Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Diese Studie wurde vom NIH DK103166 finanziert.

Alle Tierversuche und -verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee (IACUC) der East Carolina University (ECU) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und der ECU zur Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Induzierbare, Darm-spezifische Claudin-7-Knockout-Mäuse wurden durch Kreuzung von C57BL6-Claudin-7-flox-transgenen Mäusen mit Villin-CreERT2-Mäusenerzeugt 19. Männliche und weibliche Mäuse im Alter von 3 Monaten wurden in d...

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	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

Organoidkultur ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Stammzellfunktion, der Darmphysiologie, der Arzneimittelforschung, der menschlichen Darmerkrankungen sowie der Regeneration und Reparatur von Geweben 7,8,9,10,11,26. Obwohl es viele Vorteile hat, kann es schwierig sein, es zu etablieren. Vorsicht ist bei a...

Die intestinale Organoidkultur ist ein dreidimensionales (3D) ex vivo System, in dem Stammzellen aus den Darmkrypten des Primärgewebes isoliert und zu einer Gelmatrix 1,2 plattiert werden. Diese Stammzellen sind zur Selbsterneuerung, Selbstorganisation und Organfunktionalität fähig2. Organoide ahmen die Mikroumgebung des Gewebes nach und sind In-vivo-Modellen ähnlicher als zweidimensionale (2D) In-vitro-Zellkulturmodelle, obwohl sie weniger manipulierbar sind als Zellen 3,4. Dieses Modell beseitigt Hindernisse, die in 2D-Modellen auftreten, wie z. B. das Fehlen geeigneter Zell-Zell-Adhäsionen, Zell-Matrix-Interaktionen und homogener Populationen, und reduziert auch die Einschränkungen von Tiermodellen, einschließlich hoher Kosten und langer Zeiträume5. Darmorganoide - auch als Kolonoide für diejenigen bezeichnet, die aus Stammzellen der Kolonkrypta gezüchtet werden - sind im Wesentlichen Miniorgane, die ein Epithel enthalten, das alle Zelltypen enthält, die in vivo vorhanden wären, sowie ein Lumen. Dieses Modell ermöglicht die Manipulation des Systems, um viele Aspekte des Darms zu untersuchen, wie die Stammzellnische, Darmphysiologie, Pathophysiologie und Darmmorphogenese 3,5,6. Es bietet auch ein großartiges Modell für die Arzneimittelforschung, die Untersuchung menschlicher Darmerkrankungen wie entzündliche Darmerkrankungen (IBD) und Darmkrebs, patientenspezifische personalisierte Behandlungsentwicklung und die Untersuchung der Geweberegeneration 4,7,8,9. Darüber hinaus kann das Organoidsystem auch verwendet werden, um zelluläre Kommunikation, Arzneimittelmetabolismus, Lebensfähigkeit, Proliferation und Reaktion auf Reizezu untersuchen 7,8. Während Tiermodelle verwendet werden können, um potenzielle Therapeutika für intestinale pathologische Erkrankungen zu testen, sind sie ziemlich begrenzt, da die Untersuchung mehrerer Medikamente gleichzeitig eine Herausforderung darstellt. Es gibt mehr Störvariablen in vivo, und die damit verbundenen Kosten und Zeit sind hoch bzw. lang. Auf der anderen Seite ermöglicht das Organoidkultursystem das Screening vieler Therapeutika auf einmal in kürzerer Zeit und ermöglicht auch eine personalisierte Behandlung durch die Verwendung von patientenabgeleitetenOrganoidkulturen 4,8. Die Fähigkeit von Kolonorganoiden, Gewebeorganisation, Mikroumgebung und Funktionalität nachzuahmen, macht sie auch zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung von Regeneration und Gewebereparatur9. Unser Labor hat ein Dünndarm-Organoid-Kultursystem etabliert, um die Wirkung von Claudin-7 auf die Funktionen von Dünndarmstammzellen zu untersuchen10. In dieser Studie wird ein Dickdarm-Organoid-Kultursystem etabliert, um die Fähigkeit oder mangelnde Fähigkeit von Stammzellen zu untersuchen, sich selbst zu erneuern, zu differenzieren und sich in einem bedingten Claudin-7-Knockout-Modell (cKO) zu vermehren.
Claudin-7 ist ein sehr wichtiges Tight Junction (TJ)-Protein, das im Darm stark exprimiert wird und für die Aufrechterhaltung der TJ-Funktion und -Integrität unerlässlich ist11. cKO-Mäuse leiden an einem IBD-ähnlichen Phänotyp, der schwere Entzündungen, Ulzerationen, Epithelzellablagerungen, Adenome und erhöhte Zytokinspiegel aufweist11,12. Während allgemein anerkannt ist, dass Claudine für die epitheliale Barrierefunktion von entscheidender Bedeutung sind, entstehen neue Rollen für Clavine. Sie sind an Proliferation, Migration, Krebsprogression und Stammzellfunktion beteiligt 10,12,13,14,15,16,17. Derzeit ist nicht bekannt, wie sich Claudin-7 auf die Stammzellnische und die Funktion von Kolonstammzellen auswirkt. Da sich der Darm etwa alle 5-7 Tage schnell selbst erneuert, ist die Aufrechterhaltung der Stammzellnische und das ordnungsgemäße Funktionieren der aktiven Stammzellen von entscheidender Bedeutung18. Hier wird ein System etabliert, um die möglichen regulatorischen Effekte von Claudin-7 auf die Dickdarmstammzellnische zu untersuchen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

