Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

इस अध्ययन को एनआईएच डीके 103166 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

सभी पशु प्रयोगों और प्रक्रियाओं को ईस्ट कैरोलिना यूनिवर्सिटी (ईसीयू) पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला पशु देखभाल और उपयोग पर राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्था...

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	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

ऑर्गेनॉइड कल्चर स्टेम सेल फ़ंक्शन, आंतों के शरीर विज्ञान, दवा की खोज, मानव आंतों के रोगों और ऊतक पुनर्जनन और मरम्मत 7,8,9,10,11,26 का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृ?...

आंतों के ऑर्गेनॉइड कल्चर एक त्रि-आयामी (3 डी) एक्स विवो सिस्टम है जिसमें स्टेम कोशिकाओं को प्राथमिक ऊतक के आंतों के क्रिप्ट से अलग किया जाता है और जेल मैट्रिक्स 1,2 में चढ़ाया जाता है। ये स्टेम सेल आत्म-नवीकरण, आत्म-संगठन और अंग कार्यक्षमतामें सक्षम हैं। ऑर्गेनोइड्स ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करते हैं और विट्रो सेल कल्चर मॉडल में दो-आयामी (2 डी) की तुलना में विवो मॉडल में अधिक समान होते हैं, हालांकि कोशिकाओं 3,4 की तुलना में कम मैनिपुलेटेबल होते हैं। यह मॉडल 2 डी मॉडल में आने वाली बाधाओं को समाप्त करता है, जैसे कि उचित सेल-सेल आसंजन, सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन और समरूप आबादी की कमी, और पशु मॉडल की सीमाओं को भी कम करता है, जिसमें उच्च लागत और समय की लंबी अवधिशामिल है। आंतों के ऑर्गेनोइड्स - जिन्हें कोलोनिक क्रिप्ट-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं से उगाए गए लोगों के लिए कोलोनोइड्स के रूप में भी जाना जाता है- अनिवार्य रूप से मिनी-अंग होते हैं जिनमें सभी सेल प्रकारों सहित एक उपकला होती है जो विवो में मौजूद होगी, साथ ही साथ एक लुमेन भी। यह मॉडल आंत के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए सिस्टम के हेरफेर की अनुमति देता है, जैसे कि स्टेम सेल आला, आंतों के शरीर विज्ञान, पैथोफिज़ियोलॉजी, और आंत मोर्फोजेनेसिस 3,5,6। यह दवा की खोज के लिए एक महान मॉडल भी प्रदान करता है, मानव आंतों के विकारों जैसे सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) और कोलोरेक्टल कैंसर, रोगी-विशिष्ट व्यक्तिगत उपचार विकास और ऊतक पुनर्जनन 4,7,8,9 का अध्ययन करता है। इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड सिस्टम का उपयोग सेलुलर संचार, दवा चयापचय, व्यवहार्यता, प्रसार औरउत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। जबकि पशु मॉडल का उपयोग आंतों की पैथोलॉजिकल स्थितियों के लिए संभावित चिकित्सीय का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, वे काफी सीमित हैं, क्योंकि एक बार में कई दवाओं का अध्ययन करना एक चुनौती है। विवो में अधिक भ्रामक चर हैं, और संबंधित लागत और समय क्रमशः उच्च और लंबे हैं। दूसरी ओर, ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम कम समय अवधि में एक बार में कई चिकित्सीय की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है और रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड कल्चर 4,8 के उपयोग के माध्यम से व्यक्तिगत उपचार की भी अनुमति देता है। ऊतक संगठन, माइक्रोएन्वायरमेंट और कार्यक्षमता की नकल करने के लिए कोलोनिक ऑर्गेनोइड्स की क्षमता भी उन्हें पुनर्जनन औरऊतक की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाती है। हमारी प्रयोगशाला ने छोटी आंत स्टेम सेल कार्यों 10 पर क्लॉडिन -7 के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक छोटी आंत ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम स्थापितकिया है। इस अध्ययन में, स्टेम कोशिकाओं की क्षमता, या क्षमता की कमी का अध्ययन करने के लिए एक बड़ी आंतों की ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रणाली स्थापित की गई है, जो सशर्त क्लॉडिन -7 नॉकआउट (सीकेओ) मॉडल में आत्म-नवीनीकरण, अंतर और प्रसार के लिए है।
क्लॉडिन -7 एक बहुत ही महत्वपूर्ण तंग जंक्शन (टीजे) प्रोटीन है जो आंत में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है और टीजे फ़ंक्शन और अखंडताको बनाए रखने के लिए आवश्यक है। सीकेओ चूहे आईबीडी जैसे फेनोटाइप से पीड़ित हैं, जो गंभीर सूजन, अल्सरेशन, उपकला कोशिका स्लॉइंग, एडेनोमा और साइटोकिन स्तर11,12 में वृद्धि का प्रदर्शन करते हैं। हालांकि यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि क्लैडिन उपकला बाधा समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्लॉडिन के लिए नई भूमिकाएं उभर रही हैं; वे प्रसार, प्रवासन, कैंसर की प्रगति और स्टेम सेल फ़ंक्शन 10,12,13,14,15,16,17 में शामिल हैं। वर्तमान में यह अज्ञात है कि क्लॉडिन -7 स्टेम सेल आला और कोलोनिक स्टेम कोशिकाओं के कार्य को कैसे प्रभावित करता है। चूंकि आंत लगभग हर 5-7 दिनों में तेजी से स्व-नवीनीकरण करती है, स्टेम सेल आला का रखरखाव और सक्रिय स्टेम कोशिकाओं का उचितकार्य महत्वपूर्ण है। यहां, कोलोनिक स्टेम सेल आला पर क्लॉडिन -7 के संभावित नियामक प्रभावों की जांच करने के लिए एक प्रणाली स्थापित की गई है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

