Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

この研究はNIH DK103166によって資金提供されました。

すべての動物実験と手順は、イーストカロライナ大学(ECU)の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され、実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所およびECUのガイドラインに準拠して実施されました。誘導性の腸特異的クローディン-7ノックアウトマウスを、C57BL6クローディン-7-フロックストランスジェニックマウスとVillin-CreERT2マウスと交配することによって作製し...

<ol>
	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

オルガノイド培養は、幹細胞機能、腸生理学、創薬、ヒト腸疾患、および組織再生と修復を研究するための優れたモデルです7,8,9,10,11,26。多くの利点がありますが、確立するのは難しい場合があります。プロトコル全体のすべてのステップで注?...

腸オルガノイド培養は、幹細胞が一次組織の腸陰窩から単離され、ゲルマトリックスに播種される3次元(3D)ex vivoシステムです1,2。これらの幹細胞は、自己複製、自己組織化、および臓器機能2が可能です。オルガノイドは組織の微小環境を模倣しており、細胞よりも操作性は劣りますが、2次元(2D)in vitro細胞培養モデルよりもin vivoモデルに似ています3,4。このモデルは、適切な細胞間接着の欠如、細胞-マトリックス相互作用、均質な集団など、2Dモデルで遭遇する障害を排除し、高コストや長期間を含む動物モデルの制限も軽減します5。腸管オルガノイド(結腸陰窩由来の幹細胞から増殖したものに対してコロノイドとも呼ばれる)は、本質的に、生体内に存在するすべての細胞型を含む上皮と内腔を含むミニ臓器です。このモデルにより、システムを操作して、幹細胞ニッチ、腸生理学、病態生理学、腸の形態形成など、腸の多くの側面を研究することができます3,5,6。また、創薬、炎症性腸疾患(IBD)や結腸直腸癌などのヒト腸疾患の研究、患者固有の個別化治療開発、組織再生の研究のための優れたモデルを提供します4,7,8,9。さらに、オルガノイド系は、細胞コミュニケーション、薬物代謝、生存率、増殖、および刺激に対する応答を研究するためにも使用できます7,8。動物モデルは、腸の病理学的状態の潜在的な治療法をテストするために使用できますが、一度に複数の薬物を研究することは課題となるため、非常に限られています。in vivoにはより多くの交絡変数があり、関連するコストと時間はそれぞれ高くて長いです。一方、オルガノイド培養システムは、より短い期間で一度に多くの治療薬のスクリーニングを可能にし、患者由来のオルガノイド培養の使用による個別化治療も可能にします4,8。結腸オルガノイドが組織組織、微小環境、および機能を模倣する能力は、再生と組織修復を研究するための優れたモデルにもなります9。当研究室では、小腸オルガノイド培養系を確立し、クローディン-7が小腸幹細胞機能に及ぼす影響を研究しています10。この研究では、大腸オルガノイド培養システムを確立して、条件付きクローディン-7ノックアウト(cKO)モデルで幹細胞の自己複製、分化、増殖能力または能力の欠如を研究します。
クローディン-7は、腸内で高発現する非常に重要なタイトジャンクション(TJ)タンパク質であり、TJの機能と完全性を維持するために不可欠です11。cKOマウスはIBD様表現型に苦しんでおり、重度の炎症、潰瘍、上皮細胞の脱落、腺腫、およびサイトカインレベルの上昇を示します11,12。クローディンが上皮バリア機能に不可欠であることは広く受け入れられていますが、クローディンの新しい役割が浮上しています。それらは、増殖、遊走、癌の進行、および幹細胞機能に関与しています10、12、13、14、15、16、17。クローディン-7が幹細胞のニッチと結腸幹細胞の機能にどのように影響するかは現在不明です。腸は約5〜7日ごとに急速に自己更新するため、幹細胞ニッチの維持と活性幹細胞の適切な機能が不可欠です18。ここでは、結腸幹細胞ニッチに対するクローディン-7の潜在的な調節効果を調べるためのシステムが確立されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

