Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

이 연구는 NIH DK103166의 자금 지원을 받았습니다.

모든 동물 실험 및 절차는 이스트 캐롤라이나 대학교 (ECU) 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았으며 실험실 동물 관리 및 사용에 관한 국립 보건원 및 ECU의 지침에 따라 수행되었습니다. 유도성, 장 특이적 클로딘-7 녹아웃 마우스를 C57BL6 클로딘-7-플록스 형질전환 마우스와 Villin-CreERT2 마우스19를 교배시킴으로써 생성하였다. 3개월령의 수컷 및 암컷 마우스를 본 연구에 ?...

<ol>
	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

오가노이드 배양은 줄기 세포 기능, 장 생리학, 약물 발견, 인간 장 질환, 조직 재생 및 복구 7,8,9,10,11,26을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 많은 장점이 있지만 설정하기가 어려울 수 있습니다. 프로토콜 전체의 모든 단계에서 주의를 기울여야 하...

장 오가노이드 배양은 줄기 세포를 일차 조직의 장 음와에서 분리하고 겔 매트릭스 1,2로 도금하는 3차원(3D) 생체 외 시스템입니다. 이 줄기 세포는자가 재생,자가 조직 및 장기 기능이 가능합니다2. 오가노이드는 조직 미세 환경을 모방하고 세포 3,4보다 조작이 적지 만 2 차원 (2D) 시험관 내 세포 배양 모델보다 생체 내 모델과 더 유사합니다. 이 모델은 적절한 세포-세포 유착, 세포-매트릭스 상호 작용 및 균질 개체군의 부족과 같은 2D 모델에서 발생하는 장애물을 제거하고 높은 비용과긴 기간을 포함하여 동물 모델의 한계를 줄입니다5. 장내 오가노이드(결장 토굴 유래 줄기 세포에서 성장한 경우 콜로노이드라고도 함)는 본질적으로 생체 내에 존재하는 모든 세포 유형과 내강을 포함하는 상피를 포함하는 미니 기관입니다. 이 모델을 사용하면 시스템을 조작하여 줄기 세포 틈새, 장 생리학, 병태 생리학 및 장 형태 형성 3,5,6과 같은 장의 여러 측면을 연구 할 수 있습니다. 또한 약물 발견, 염증성 장 질환 (IBD) 및 대장 암과 같은 인간 장 질환 연구, 환자 별 개인화 된 치료 개발 및 조직 재생 4,7,8,9 연구를위한 훌륭한 모델을 제공합니다. 또한 오가노이드 시스템은 세포 통신, 약물 대사, 생존력, 증식 및 자극에 대한 반응을 연구하는 데에도 사용할수 있습니다7,8. 동물 모델은 장 병리학적 상태에 대한 잠재적인 치료제를 테스트하는 데 사용될 수 있지만 한 번에 여러 약물을 연구하는 것이 어려울 수 있으므로 매우 제한적입니다. 생체 내에는 더 많은 교란 변수가 있으며 관련 비용과 시간은 각각 높고 길다. 반면에, 오가노이드 배양 시스템은 더 짧은 기간에 한 번에 많은 치료제의 스크리닝을 허용하고, 또한 환자 유래 오가노이드 배양 4,8의 사용을 통해 개인화된 치료를 가능하게 한다. 결장 오가노이드가 조직 조직, 미세 환경 및 기능을 모방하는 능력은 또한 재생 및조직 복구를 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다9. 우리 연구실은 소장 줄기 세포 기능에 대한 claudin-7의 효과를 연구하기 위해 소장 오가노이드 배양 시스템을 구축했습니다10. 이 연구에서는 조건부 claudin-7 녹아웃(cKO) 모델에서 줄기세포의 자가 갱신, 분화 및 증식 능력 또는 능력 부족을 연구하기 위해 대장 오가노이드 배양 시스템을 구축했습니다.
Claudin-7은 장에서 고도로 발현되고 TJ 기능 및 무결성11을 유지하는 데 필수적인 매우 중요한 단단한 접합 (TJ) 단백질입니다. cKO 마우스는 IBD 유사 표현형을 앓고 있으며 심각한 염증, 궤양, 상피 세포 슬라우링, 선종 및 증가된 사이토카인 수치11,12를 나타냅니다. 클로딘이 상피 장벽 기능에 필수적이라는 것은 널리 받아 들여지고 있지만, 클로딘의 새로운 역할이 등장하고 있습니다. 그들은 증식, 이동, 암 진행 및 줄기 세포 기능 10,12,13,14,15,16,17에 관여합니다. claudin-7이 줄기 세포 틈새와 결장 줄기 세포의 기능에 어떤 영향을 미치는지는 현재 알려져 있지 않습니다. 장이 약 5-7 일마다 빠르게 자체 재생되기 때문에 줄기 세포 틈새의 유지와 활성 줄기 세포의 적절한 기능이 중요합니다18. 여기에서는 결장 줄기 세포 틈새에 대한 claudin-7의 잠재적 인 조절 효과를 조사하기위한 시스템이 구축됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