आंतों का एपिथेलियम हर 5-7 दिनों में पुनर्जीवित होता है, और क्रिप्ट क्षेत्र के तल पर स्थित आंतों के उपकला स्टेम सेल (आईईएससी) आबादी द्वारा नियंत्रित होता है। आईईएससी में सक्रिय स्टेम सेल शामिल हैं, जो विभिन्न उपकला कोशिका प्रकारों में आत्म-नवीनीकरण और अंतर करते हैं, और क्विसेंट स्टेम सेल, जो चोट के मामले में आरक्षित स्टेम कोशिकाओं के रूप में काम करते हैं। आंतों के उपकला का पुनर्जनन इन सक्रिय आईईएससी की आत्म-नवीनीकरण और विभेदक क्षमताओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसके अलावा, क्रिप्ट स्टेम सेल आबादी का संतुलन और आंतों के उत्थान के लिए स्टेम सेल आला का रखरखाव आवश्यक है। ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रोटीन, सिग्नलिंग अणुओं और पर्यावरणीय संकेतों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण और आकर्षक दृष्टिकोण है जो स्टेम सेल अस्तित्व और कार्यों को नियंत्रित करता है। यह मॉडल पशु मॉडल की तुलना में कम महंगा, कम समय लेने वाला और अधिक मैनिपुलेटेबल है। ऑर्गेनोइड्स ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल भी करते हैं, जो विवो प्रासंगिकता प्रदान करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल कोलोनिक क्रिप्ट्स के अलगाव का वर्णन करता है, इन पृथक क्रिप्ट कोशिकाओं को तीन आयामी जेल मैट्रिक्स सिस्टम में एम्बेड करता है और स्व-संगठन, प्रसार, आत्म-नवीकरण और भेदभाव में सक्षम कोलोनिक ऑर्गेनोइड बनाने के लिए क्रिप्ट कोशिकाओं की खेती करता है। यह मॉडल किसी को पर्यावरण-दस्तक देने वाले विशिष्ट प्रोटीन जैसे क्लाउडिन -7, सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय / निष्क्रिय करने आदि में हेरफेर करने की अनुमति देता है - यह अध्ययन करने के लिए कि ये प्रभाव कोलोनिक स्टेम कोशिकाओं के कामकाज को कैसे प्रभावित करते हैं। विशेष रूप से, कोलोनिक स्टेम सेल फ़ंक्शन में तंग जंक्शन प्रोटीन क्लॉडिन -7 की भूमिका की जांच की गई थी। क्लॉडिन -7 आंतों के होमियोस्टैसिस और बाधा कार्य और अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। चूहों में क्लॉडिन -7 का नॉकआउट आंतों की सूजन, उपकला हाइपरप्लासिया, वजन घटाने, म्यूकोसल अल्सरेशन, उपकला कोशिका सूजन और एडेनोमा का प्रदर्शन करने वाले सूजन आंत्र रोग जैसे फेनोटाइप को प्रेरित करता है। इससे पहले, यह बताया गया था कि छोटी आंत में आंतों के उपकला स्टेम सेल कार्यों के लिए क्लॉडिन -7 की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, बड़ी आंत में क्लॉडिन -7 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक कोलोनिक ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम स्थापित किया गया है।

