Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי NIH DK103166.

כל הניסויים והנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מזרח קרוליינה (ECU) (IACUC) ונערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ו-ECU לגבי טיפול ושימוש בחיות מעבדה. עכברי נוקאאוט מסוג claudin-7 שאינם ניתנים להשראה וספציפיים למעיים נוצרו על-ידי חציית C57BL6 claudin-7-flox עכ...

<ol>
	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

תרבית אורגנואידית היא מודל מצוין לחקר תפקוד תאי גזע, פיזיולוגיה של המעי, גילוי תרופות, מחלות מעיים אנושיות והתחדשות ותיקון רקמות 7,8,9,10,11,26. אמנם יש לו יתרונות רבים, אך הוא יכול להיות ...

תרבית אורגנואידית מעיים היא מערכת ex vivo תלת-ממדית (3D) שבה מבודדים תאי גזע משכבות המעיים של הרקמה הראשונית ומצופים למטריצת ג'ל 1,2. תאי גזע אלה מסוגלים להתחדשות עצמית, ארגון עצמי ותפקוד איברים2. אורגנואידים מחקים את המיקרו-סביבה של הרקמה ודומים יותר למודלים של in vivo מאשר למודלים דו-ממדיים (דו-ממדיים) של תרביות תאים במבחנה, אם כי פחות ניתנים למניפולציה מאשר לתאים 3,4. מודל זה מבטל מכשולים שנתקלים בהם במודלים דו-ממדיים, כגון היעדר הידבקויות תקינות בין תאים לתאים, אינטראקציות בין תאים ואוכלוסיות הומוגניות, וגם מצמצם את המגבלות של מודלים של בעלי חיים, כולל עלויות גבוהות ותקופות זמן ארוכות5. אורגנואידים במעיים - המכונים גם קולונואידים עבור אלה שגדלו מתאי גזע שמקורם בקריפטה של המעי הגס - הם למעשה מיני-איברים המכילים אפיתל הכולל את כל סוגי התאים שיהיו נוכחים ב- vivo, כמו גם לומן. מודל זה מאפשר מניפולציה של המערכת כדי לחקור היבטים רבים של המעי, כגון נישה של תאי גזע, פיזיולוגיה של המעי, פתופיזיולוגיה ומורפוגנזה של המעיים 3,5,6. הוא גם מספק מודל נהדר לגילוי תרופות, חקר הפרעות מעיים אנושיות כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) וסרטן המעי הגס, פיתוח טיפול מותאם אישית ספציפי למטופל, וחקר התחדשות רקמות 4,7,8,9. בנוסף, המערכת האורגנואידית יכולה לשמש גם לחקר תקשורת תאית, מטבוליזם של תרופות, כדאיות, התפשטות ותגובה לגירויים 7,8. בעוד שניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים כדי לבחון טיפולים פוטנציאליים עבור מצבים פתולוגיים במעיים, הם מוגבלים למדי, מכיוון שחקר תרופות מרובות בו-זמנית מהווה אתגר. ישנם משתנים מבלבלים יותר in vivo, והעלות והזמן הקשורים הם גבוהים וארוכים, בהתאמה. מאידך גיסא, מערכת התרבית האורגנואידית מאפשרת סינון של טיפולים רבים בבת אחת בפרק זמן קצר יותר וכן מאפשרת טיפול מותאם אישית באמצעות שימוש בתרבית אורגנואידיתשמקורה בחולה 4,8. היכולת של אורגנואידים במעי הגס לחקות ארגון רקמות, מיקרו-סביבה ופונקציונליות הופכת אותם גם למודל מצוין לחקר התחדשות ותיקון רקמות9. המעבדה שלנו הקימה מערכת תרבית אורגנואידית במעי הדק כדי לחקור את ההשפעה של קלודין-7 על תפקודי תאי גזע במעי הדק10. במחקר זה הוקמה מערכת תרבית אורגנואידית במעי הגס כדי לחקור את יכולתם, או חוסר יכולתם של תאי גזע, לחדש את עצמם, להתמיין ולהתרבות במודל של נוקאאוט קלודין-7 מותנה (cKO).
קלודין-7 הוא חלבון חשוב מאוד של צומת הדוק (TJ) המתבטא מאוד במעי וחיוני לשמירה על תפקוד ותקינות TJ11. עכברי cKO סובלים מפנוטיפ דמוי IBD, המציג דלקת קשה, כיבים, רפיון תאי אפיתל, אדנומות ורמות ציטוקינים מוגברות11,12. בעוד שמקובל לחשוב שקלודינים חיוניים לתפקוד מחסום אפיתל, מתפתחים תפקידים חדשים לקלאודינים; הם מעורבים בהתפשטות, הגירה, התקדמות סרטן ותפקוד תאי גזע 10,12,13,14,15,16,17. כיום לא ידוע כיצד קלודין-7 משפיע על נישה של תאי גזע ותפקוד של תאי גזע במעי הגס. מכיוון שהמעי מתחדש במהירות כל 5-7 ימים בערך, תחזוקה של נישת תאי הגזע ותפקוד תקין של תאי הגזע הפעילים חיוניים18. כאן הוקמה מערכת לבחינת ההשפעות הרגולטוריות הפוטנציאליות של קלודין-7 על נישת תאי הגזע של המעי הגס.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