腸上皮は5〜7日ごとに再生し、陰窩領域の底に位置する腸上皮幹細胞(IESC)集団によって制御されています。IESCには、自己複製してさまざまな上皮細胞タイプに分化する活性幹細胞と、損傷の場合に予備幹細胞として機能する静止幹細胞が含まれます。腸上皮の再生は、これらの活性IESCの自己複製および分化能力によって制御される。さらに、陰窩幹細胞集団のバランスと幹細胞ニッチの維持は、腸の再生に不可欠です。オルガノイド培養は、幹細胞の生存と機能を調節するタンパク質、シグナル伝達分子、および環境の手がかりを研究するための重要で魅力的なアプローチです。このモデルは、動物モデルよりも安価で、時間もかからず、操作可能です。オルガノイドはまた、組織の微小環境を模倣し、 in vivo 関連性を提供します。本プロトコルは、結腸陰窩の単離、これらの単離された陰窩細胞を3次元ゲルマトリックスシステムに埋め込み、陰窩細胞を培養して自己組織化、増殖、自己複製、および分化が可能な結腸オルガノイドを形成することを記載しています。このモデルにより、クローディン-7などの特定のタンパク質をノックアウトしたり、シグナル伝達経路を活性化/不活性化したりする環境を操作して、これらの効果が結腸幹細胞の機能にどのように影響するかを調べることができます。具体的には、結腸幹細胞機能におけるタイトジャンクションタンパク質クローディン-7の役割を調べた。クローディン-7は、腸の恒常性とバリア機能と完全性を維持するために不可欠です。マウスにおけるクローディン-7のノックアウトは、腸の炎症、上皮過形成、体重減少、粘膜潰瘍、上皮細胞の脱落、および腺腫を示す炎症性腸疾患様表現型を誘発します。以前、クローディン-7は小腸の腸管上皮幹細胞機能に必要であることが報告されていました。このプロトコルでは、大腸におけるクローディン-7の役割を研究するために結腸オルガノイド培養システムが確立されています。

結腸幹細胞に対するクローディン-7の調節効果を調べるために、結腸陰窩を上記のようにマウス結腸組織から単離し、 図1Aに示した。陰窩が一次組織から単離されたら、96ウェルプレートの3Dマトリックスに播種して11日間増殖させました(図1)。正常な健康な陰窩は、2日目までに内腔を閉じてスフェロイドになり、最終的には約5日目に出芽し始め、...

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Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