Das Darmepithel regeneriert sich alle 5-7 Tage und wird von der intestinalen Epithelstammzellpopulation (IESC) am Boden der Kryptenregion gesteuert. IESCs umfassen aktive Stammzellen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Epithelzelltypen differenzieren, und ruhende Stammzellen, die im Falle einer Verletzung als Reservestammzellen dienen. Die Regeneration des Darmepithels wird durch die sich selbst erneuernden und differenzierenden Fähigkeiten dieser aktiven IESCs gesteuert. Darüber hinaus sind das Gleichgewicht der kryptalen Stammzellpopulation und der Erhalt der Stammzellnische essentiell für die Darmregeneration. Die Organoidkultur ist ein wichtiger und attraktiver Ansatz zur Untersuchung von Proteinen, Signalmolekülen und Umwelthinweisen, die das Überleben und die Funktionen von Stammzellen regulieren. Dieses Modell ist kostengünstiger, weniger zeitaufwendig und manipulierbarer als Tiermodelle. Organoide ahmen auch die Mikroumgebung des Gewebes nach und sorgen für In-vivo-Relevanz . Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung von Kolonkrypten, die Einbettung dieser isolierten Kryptzellen in ein dreidimensionales Gelmatrixsystem und die Kultivierung von Kryptenzellen zur Bildung von Kolonorganoiden, die zur Selbstorganisation, Proliferation, Selbsterneuerung und Differenzierung fähig sind. Dieses Modell ermöglicht es, die Umwelt zu manipulieren - bestimmte Proteine wie Claudin-7 auszuschalten, Signalwege zu aktivieren / deaktivieren usw. - um zu untersuchen, wie diese Effekte die Funktion von Kolonstammzellen beeinflussen. Insbesondere wurde die Rolle des Tight-Junction-Proteins Claudin-7 bei der Funktion von Kolonstammzellen untersucht. Claudin-7 ist wichtig für die Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase und Barrierefunktion und -integrität. Knockout von Claudin-7 bei Mäusen induziert einen entzündlichen Darmerkrankungs-ähnlichen Phänotyp, der Darmentzündungen, Epithelhyperplasie, Gewichtsverlust, Schleimhautgeschwüre, Epithelzellablösung und Adenome aufweist. Zuvor wurde berichtet, dass Claudin-7 für intestinale epitheliale Stammzellfunktionen im Dünndarm benötigt wird. In diesem Protokoll wird ein Kolon-Organoid-Kultursystem etabliert, um die Rolle von Claudin-7 im Dickdarm zu untersuchen.

