Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Denne studien ble finansiert av NIH DK103166.

Alle dyreforsøk og prosedyrer ble godkjent av East Carolina University (ECU) Animal Care and Use Committee (IACUC) og utført i samsvar med retningslinjer fra National Institutes of Health og ECU om pleie og bruk av forsøksdyr. Induserbare, tarmspesifikke claudin-7 knockoutmus ble generert ved å krysse C57BL6 claudin-7-flox transgene mus med Villin-CreERT2 mus19. Hann- og hunnmus i alderen 3 måneder ble brukt i denne studien.
1. Klargjøring av reagens/utstyr<...

<ol>
	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

Organoidkultur er en utmerket modell for å studere stamcellefunksjon, tarmfysiologi, narkotikaforskning, menneskelige tarmsykdommer og vevregenerering og reparasjon 7,8,9,10,11,26. Selv om det har mange fordeler, kan det være utfordrende å etablere. Det må utvises forsiktighet i alle trinn gjennom protokollen, men viktigs...

Intestinal organoidkultur er et tredimensjonalt (3D) ex vivo-system der stamceller isoleres fra tarmkryptene i primærvev og belagt i en gelmatrise 1,2. Disse stamcellene er i stand til selvfornyelse, selvorganisering og organfunksjonalitet2. Organoider etterligner vevsmikromiljøet og ligner mer på in vivo-modeller enn todimensjonale (2D) in vitro cellekulturmodeller, selv om de er mindre manipulerbare enn celler 3,4. Denne modellen eliminerer hindringer som oppstår i 2D-modeller, for eksempel mangel på riktig celle-celle-adhesjoner, celle-matrise-interaksjoner og homogene populasjoner, og reduserer også begrensningene i dyremodeller, inkludert høye kostnader og lange tidsperioder5. Intestinale organoider - også referert til som kolonoider for de som vokser fra kolonkryptavledede stamceller - er i hovedsak miniorganer som inneholder et epitel, inkludert alle celletyper som ville være tilstede in vivo, samt et lumen. Denne modellen tillater manipulering av systemet for å studere mange aspekter av tarmen, for eksempel stamcellenisje, tarmfysiologi, patofysiologi og tarmmorfogenese 3,5,6. Det gir også en flott modell for narkotikaforskning, studerer menneskelige tarmlidelser som inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og kolorektal kreft, pasientspesifikk personlig behandlingsutvikling og studerer vevregenerering 4,7,8,9. I tillegg kan organoidsystemet også brukes til å studere cellulær kommunikasjon, stoffmetabolisme, levedyktighet, spredning og respons på stimuli 7,8. Mens dyremodeller kan brukes til å teste potensielle terapier for intestinale patologiske forhold, er de ganske begrensede, da det er en utfordring å studere flere stoffer samtidig. Det er flere forvirrende variabler in vivo, og tilhørende kostnader og tid er henholdsvis høye og lange. På den annen side tillater organoidkultursystemet screening av mange terapier samtidig i en kortere tidsperiode og tillater også personlig behandling ved bruk av pasientavledet organoidkultur 4,8. Evnen til kolonorganoider til å etterligne vevsorganisasjon, mikromiljø og funksjonalitet gjør dem også til en utmerket modell for å studere regenerering og vevsreparasjon9. Vårt laboratorium har etablert et tynntarmorganoidkultursystem for å studere effekten av claudin-7 på tynntarmens stamcellefunksjoner10. I denne studien er et stort intestinal organoidkultursystem etablert for å studere stamcellers evne, eller mangel på evne, til selvfornyelse, differensiering og spredning i en betinget claudin-7 knockout (cKO) modell.
Claudin-7 er et svært viktig tett kryss (TJ) protein som er sterkt uttrykt i tarmen og er avgjørende for å opprettholde TJ-funksjon og integritet11. cKO-mus lider av en IBD-lignende fenotype, som viser alvorlig betennelse, sårdannelser, epitelcelle-sloughing, adenomer og økte cytokinnivåer11,12. Selv om det er allment akseptert at claudiner er avgjørende for epitelbarrierefunksjon, dukker det opp nye roller for claudiner; De er involvert i spredning, migrasjon, kreftprogresjon og stamcellefunksjon 10,12,13,14,15,16,17. Det er foreløpig ukjent hvordan claudin-7 påvirker stamcellenisjen og funksjonen til kolonstamceller. Siden tarmen raskt fornyes omtrent hver 5-7 dag, er vedlikehold av stamcellenisjen og riktig funksjon av de aktive stamcellene avgjørende18. Her etableres et system for å undersøke de potensielle regulatoriske effektene av claudin-7 på colonic stamcelle nisje.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