장 상피는 5-7 일마다 재생되며 음낭 부위의 바닥에 위치한 장 상피 줄기 세포 (IESC) 집단에 의해 제어됩니다. IESC에는 자체 재생되어 다양한 상피 세포 유형으로 분화하는 활성 줄기 세포와 손상시 예비 줄기 세포 역할을하는 정지 줄기 세포가 포함됩니다. 장 상피의 재생은 이러한 활성 IESC의 자체 재생 및 분화 능력에 의해 제어됩니다. 또한, 지하실 줄기 세포 집단의 균형과 줄기 세포 틈새의 유지는 장 재생에 필수적입니다. 오가노이드 배양은 줄기 세포의 생존과 기능을 조절하는 단백질, 신호 분자 및 환경 신호를 연구하는 데 중요하고 매력적인 접근 방식입니다. 이 모델은 동물 모델보다 저렴하고 시간이 덜 걸리며 조작이 가능합니다. 오가노이드는 또한 조직 미세 환경을 모방하여 생체 내 관련성을 제공합니다. 본 프로토콜은 결장 종루의 분리, 이러한 분리된 종와를 3차원 겔 매트릭스 시스템에 매립하고 자가조직화, 증식, 자가 재생 및 분화가 가능한 결장 오가노이드를 형성하기 위해 종와세포를 배양하는 방법을 설명합니다. 이 모델을 통해 claudin-7과 같은 특정 단백질을 녹아웃하고 신호 경로를 활성화 / 비활성화하는 등 환경을 조작하여 이러한 효과가 결장 줄기 세포의 기능에 어떻게 영향을 미치는지 연구 할 수 있습니다. 구체적으로, 결장 줄기세포 기능에서 밀착접합 단백질 claudin-7의 역할을 조사하였다. Claudin-7은 장 항상성과 장벽 기능 및 무결성을 유지하는 데 필수적입니다. 마우스에서 claudin-7의 녹아웃은 장 염증, 상피 증식, 체중 감소, 점막 궤양, 상피 세포 슬라우킹 및 선종을 나타내는 염증성 장 질환 유사 표현형을 유도합니다. 이전에는 claudin-7이 소장에서 장 상피 줄기 세포 기능에 필요한 것으로보고되었습니다. 이 프로토콜에서는 대장에서 claudin-7의 역할을 연구하기 위해 결장 오가노이드 배양 시스템이 구축됩니다.

결장 줄기 세포에 대한 claudin-7의 조절 효과를 조사하기 위해, 결장 음와를 상기 기재된 바와 같이 뮤린 결장 조직으로부터 분리하고 도 1A에 나타내었다. 지하실이 1차 조직에서 분리되면 96웰 플레이트의 3D 매트릭스에 도말하여 11일 동안 성장시켰습니다(그림 1). 정상적인 건강한 음와(Crypt)는 2일째에 내강을 닫고 스페로이드가 되며 결국 약 5일째에 다...