Um die regulatorischen Wirkungen von Claudin-7 auf Dickdarmstammzellen zu untersuchen, wurden Kolonkrypten aus murinem Dickdarmgewebe isoliert, wie oben beschrieben und in Abbildung 1A gezeigt. Sobald die Krypten aus dem primären Gewebe isoliert waren, wurden sie in einer 3D-Matrix in einer 96-Well-Platte plattiert, um 11 Tage lang zu wachsen (Abbildung 1). Normale gesunde Krypten schließen das Lumen und werden am 2. Tag zu Sphäroiden und beginnen schließlic...

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Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung eines murinen Kolonorganoidsystems zur Untersuchung der Aktivität und Funktion von Kolonstammzellen in einem Claudin-7-Knockout-Modell.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Untersuchung der Funktion von Dickdarmstammzellen in einer manipulierbaren Umgebung mit geringeren Zeitkosten als Tiermodelle. Die Organoidkultur ermöglicht die Untersuchung der Stammzellfunktion in einer immunfreien Umgebung. Dies ermöglicht es, die Auswirkungen einer bestimmten Ursache zu lokalisieren, wie z.B. den Knockout von Claudin-7.Das Verständnis der Mechanismen der Stammzellfunktion könnte Aufschluss über neue therapeutische Ziele für schwächende Krankheiten wie entzündliche Darmerkrankungen und Darmkrebs geben. Um die Isolierung von Kolonkrypten von der eingeschläferten Maus zu beginnen, machen Sie einen Einschnitt von etwa zwei Zoll entlang der Mittellinie der Maus. Dann stecken Sie die Haut zurück, um den Bauch freizulegen.Schneiden Sie den Dickdarm direkt unter dem Kokalum von der proximalen Seite und oberhalb des Rektums von der distalen Seite, um den Dickdarm zu isolieren. Als nächstes entfernen Sie das Fettgewebe, das am Dickdarm befestigt ist, mit einer Pinzette. Nachdem Sie den Kot mit dem flachen Ende der Pinzette aus dem isolierten Dickdarm herausgedrückt haben, schneiden Sie das Gewebe längs auf.Waschen Sie das Gewebe 10 bis 15 Mal mit kaltem PBS, indem Sie das Gewebe zwischen den Wäschen mit einer Pinzette in PBS herumwirbeln. Dann schneiden Sie das Gewebe mit einer sauberen, scharfen Schere in kleine Stücke von etwa drei bis fünf Millimetern. Nachdem Sie den Dickdarm von einer anderen euthanasierten Maus isoliert haben, kombinieren Sie alle Gewebestücke in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit kalten epithelialen Dissoziationsmedien und inkubieren Sie die Dickdarmgewebestücke in epithelialen Dissoziationsmedien für 90 Minuten bei vier Grad Celsius mit leichtem Schaukeln.Lassen Sie die Gewebefragmente nach der Inkubation auf den Boden des Röhrchens sinken. Nach dem Absetzen verwerfen Sie das epitheliale Dissoziationsmedium, ohne die Gewebefragmente zu stören. Wiederholen Sie den Vorgang, wenn Sie das Gewebe 10 bis 15 Mal mit kaltem PBS waschen.Entsorgen Sie so viel PBS wie möglich während der letzten Wäsche. Als nächstes fügen Sie kalte Krypta-Dissoziationsmedien zu den gewaschenen Darmgewebestücken in einem 50-Milliliter-Röhrchen hinzu und schütteln Sie es fünf bis 10 Minuten von Hand. Unter der Zellkulturhaube filtern Sie die Medien mit dem Gewebe mit einem 70-Mikron-Nylonzellsieb in ein frisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Nach der Filtration zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von der Entsorgung des Überstandes, ohne die pelletierten Krypten zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in drei bis vier Milliliter kaltem PBS. Pipette 10 Mikroliter der Kryptasuspension in einer Linie auf einem Objektträger.Zählen Sie mit dem Mikroskop die Anzahl der vollen, langen Krypten, um die Kryptenkonzentration zu schätzen, und berechnen Sie das geeignete Volumen an Krypten, die erforderlich sind, um 10 Krypten pro Mikroliter in einer 96-Well-Platte zu beschichten. Zentrifugieren Sie ein geeignetes Volumen isolierter Krypten in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann den Überstand mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette, ohne die pelletierten Krypten zu stören.Fügen Sie dann 100 Mikroliter Gelmatrix zu den pelletierten Krypten hinzu, ohne Luftblasen einzuführen. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis die Gelmatrix teilweise verfestigt ist. Dann werden 10 Mikroliter der Gelmatrix mit den Krypten in jeder Vertiefung einer vorgewärmten 96-Well-Kulturplatte vermischt, um eine Kuppelform zu bilden.Lassen Sie 10 bis 20 Minuten, bis die Gelmatrix vollständig eingestellt ist, indem Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid in einen Inkubator stellen. Schließlich werden 100 Mikroliter der frisch zubereiteten Arbeitslösung aus mit Antibiotika angereicherten L-WRN-Medien in jede Vertiefung gegeben und die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid für 24 Stunden inkubiert. Um die Organoide zu ernten, entfernen Sie alte Medien aus den Vertiefungen durch Vakuumsaugen und fixieren Sie die Organoide mit 4% Paraformaldehyd für eine Stunde bei Raumtemperatur.Dann 4% Paraformaldehyd aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugen entfernen und die Organoide mit 100 Mikrolitern 30% Saccharose pro Vertiefung bei vier Grad Celsius behandeln. Entfernen Sie nach 24 Stunden 30% Saccharose aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugung, bevor Sie 10 Mikroliter PBS in jede Vertiefung geben. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um den Boden der Vertiefung vorsichtig zu zerkratzen, um die kuppelhaltigen Organoide zu dissoziieren.Als nächstes entfernen Sie das PBS, das die dissoziierten Organoide enthält, mit einer Pipette aus der Vertiefung und geben Sie es in eine beschriftete Kunststoffform, die zu 90% mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung gefüllt ist. Setzen Sie den Vorgang fort, bis alle Organoide aus allen Vertiefungen entfernt wurden. Fügen Sie 2-Methylbutan zu einem Dewar-Kolben aus Edelstahl hinzu, der Trockeneispellets enthält, genug, um die Pellets zu bedecken.Schockgefrieren des Organoids, das OCT-Block enthält, indem Sie es stetig über dem 2-Methylbutan halten. Zum Schluss lagern Sie den organoidhaltigen OCT-Block bei minus 80 Grad Celsius, bis er zum Schneiden bereit ist. Das repräsentative Bild unterstreicht das erfolgreiche Wachstum von Kolonoiden aus normalen Krypten, die Claudin-7 enthalten.Die Krypten, die Claudin-7 enthielten, begannen am zweiten Tag Sphäroide zu bilden, begannen am fünften Tag zu knospen und wuchsen und knospten weiter, bis sie am neunten Tag geerntet wurden. Im Gegensatz dazu konnten Krypten ohne Claudin-7 keine richtigen Kolonoide bilden. Nach einer zwei- bis dreitägigen Behandlung mit 4-Hydroxytamoxifen erschienen die Claudin-7-Knockout-Krypten als kreisförmige Zellklumpen.Im Gegensatz zur Kontrolle wuchsen die Krypten nicht zu gesunden Sphäroiden heran. Immunfluoreszenzfärbung für Claudin-7 in der geernteten Kontrolle und die bedingten Knockout-Organoide bestätigten den erfolgreichen Knockout von Claudin-7 in Kultur. Die Kontrollkolonoide zeigten am neunten Tag sehr wenig apoptotische Signale.Claudin-7-Knockout-Kolonoide zeigten jedoch gleichzeitig eine hohe Apoptose. Stellen Sie vor der Beschichtung eine partielle Erstarrung sicher. Die Beschichtung vor der teilweisen Erstarrung führt dazu, dass sich die Gelmatrix ausbreitet und die Kuppel nicht gebildet wird, was das Überleben und das Wachstum der Krypten beeinträchtigt.Dieses Protokoll kann für die Arzneimittelforschung, die Untersuchung der zellulären Kommunikation, des Arzneimittelmetabolismus, der Lebensfähigkeit, der Proliferation und der Entwicklung einer patientenspezifischen personalisierten Behandlung verwendet werden. Die Etablierung der Organoidkultur hat das Studium von Krankheiten und die personalisierte Medizin revolutioniert.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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