Tarmepitelet regenereres hver 5-7 dag, og styres av populasjonen av tarmepitelstamceller (IESC) som ligger nederst i kryptområdet. IESCs inkluderer aktive stamceller, som selvfornyer og differensierer i ulike epitelcelletyper, og hvilende stamceller, som fungerer som reserve stamceller i tilfelle skade. Regenerering av tarmepitelet styres av de selvfornyende og differensierende egenskapene til disse aktive IESC-ene. I tillegg er balansen mellom kryptstamcellepopulasjonen og vedlikehold av stamcellenisjen avgjørende for intestinal regenerering. Organoidkultur er en viktig og attraktiv tilnærming til å studere proteiner, signalmolekyler og miljømessige signaler som regulerer stamcelleoverlevelse og funksjoner. Denne modellen er billigere, mindre tidkrevende og mer manipulerbar enn dyremodeller. Organoider etterligner også vevets mikromiljø, og gir in vivo relevans. Den nåværende protokollen beskriver isoleringen av kolonkrypter, innebygging av disse isolerte kryptcellene i et tredimensjonalt gelmatrisesystem og dyrking av kryptceller for å danne kolonorganoider som er i stand til selvorganisasjon, spredning, selvfornyelse og differensiering. Denne modellen gjør det mulig å manipulere miljøet - slå ut spesifikke proteiner som claudin-7, aktivere / deaktivere signalveier, etc. - for å studere hvordan disse effektene påvirker funksjonen av kolonstamceller. Spesielt ble rollen som tett kryssprotein claudin-7 i kolon stamcellefunksjon undersøkt. Claudin-7 er viktig for å opprettholde intestinal homeostase og barrierefunksjon og integritet. Knockout av claudin-7 hos mus induserer en inflammatorisk tarmsykdomslignende fenotype som utviser tarmbetennelse, epitelhyperplasi, vekttap, slimhinnesår, epitelcellesloughing og adenomer. Tidligere ble det rapportert at claudin-7 er nødvendig for tarmepitelial stamcellefunksjoner i tynntarmen. I denne protokollen er et kolonorganoidkultursystem etablert for å studere rollen som claudin-7 i tyktarmen.

For å undersøke reguleringseffektene av claudin-7 på kolonstamceller ble kolonkrypter isolert fra murine kolonvev som beskrevet ovenfor og vist i figur 1A. Når kryptene var isolert fra primærvevet, ble de belagt i en 3D-matrise i en 96-brønnsplate for å vokse i 11 dager (figur 1). Normale friske krypter vil lukke lumen og bli sfæroider innen dag 2 og til slutt begynne å spire og danne de forskjellige epitelcelletypene omtrent på dag 5 (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Denne protokollen beskriver etablering av et murine colonic organoid system for å studere aktiviteten og funksjonen til kolonstamceller i en claudin-7 knockout-modell.