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Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

이 프로토콜은 동물 모델보다 시간이 적게 소요되는 조작 가능한 환경에서 결장 줄기 세포의 기능을 연구하는 방법을 제공합니다. 오가노이드 배양을 통해 면역이 없는 환경에서 줄기세포 기능을 연구할 수 있습니다. 이를 통해 claudin-7의 녹아웃과 같은 특정 원인의 영향을 정확히 찾아낼 수 있습니다.줄기 세포 기능의 메커니즘을 이해하면 염증성 장 질환 및 대장 암과 같은 쇠약 질환에 대한 새로운 치료 표적을 밝힐 수 있습니다. 안락사 된 마우스에서 결장 음와를 분리하기 시작하려면 마우스의 정중선 아래로 약 2 인치의 절개를하십시오. 그런 다음 피부를 다시 고정하여 복부를 노출시킵니다.결장을 분리하기 위해 근위부에서 코쿰 바로 아래, 원위부에서 직장 위의 결장을 자릅니다. 다음으로 집게를 사용하여 결장에 부착 된 지방 조직을 제거하십시오. 집게의 평평한 끝으로 격리 된 결장에서 대변을 밀어 낸 후 조직을 세로로 자릅니다.집게로 씻는 사이에 PBS에서 조직을 소용돌이 치면서 차가운 PBS로 조직을 10-15 회 씻으십시오. 그런 다음 깨끗하고 날카로운 가위를 사용하여 조직을 약 3-5 밀리미터의 작은 조각으로 자릅니다. 안락사된 다른 마우스로부터 결장을 분리한 후, 차가운 상피 해리 배지가 들어 있는 50밀리리터 원심분리 튜브에 모든 조직 조각을 결합하고 결장 조직 조각을 상피 해리 배지에서 섭씨 4도에서 90분 동안 부드러운 흔들림으로 배양합니다.배양 후 조직 조각이 튜브 바닥으로 가라 앉도록하십시오. 일단 침전되면 조직 조각을 방해하지 않고 상피 해리 배지를 폐기하십시오. 차가운 PBS로 조직을 10-15 회 세척 할 때이 과정을 반복하십시오.최종 세척 중에 가능한 한 많은 PBS를 폐기하십시오. 다음으로, 50 밀리리터 튜브에서 씻은 결장 조직 조각에 차가운 지하실 해리 배지를 넣고 손으로 5-10 분 동안 흔 듭니다. 세포 배양 후드 아래에서 70미크론 나일론 세포 여과기로 조직이 포함된 배지를 신선한 50밀리리터 원심분리 튜브에 여과합니다.여과 후, 실온에서 10분 동안 200G에서 튜브를 원심분리한 다음, 펠렛화된 음와를 방해하지 않고 상청액을 버립니다. 펠릿을 3-4 밀리리터의 차가운 PBS에 다시 현탁시킵니다. 현미경 슬라이드의 한 줄에 10 마이크로 리터의 지하실 현탁액을 피펫팅합니다.현미경을 사용하여 완전하고 긴 음굴의 수를 계산하여 음핵 농도를 추정하고 96웰 플레이트에 마이크로리터당 10개의 음굴을 도금하는 데 필요한 적절한 음굴 부피를 계산합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 200G의 1.5밀리리터 미세 원심분리 튜브에 적절한 양의 분리된 음와를 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿화된 음와를 방해하지 않고 1, 000마이크로리터 피펫을 사용하여 상청액을 제거합니다.그런 다음 기포를 도입하지 않고 펠릿화된 지하실에 100마이크로리터의 겔 매트릭스를 추가합니다. 겔 매트릭스가 부분적으로 응고 될 때까지 1-2 분 동안 기다리십시오. 이어서, 예열된 96-웰 배양 플레이트의 각 웰 내의 토굴과 혼합된 겔 매트릭스의 10 마이크로리터를 플레이트하여 돔 형상을 형성하였다.5% 이산화탄소 하에서 섭씨 37도의 인큐베이터에 플레이트를 넣어 겔 매트릭스가 완전히 굳을 때까지 10-20분 동안 기다립니다. 