बृहदान्त्र स्टेम कोशिकाओं पर क्लॉडिन -7 के नियामक प्रभावों की जांच करने के लिए, कोलोनिक क्रिप्ट्स को मुराइन बृहदान्त्र ऊतक से अलग किया गया था जैसा कि ऊपर वर्णित है और चित्रा 1 ए में दिखाया गया...

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Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

वर्तमान प्रोटोकॉल एक क्लॉडिन -7 नॉकआउट मॉडल में कोलोनिक स्टेम कोशिकाओं की गतिविधि और कामकाज का अध्ययन करने के लिए एक मुराइन कोलोनिक ऑर्गेनॉइड सिस्टम स्थापित करने का वर्णन करता है।

आंतों के स्टेम सेल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए मुराइन कोलोनिक क्रिप्ट्स की त्रि-आयामी संस्कृति

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

यह प्रोटोकॉल पशु मॉडल की तुलना में समय में कम लागत के साथ एक मैनिपुलेटेड वातावरण में बृहदान्त्र स्टेम कोशिकाओं के कार्य का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रतिरक्षा मुक्त वातावरण में स्टेम सेल फ़ंक्शन के अध्ययन की अनुमति देती है। यह एक विशिष्ट कारण के प्रभावों को इंगित करने की अनुमति देता है, जैसे कि क्लॉडिन -7 का नॉकआउट।स्टेम सेल फ़ंक्शन के तंत्र को समझना सूजन आंत्र रोग और कोलोरेक्टल कैंसर जैसी दुर्बल बीमारियों के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों पर प्रकाश डाल सकता है। इच्छामृत्यु माउस से कोलोनिक क्रिप्ट्स का अलगाव शुरू करने के लिए, माउस की मध्य रेखा से लगभग दो इंच नीचे चीरा लगाएं। फिर, पेट को उजागर करने के लिए त्वचा को वापस पिन करें।बृहदान्त्र को अलग करने के लिए बृहदान्त्र को समीपस्थ पक्ष से कोकम के ठीक नीचे और बाहर की तरफ से मलाशय के ऊपर काटें। इसके बाद, बल का उपयोग करके बृहदान्त्र से जुड़े वसा ऊतक को हटा दें। बल के सपाट छोर के साथ पृथक बृहदान्त्र से मल को बाहर धकेलने के बाद, ऊतक को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें।ऊतक को ठंडे पीबीएस के साथ 10 से 15 बार धोएं, पीबीएस में ऊतक को बल के साथ धोने के बीच घुमाकर। फिर साफ, तेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके, ऊतक को लगभग तीन से पांच मिलीमीटर तक के छोटे टुकड़ों में काट लें। एक अन्य इच्छामृत्यु वाले माउस से बृहदान्त्र को अलग करने के बाद, ठंडे उपकला पृथक्करण मीडिया वाले 50-मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सभी ऊतक टुकड़ों को मिलाएं और कोलन ऊतक के टुकड़ों को उपकला पृथक्करण मीडिया में 90 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर कोमल रॉकिंग के साथ इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, ऊतक के टुकड़ों को ट्यूब के तल पर डूबने दें। एक बार बसने के बाद, ऊतक के टुकड़ों को बाधित किए बिना उपकला पृथक्करण मीडिया को छोड़ दें। ठंडे पीबीएस के साथ ऊतक को 10 से 15 बार धोते समय प्रक्रिया को दोहराएं।अंतिम धोने के दौरान जितना संभव हो उतना पीबीएस छोड़ दें। इसके बाद, 50-मिलीलीटर ट्यूब में धुले हुए बृहदान्त्र ऊतक के टुकड़ों में ठंडा क्रिप्ट पृथक्करण मीडिया जोड़ें और हाथ से पांच से 10 मिनट तक हिलाएं। सेल कल्चर हुड के तहत, 70-माइक्रोन नायलॉन सेल स्ट्रेनर के साथ ऊतक युक्त मीडिया को ताजा-50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में फ़िल्टर करें।निस्पंदन के बाद, ट्यूब को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें, इसके बाद पेलेट क्रिप्ट को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। तीन से चार मिलीलीटर ठंडे पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें। माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक पंक्ति में क्रिप्ट निलंबन के पिपेट 10 माइक्रोलीटर।माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, क्रिप्ट एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए पूर्ण, लंबे क्रिप्ट की संख्या की गणना करें और 96-वेल प्लेट में प्रति माइक्रोलीटर 10 क्रिप्ट्स को प्लेट करने के लिए आवश्यक क्रिप्ट्स की उचित मात्रा की गणना करें। सेंट्रीफ्यूज चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 200 ग्राम पर 1.5-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पृथक क्रिप्ट्स की एक उपयुक्त मात्रा है। फिर, पेलेट क्रिप्ट को बाधित किए बिना 1,000-माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को हटा दें।