אפיתל המעי מתחדש כל 5-7 ימים, ונשלט על ידי אוכלוסיית תאי הגזע של אפיתל המעי (IESC) הממוקמת בתחתית אזור הקריפטה. IESCs כוללים תאי גזע פעילים, המחדשים את עצמם ומתמיינים לסוגי תאי אפיתל שונים, ותאי גזע שקטים, המשמשים כתאי גזע עתודות במקרה של פציעה. התחדשות אפיתל המעי נשלטת על ידי יכולות ההתחדשות וההבחנה של IESCs פעילים אלה. בנוסף, איזון אוכלוסיית תאי הגזע בקריפטה ושמירה על נישת תאי הגזע חיוניים להתחדשות המעיים. תרבית אורגנואידית היא גישה חשובה ואטרקטיבית לחקר חלבונים, מולקולות איתות ורמזים סביבתיים המווסתים את ההישרדות והתפקוד של תאי גזע. דגם זה זול יותר, גוזל פחות זמן וניתן למניפולציה רבה יותר ממודלים של בעלי חיים. אורגנואידים גם מחקים את המיקרו-סביבה של הרקמה, ומספקים רלוונטיות in vivo . הפרוטוקול הנוכחי מתאר את בידודן של קריפטות המעי הגס, הטמעת תאי קריפטה מבודדים אלה במערכת מטריצת ג'ל תלת-ממדית והפיכת תאי קריפטה ליצירת אורגנואידים של המעי הגס המסוגלים לארגון עצמי, התפשטות, התחדשות עצמית והתמיינות. מודל זה מאפשר לאדם לתמרן את הסביבה - לדפוק חלבונים ספציפיים כגון claudin-7, הפעלה/השבתה של מסלולי איתות וכו' - כדי לחקור כיצד השפעות אלה משפיעות על תפקודם של תאי גזע במעי הגס. באופן ספציפי, נבדק תפקידו של חלבון הצומת ההדוק קלודין-7 בתפקוד תאי גזע המעי הגס. Claudin-7 חיוני לשמירה על הומאוסטזיס במעיים ועל תפקוד המחסום ותקינותם. נוקאאוט של קלודין-7 בעכברים גורם לפנוטיפ דמוי מחלת מעי דלקתית המציג דלקת מעיים, היפרפלזיה אפיתליאלית, ירידה במשקל, כיבים ברירית, רפיון תאי אפיתל ואדנומות. בעבר דווח כי קלודין-7 נדרש לתפקודי תאי גזע אפיתל במעי הדק. בפרוטוקול זה, מערכת תרבית אורגנואידית המעי הגס הוקמה כדי לחקור את התפקיד של claudin-7 במעי הגס.

כדי לבחון את ההשפעות הרגולטוריות של קלודין-7 על תאי גזע של המעי הגס, בודדו קריפטות של המעי הגס מרקמת המעי הגס כפי שתואר לעיל ומוצג באיור 1A. לאחר שהקריפטות בודדו מהרקמה הראשונית, הן צופו במטריצה תלת-ממדית בלוח של 96 בארות כדי לגדול במשך 11 ימים (איור 1). קריפטות בר...