마지막으로, 항생제가 보충 된 L-WRN 배지의 새로 준비된 작업 용액 100 마이크로 리터를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 하에서 24 시간 동안 배양합니다. 오가노이드를 수확하려면 진공 흡입을 적용하여 웰에서 오래된 배지를 제거하고 실온에서 1시간 동안 4%파라포름알데히드로 오가노이드를 고정합니다.그런 다음 진공 흡입으로 웰에서 4% 파라포름알데히드를 제거하고 섭씨 4도에서 웰당 100마이크로리터의 30% 자당으로 오가노이드를 처리합니다. 24시간 후, 각 웰에 10마이크로리터의 PBS를 추가하기 전에 진공 흡입으로 웰에서 30% 자당을 제거합니다. 피펫 팁을 사용하여 우물 바닥을 부드럽게 긁어 돔 함유 유기체를 해리하십시오.다음으로, 피펫으로 웰에서 해리된 오가노이드가 포함된 PBS를 제거하고 최적의 절단 온도 또는 OCT 화합물로 90%로 채워진 라벨이 붙은 플라스틱 몰드로 옮깁니다. 모든 웰에서 모든 유기체가 제거 될 때까지 과정을 계속하십시오. 펠릿을 덮기에 충분한 드라이 아이스 펠릿이 들어있는 스테인레스 스틸 Dewar 플라스크에 2- 메틸 부탄을 첨가하십시오.OCT 블록을 함유하는 오가노이드를 2-메틸부탄 위에 꾸준히 유지하여 급속 동결시킨다. 마지막으로, 절단할 준비가 될 때까지 오가노이드 함유 OCT 블록을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 대표 이미지는 claudin-7을 함유 한 정상 음와에서 콜로노이드의 성공적인 성장을 강조합니다.claudin-7을 포함하는 지하실은 둘째 날부터 스페로이드를 형성하기 시작했고, 5일째에 싹이 트기 시작했으며, 9일째에 수확될 때까지 계속 성장하고 싹이 트었습니다. 대조적으로, claudin-7이 부족한 음와에서는 적절한 콜로노이드를 형성하지 못했습니다. 2-3 일 동안 4- 하이드 록시 타목시펜으로 치료 한 후, claudin-7 녹아웃 토굴은 원형 세포 덩어리로 나타났습니다.대조군과 달리 지하실은 건강한 스페로이드로 자라지 않았습니다. 수확된 대조군에서 클로딘-7에 대한 면역형광 염색 및 조건부 녹아웃 오가노이드는 배양에서 클라우딘-7의 성공적인 녹아웃을 확인하였다. 대조군 콜로노이드는 9일째에 매우 적은 세포사멸 신호를 나타내었다.그러나 claudin-7 녹아웃 콜로노이드는 동시에 높은 세포 사멸을 나타 냈습니다. 도금하기 전에 부분 응고를 확인하십시오. 부분 응고 전에 도금하면 겔 매트릭스가 퍼지고 돔이 형성되지 않아 지하실의 생존과 성장에 영향을 미칩니다.이 프로토콜은 약물 발견, 세포 통신, 약물 대사, 생존력, 증식 및 환자 맞춤형 개인화 치료 개발에 활용될 수 있습니다. 오가노이드 배양의 확립은 질병 및 개인화 된 의학 연구에 혁명을 일으켰습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

인간의 간세포 암 세포주 인 HepG2와 3 차원 간 모델 다시 채워에서 바이러스 성 벡터의 연구

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

연구

암 연구학

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

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확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...