फिर, हवा के बुलबुले पेश किए बिना पेलेट क्रिप्ट्स में जेल मैट्रिक्स के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। जेल मैट्रिक्स आंशिक रूप से ठोस होने तक एक से दो मिनट तक प्रतीक्षा करें। फिर, जेल मैट्रिक्स के प्लेट 10 माइक्रोलीटर को गुंबद के आकार बनाने के लिए पूर्व-गर्म 96-वेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में क्रिप्ट के साथ मिलाया जाता है।5% कार्बन डाइऑक्साइड के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में प्लेट रखकर जेल मैट्रिक्स को पूरी तरह से सेट करने के लिए 10 से 20 मिनट की अनुमति दें। अंत में, प्रत्येक कुएं में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक एल-डब्ल्यूआरएन मीडिया के ताजा तैयार कामकाजी समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्लेट को 24 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ऑर्गेनोइड्स की कटाई के लिए, वैक्यूम सक्शन लगाकर कुओं से पुराने मीडिया को हटा दें और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ऑर्गेनोइड्स को ठीक करें।फिर वैक्यूम सक्शन द्वारा कुओं से 4% पैराफॉर्मलडिहाइड को हटा दें और चार डिग्री सेल्सियस पर प्रति कुएं 30% सुक्रोज के 100 माइक्रोलीटर के साथ ऑर्गेनोइड्स का इलाज करें। 24 घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 10 माइक्रोलीटर जोड़ने से पहले वैक्यूम सक्शन द्वारा कुओं से 30% सुक्रोज हटा दें। गुंबद युक्त ऑर्गेनोइड्स को अलग करने के लिए कुएं के तल को धीरे से खरोंचने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें।इसके बाद, पिपेट के साथ कुएं से अलग किए गए ऑर्गेनोइड्स वाले पीबीएस को हटा दें और इसे इष्टतम काटने के तापमान, या ओसीटी, यौगिक के साथ 90% से भरे लेबल वाले प्लास्टिक मोल्ड में स्थानांतरित करें। प्रक्रिया को तब तक जारी रखें जब तक कि सभी कुओं से सभी ऑर्गेनोइड्स को हटा न दिया जाए। एक स्टेनलेस स्टील देवर फ्लास्क में 2-मेथिलबुटेन जोड़ें जिसमें सूखी बर्फ के छर्रों होते हैं, जो छर्रों को कवर करने के लिए पर्याप्त होते हैं।फ्लैश-फ्रीज़ ओसीटी ब्लॉक युक्त ऑर्गेनॉइड को 2-मेथिलब्यूटेन के ऊपर लगातार पकड़कर फ्रीज करें। अंत में, ऑर्गेनॉइड युक्त ओसीटी ब्लॉक को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस नीचे रखें जब तक कि सेक्शन के लिए तैयार न हो जाए। प्रतिनिधि छवि क्लॉडिन -7 युक्त सामान्य क्रिप्ट से कोलोनोइड्स के सफल विकास पर प्रकाश डालती है।क्लॉडिन -7 युक्त क्रिप्ट्स ने दूसरे दिन तक स्फेरॉइड बनाना शुरू कर दिया, पांचवें दिन से उभरना शुरू कर दिया, और नौवें दिन कटाई तक बढ़ता और उभरता रहा। इसके विपरीत, क्लॉडिन -7 की कमी वाले क्रिप्ट उचित कोलोनोइड बनाने में विफल रहे। दो से तीन दिनों के लिए 4-हाइड्रॉक्सीटामोक्सीफेन के साथ उपचार के बाद, क्लाउडिन -7 नॉकआउट क्रिप्ट कोशिकाओं के गोलाकार झुरमुट के रूप में दिखाई दिए।नियंत्रण के विपरीत, क्रिप्ट स्वस्थ स्फेरॉइड में विकसित नहीं हुए। कटे हुए नियंत्रण में क्लॉडिन -7 के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन और सशर्त नॉकआउट ऑर्गेनोइड्स ने संस्कृति में क्लाउडिन -7 के सफल नॉकआउट की पुष्टि की। नियंत्रण कोलोनोइड्स ने नौवें दिन बहुत कम एपोप्टोटिक संकेत का प्रदर्शन किया।हालांकि, क्लॉडिन -7 नॉकआउट कोलोनोइड्स ने एक ही समय में उच्च एपोप्टोसिस प्रदर्शित किया। चढ़ाना से पहले आंशिक ठोसकरण सुनिश्चित करें। आंशिक जमने से पहले चढ़ाना जेल मैट्रिक्स को फैलने का कारण बनेगा और गुंबद नहीं बनेगा, जिससे क्रिप्ट्स के अस्तित्व और विकास को प्रभावित किया जाएगा।इस प्रोटोकॉल का उपयोग दवा की खोज, सेलुलर संचार, दवा चयापचय, व्यवहार्यता, प्रसार और रोगी-विशिष्ट व्यक्तिगत उपचार विकसित करने के लिए किया जा सकता है। ऑर्गेनॉइड संस्कृति की स्थापना ने बीमारियों और व्यक्तिगत चिकित्सा के अध्ययन में क्रांति ला दी है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