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמת מערכת אורגנואידית של המעי הגס כדי לחקור את הפעילות והתפקוד של תאי גזע המעי הגס במודל נוקאאוט של קלודין-7.

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

פרוטוקול זה מספק שיטה לחקור את התפקוד של תאי גזע המעי הגס בסביבה מניפולטיבית עם עלות נמוכה יותר בזמן מאשר מודלים של בעלי חיים. תרבית אורגנואידית מאפשרת לחקור את תפקוד תאי הגזע בסביבה נטולת מערכת החיסון. זה מאפשר לאתר את ההשפעות של גורם מסוים, כגון נוקאאוט של claudin-7.הבנת המנגנונים של תפקוד תאי גזע עשויה לשפוך אור על יעדים טיפוליים חדשים למחלות מתישות כמו מחלות מעי דלקתיות וסרטן המעי הגס. כדי להתחיל בבידוד של קריפטות המעי הגס מהעכבר המומת, בצע חתך של כשני סנטימטרים לאורך קו האמצע של העכבר. לאחר מכן, הצמד בחזרה את העור כדי לחשוף את הבטן.חותכים את המעי הגס ממש מתחת לקואקום מהצד הפרוקסימלי ומעל פי הטבעת מהצד הדיסטלי כדי לבודד את המעי הגס. לאחר מכן, להסיר את רקמת השומן מחובר המעי הגס באמצעות מלקחיים. לאחר דחיפת צואה מהמעי הגס המבודד עם הקצה השטוח של המלקחיים, חותכים את הרקמה פתוחה לאורך.שטפו את הרקמה 10 עד 15 פעמים עם PBS קר על ידי סיבוב הרקמה ב-PBS בין שטיפות עם מלקחיים. לאחר מכן באמצעות זוג מספריים נקיים וחדים, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות הנעות בין כשלושה לחמישה מילימטרים. לאחר בידוד המעי הגס מעכבר אחר, יש לשלב את כל חלקי הרקמה בצינור צנטריפוגה בקוטר 50 מיליליטר המכיל מדיית דיסוציאציה אפיתליאלית קרה ולדגור את חלקי רקמת המעי הגס במדיית דיסוציאציה אפיתליאלית למשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה.לאחר הדגירה, אפשרו לשברי הרקמה לשקוע לתחתית הצינור. לאחר ההתיישבות, יש להשליך את מדיית הדיסוציאציה האפיתליאלית מבלי לשבש את שברי הרקמות. חזור על התהליך בעת שטיפת הרקמה 10 עד 15 פעמים עם PBS קר.יש להשליך כמה שיותר PBS במהלך הכביסה הסופית. לאחר מכן, הוסיפו מדיית דיסוציאציה קרה לחתיכות רקמת המעי הגס השטופות בצינור של 50 מיליליטר ונערו במשך חמש עד 10 דקות ביד. מתחת למכסה המנוע של תרבית התאים, סננו את המדיה המכילה את הרקמה באמצעות מסננת תאי ניילון בגודל 70 מיקרון לתוך צינור צנטריפוגה טרי של 50 מיליליטר.לאחר הסינון, צנטריפוגה של הצינור ב 200 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן השלכת supernatant מבלי להפריע את הקריפטות כדורי. להשעות את הכדור בשלושה עד ארבעה מיליליטר של PBS קר. פיפטה 10 מיקרוליטר של מתלה הקריפטה בשורה על שקופית מיקרוסקופ.באמצעות המיקרוסקופ, יש לספור את מספר הקריפטות המלאות והארוכות כדי להעריך את ריכוז הקריפטות ולחשב את נפח הקריפטות המתאים הנדרש לצלחת 10 קריפטות למיקרוליטר בלוח של 96 בארות. צנטריפוגה נפח מתאים של קריפטות מבודדות בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר ב 200 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר מבלי לשבש את הקריפטות הגלולות.לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של מטריצת ג'ל לקריפטות הכדוריות מבלי להציג בועות אוויר. המתן דקה עד שתי דקות עד שמטריצת הג'ל תתמצק חלקית. לאחר מכן, צלחת 10 מיקרוליטרים של מטריצת הג'ל מעורבבים עם הקריפטות בכל באר של צלחת תרבית 96 באר שחוממה מראש כדי ליצור צורת כיפה.