préchauffée de 96 puits pour former une forme de dôme.Attendez 10 à 20 minutes pour que la matrice de gel soit complètement fixée en plaçant la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Enfin, ajoutez 100 microlitres de la solution de travail fraîchement préparée de milieu L-WRN complétée par des antibiotiques à chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Pour récolter les organoïdes, retirez les vieux milieux des puits en appliquant une aspiration sous vide et fixez les organoïdes avec 4% de paraformaldéhyde pendant une heure à température ambiante.Ensuite, retirez 4% de paraformaldéhyde des puits par aspiration sous vide et traitez les organoïdes avec 100 microlitres de 30% de saccharose par puits à quatre degrés Celsius. Après 24 heures, retirer 30% de saccharose des puits par aspiration sous vide avant d’ajouter 10 microlitres de PBS à chaque puits. Utilisez un embout de pipette pour gratter doucement le fond du puits afin de dissocier les organoïdes contenant le dôme.Ensuite, retirez le PBS contenant les organoïdes dissociés du puits avec une pipette et transférez-le dans un moule en plastique marqué rempli à 90% avec une température de coupe optimale, ou OCT, composé. Continuez le processus jusqu’à ce que tous les organoïdes aient été retirés de tous les puits. Ajouter le 2-méthylbutane à une fiole Dewar en acier inoxydable contenant des pastilles de glace carbonique, suffisamment pour couvrir les granulés.Congeler l’organoïde contenant le bloc OCT en le maintenant régulièrement au-dessus du 2-méthylbutane. Enfin, conservez le bloc OCT contenant des organoïdes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à être sectionné. L’image représentative met en évidence la croissance réussie des colonoïdes à partir de cryptes normales contenant de la claudine-7.Les cryptes contenant claudin-7 ont commencé à former des sphéroïdes au deuxième jour, ont commencé à bourgeonner le cinquième jour et ont continué à croître et à bourgeonner jusqu’à ce qu’elles soient récoltées le neuvième jour. En revanche, les cryptes dépourvues de claudin-7 n’ont pas réussi à former des colonoïdes appropriés. Après un traitement au 4-hydroxytamoxifène pendant deux à trois jours, les cryptes knockout claudin-7 sont apparues sous forme d’amas circulaires de cellules.Contrairement au contrôle, les cryptes ne sont pas devenues des sphéroïdes sains. La coloration par immunofluorescence de la claudine 7 dans le groupe témoin récolté et les organoïdes knock-out conditionnels a confirmé le succès de l’élimination de la claudine-7 en culture. Les colonoïdes témoins ont montré très peu de signal apoptotique le neuvième jour.Cependant, les colonoïdes knockout claudin-7 ont montré une apoptose élevée en même temps. Assurer une solidification partielle avant le placage. Le placage avant la solidification partielle entraînera la propagation de la matrice de gel et la formation du dôme ne sera pas formée, ce qui affectera la survie et la croissance des cryptes.Ce protocole peut être utilisé pour la découverte de médicaments, l’étude de la communication cellulaire, le métabolisme des médicaments, la viabilité, la prolifération et le développement d’un traitement personnalisé spécifique au patient. La mise en place de la culture organoïde a révolutionné l’étude des maladies et la médecine personnalisée.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Etude des vecteurs viraux dans un trois dimensions du foie Modèle repeuplée avec le Human Carcinome hépatocellulaire Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Recherche

Recherche en cancérologie

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocole pour Rapid Post-mortem Culture cellulaire de Diffuse Intrinsic Pontine gliome (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Épreuves d’imagerie de cellules vivantes pour étude glioblastome Brain Tumor Stem Cell Migration et Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer murine induite Pluripotent Stem Cell-dérivé Des émigrants thymiques spécifiques à l'antigène

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu de pulpe et co-culture avec les cellules cancéreuses afin d’étudier leurs Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modèle de matrice extracellulaire OS en trois dimensions pour l’ostéosarcome

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant sans cellules de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Un modèle tridimensionnel des sphéroïdes pour étudier les cellules souches du cancer du côlon

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...