मानव hepatocellular कार्सिनोमा सेल लाइन HepG2 के साथ एक तीन आयामी लिवर मॉडल repopulated में वायरल वैक्टर का अध्ययन

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

फैलाना आंतरिक Pontine Glioma की रैपिड पोस्टमार्टम सेल संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

ऊपर की ओर बढ़ रहा है: एक सरल और लचीले इन विट्रो में तीन आयामी आक्रमण परख प्रोटोकॉल

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

लाइव सेल इमेजिंग परख ग्लियोब्लास्टोमा ब्रेन ट्यूमर स्टेम सेल प्रवासन और आक्रमण का अध्ययन करने के लिए

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

एक तीन आयामी Thymic संस्कृति प्रणाली Murine प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न ट्यूमर Antigen-विशिष्ट थाइमिक उत्प्रवासियों उत्पन्न करने के लिए

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal लुगदी ऊतक और सह कैंसर कोशिकाओं के साथ संस्कृति से कोशिका अलगाव स्टेम उनके बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

अस्थिसार्कोमा के लिए तीन आयामी अस्थि कोशिकाबद्ध मैट्रिक्स मॉडल

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

यूरीन हेमाटोपोएटिक स्टेम और संतति कोशिकाओं और एमएल-AF9 प्रेरित ल्यूकेमिया में Mitochondrial प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के प्रवाह Cytometric विश्लेषण

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं की त्रि-आयामी स्फेरॉइड संस्कृतियों में प्रोबायोटिक्स के सेल-फ्री सुपरनेंट का उपयोग करके सेल डेथ का मूल्यांकन करना

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

पेट के कैंसर स्टेम सेल का अध्ययन करने के लिए स्फेरॉइड का एक त्रि-आयामी मॉडल

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...