יש להמתין 10 עד 20 דקות עד להגדרה מלאה של מטריצת הג'ל על ידי הנחת הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לבסוף, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת העבודה הטרייה של מדיה L-WRN בתוספת אנטיביוטיקה לכל באר ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. כדי לקצור את האורגנואידים, הסר מדיה ישנה מהבארות על ידי הפעלת שאיבה ואקום ותקן את האורגנואידים עם 4% paraformaldehyde במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן הסר 4% paraformaldehyde מן הבארות על ידי שאיבה ואקום ולטפל אורגנואידים עם 100 microliters של 30% סוכרוז לכל באר בארבע מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, יש להסיר 30% סוכרוז מהבארות על ידי שאיבה בוואקום לפני הוספת 10 מיקרוליטרים של PBS לכל באר. השתמש בקצה פיפטה כדי לגרד בעדינות את החלק התחתון של הבאר כדי לנתק את האורגנואידים המכילים כיפה.לאחר מכן, הסר את ה- PBS המכיל את האורגנואידים המנותקים מהבאר עם פיפטה והעבר אותו לתבנית פלסטיק מסומנת מלאה 90% עם טמפרטורת חיתוך אופטימלית, או OCT, תרכובת. ממשיכים בתהליך עד שכל האורגנואידים הוסרו מכל הבארות. הוסיפו 2-מתילבוטאן לבקבוק דיואר מפלדת אל-חלד המכיל כדורי קרח יבשים, מספיק כדי לכסות את הכדורים.הקפיאו את האורגנואיד המכיל בלוק OCT על ידי החזקתו בהתמדה מעל 2-מתילבוטאן. לבסוף, אחסנו את בלוק ה-OCT המכיל אורגנואיד במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לחתך. התמונה המייצגת מדגישה את הצמיחה המוצלחת של קולונואידים מקריפטות רגילות המכילות קלודין-7.הקריפטות שהכילו קלודין-7 החלו ליצור ספרואידים ביום השני, התחילו לנדוד ביום החמישי, והמשיכו לגדול ולנבוט עד שנקטפו ביום התשיעי. לעומת זאת, קריפטות חסרות קלודין-7 לא הצליחו ליצור קולונואידים תקינים. לאחר טיפול עם 4-hydroxytamoxifen במשך יומיים עד שלושה ימים, קריפטות נוקאאוט claudin-7 הופיעו כגושים עגולים של תאים.שלא כמו הבקרה, הקריפטות לא גדלו לספרואידים בריאים. הכתמה אימונופלואורסצנטית של קלאודין-7 בבקרה שנקטפה והאורגנואידים המותנים של נוקאאוט אישרו את הנוקאאוט המוצלח של קלודין-7 בתרבית. מושבי הבקרה הפגינו מעט מאוד אות אפופטוטי ביום התשיעי.עם זאת, קולונואידים נוקאאוט claudin-7 הציגו אפופטוזיס גבוה באותו זמן. יש לוודא התמצקות חלקית לפני הציפוי. ציפוי לפני התמצקות חלקית יגרום למטריצת הג'ל להתפשט והכיפה לא תיווצר, מה שישפיע על הישרדותן וצמיחתן של הקריפטות.פרוטוקול זה עשוי לשמש לגילוי תרופות, חקר תקשורת תאית, חילוף חומרים של תרופות, כדאיות, שגשוג ופיתוח טיפול מותאם אישית ספציפי למטופל. כינון התרבות האורגנואידית חולל מהפכה בחקר מחלות וברפואה מותאמת אישית.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו Cell Carcinoma Hepatocellular האדם HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

הערכת מוות תאים באמצעות Supernatant ללא תאים של פרוביוטיקה בתרביות כדוריות תלת מימדיות של תאים סרטניים המעי הגס

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

מודל תלת מימדי של ספרואידים לחקר תאי גזע סרטניים המעי הגס

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...