本プロトコルは、クローディン-7ノックアウトモデルにおける結腸幹細胞の活性および機能を研究するためのマウス結腸オルガノイド系の確立を記載する。

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

このプロトコルは、動物モデルよりも低コストで操作可能な環境で結腸幹細胞の機能を研究する方法を提供します。オルガノイド培養により、免疫のない環境で幹細胞機能を研究することができます。これにより、クローディン-7のノックアウトなど、特定の原因の影響を特定することができます。幹細胞の機能機構を理解することで、炎症性腸疾患や大腸がんなどの衰弱性疾患の新たな治療標的が明らかになる可能性があります。安楽死させたマウスから結腸陰窩の分離を開始するには、マウスの正中線を約2インチ切開します。次に、皮膚をピンで留めて腹部を露出させます。結腸を分離するために、近位側からコエカムのすぐ下、遠位側から直腸の上を切断します。次に、鉗子を使用して結腸に付着した脂肪組織を取り除きます。鉗子の平らな端で単離された結腸から糞便を押し出した後、組織を縦方向に切り開きます。鉗子による洗浄の間に組織をPBSで回転させることにより、冷たいPBSで組織を10〜15回洗浄します。次に、清潔で鋭いはさみを使用して、組織を約3〜5ミリメートルの範囲の小片に切ります。別の安楽死マウスから結腸を分離した後、冷たい上皮解離培地を含む50ミリリットルの遠沈管ですべての組織片を結合し、結腸組織片を上皮解離培地で摂氏4度で90分間インキュベートします。インキュベーション後、組織片をチューブの底に沈めます。落ち着いたら、組織片を破壊することなく上皮解離培地を廃棄します。冷たいPBSで組織を10〜15回洗浄するときに、このプロセスを繰り返します。最終洗浄中にできるだけ多くのPBSを廃棄してください。次に、50ミリリットルのチューブで洗浄した結腸組織片に冷陰窩解離培地を加え、手で5〜10分間振とうします。細胞培養フードの下で、組織を含む培地を70ミクロンのナイロンセルストレーナーでろ過し、新鮮な50ミリリットルの遠沈管に入れます。ろ過後、チューブを200 Gで室温で10分間遠心分離し、ペレット化された陰窩を乱すことなく上清を廃棄します。ペレットを3〜4ミリリットルの冷たいPBSに再懸濁します。顕微鏡スライド上に一列に10マイクロリットルの陰窩懸濁液をピペットで入れる。顕微鏡を使用して、完全で長い陰窩の数を数えて陰窩濃度を推定し、96ウェルプレートにマイクロリットルあたり10個の陰窩をプレートするのに必要な陰窩の適切な量を計算します。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで適量の単離された陰窩を200 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。その後、ペレット化された陰窩を破壊することなく、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して上清を除去します。次に、気泡を導入せずにペレット化された陰窩に100マイクロリットルのゲルマトリックスを追加します。ゲルマトリックスが部分的に固まるまで1〜2分待ちます。次いで、10マイクロリットルのゲルマトリックスを予め加温した96穴培養プレートの各ウェル内の陰窩と混合したプレートがドーム形状を形成した。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%下のインキュベーターに入れて、ゲルマトリックスが完全に固まるまで10〜20分待ちます。最後に、抗生物質を添加したL-WRN培地の新たに調製した作業溶液100マイクロリットルを各ウェルに加え、プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素下で24時間インキュベートします。オルガノイドを回収するには、真空吸引を適用してウェルから古い培地を取り除き、オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドで室温で1時間固定します。次に、真空吸引によってウェルから4%パラホルムアルデヒドを除去し、オルガノイドをウェルあたり100マイクロリットルの30%スクロースで摂氏4度で処理します。24時間後、各ウェルに10マイクロリットルのPBSを加える前に、真空吸引によってウェルから30%スクロースを除去します。ピペットチップを使用してウェルの底を軽く引っ掻き、ドーム含有オルガノイドを解離します。次に、解離したオルガノイドを含むPBSをピペットでウェルから取り出し、最適な切断温度(OCT)コンパウンドを90%充填したラベル付きプラスチックモールドに移します。すべてのオルガノイドがすべてのウェルから除去されるまで、このプロセスを続けます。ドライアイスペレットを含むステンレス鋼のデュワーフラスコに2-メチルブタンを加え、ペレットを覆うのに十分です。OCTブロックを含むオルガノイドを2-メチルブタンの上に安定して保持することにより、瞬間凍結します。最後に、オルガノイド含有OCTブロックを摂氏マイナス80度で切断する準備ができるまで保管します。代表的な画像は、クローディン-7を含む通常の陰窩からのコロノイドの成長の成功を強調しています。クローディン7を含む陰窩は、2日目までに回転楕円体を形成し始め、5日目に発芽し始め、9日目に収穫されるまで成長と発芽を続けました。対照的に、クローディン-7を欠く陰窩は適切なコロノイドを形成することができませんでした。4-ヒドロキシタモキシフェンで2〜3日間処理した後、クローディン-7ノックアウト陰窩は細胞の円形の塊として現れた。対照とは異なり、陰窩は健康な回転楕円体に成長しませんでした。回収したコントロールおよび条件付きノックアウトオルガノイドにおけるクローディン-7の免疫蛍光染色により、培養におけるクローディン-7のノックアウトの成功が確認されました。対照のコロノイドは、9日目にアポトーシスシグナルをほとんど示さなかった。しかし、クローディン-7ノックアウトコロノイドは同時に高いアポトーシスを示しました。めっきする前に部分凝固を確認してください。部分凝固前のメッキは、ゲルマトリックスを拡散させ、ドームが形成されず、陰窩の生存と成長に影響を与えます。このプロトコルは、創薬、細胞コミュニケーション、薬物代謝、生存率、増殖の研究、および患者固有の個別化治療の開発に利用することができます。オルガノイド培養の確立は、病気の研究と個別化医療に革命をもたらしました。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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ヒト肝細胞癌細胞株HepG2細胞と三次元肝モデルに再増殖におけるウイルスベクターの研究

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A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

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びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（DIPG）

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

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Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

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Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

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A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

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