Tredimensjonal kultur av Murine Colonic krypter for å studere intestinal stamcellefunksjon ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Denne protokollen gir en metode for å studere funksjonen til kolonstamceller i et manipulerbart miljø med lavere kostnader i tid enn dyremodeller. Organoidkultur tillater studier av stamcellefunksjon i et immunfritt miljø. Dette gjør det mulig å finne effekten av en bestemt årsak, for eksempel knockout av claudin-7.Forståelse av mekanismene for stamcellefunksjon kan kaste lys over nye terapeutiske mål for svekkende sykdommer som inflammatorisk tarmsykdom og kolorektal kreft. For å begynne isoleringen av kolonkrypter fra den avlivede musen, gjør du et snitt på omtrent to tommer nedover midtlinjen på musen. Fest deretter huden tilbake for å eksponere magen.Klipp tykktarmen like under coecum fra proksimal side og over endetarmen fra distale side for å isolere tykktarmen. Fjern deretter fettvevet festet til tykktarmen ved hjelp av tang. Etter å ha presset ut avføring fra den isolerte tykktarmen med den flate enden av tangen, kutt vevet åpent i lengderetningen.Vask vevet 10 til 15 ganger med kald PBS ved å virvle vevet rundt i PBS mellom vasker med tang. Bruk deretter et par rene, skarpe saks, kutt vevet i små biter fra omtrent tre til fem millimeter. Etter å ha isolert tykktarmen fra en annen avlivet mus, kombiner alle vevsbitene i et 50 milliliter sentrifugerør som inneholder kaldepiteldissosiasjonsmedier og inkuberer kolonvevstykkene i epiteldissosiasjonsmedier i 90 minutter ved fire grader Celsius med mild rocking.Etter inkubasjon, la vevfragmentene synke til bunnen av røret. Når det er avgjort, kast epiteldissosiasjonsmediet uten å forstyrre vevfragmentene. Gjenta prosessen når du vasker vevet 10 til 15 ganger med kald PBS.Kast så mye PBS som mulig under den endelige vasken. Deretter legger du kalde kryptdissosiasjonsmedier til de vasket kolonvevbitene i et 50 milliliter rør og rister i fem til 10 minutter for hånd. Under cellekulturhetten, filtrer mediet som inneholder vevet med en 70 mikron nyloncellesil i et friskt 50 milliliter sentrifugerør.Etter filtrering, sentrifuger røret ved 200 G i 10 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av å kaste supernatanten uten å forstyrre pelleterte krypter. Resuspender pelleten i tre til fire ml kald PBS. Pipette 10 mikroliter av kryptfjæringen i en linje på et mikroskop lysbilde.Ved hjelp av mikroskopet, telle antall fulle, lange krypter for å estimere kryptkonsentrasjon og beregne riktig volum krypter som kreves for å plate 10 krypter per mikroliter i en 96-brønns plate. Sentrifuge et passende volum av isolerte krypter i et 1, 5 milliliter mikrosentrifugerør ved 200 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern deretter supernatanten ved hjelp av en pipette på 1.000 mikroliter uten å forstyrre pelleteringskryptene.Tilsett deretter 100 mikroliter gelmatrise til pelleterte krypter uten å introdusere luftbobler. Vent i ett til to minutter til gelmatrisen er delvis størknet. Deretter blandes plate 10 mikroliter av gelmatrisen med kryptene i hver brønn i en forvarmet 96-brønns kulturplate for å danne en kuppelform.La det gå 10 til 20 minutter før gelmatrisen er fullstendig satt ved å plassere platen i en inkubator ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid. Til slutt legger du til 100 mikroliter av den tilberedte arbeidsløsningen av L-WRN-medier supplert med antibiotika til hver brønn og inkuberer platen ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid i 24 timer. For å høste organoider, fjern gamle medier fra brønnene ved å påføre vakuumsug og fikse organoider med 4% paraformaldehyd i en time ved romtemperatur.Fjern deretter 4% paraformaldehyd fra brønnene ved vakuumsug og behandle organoider med 100 mikroliter 30% sukrose per brønn ved fire grader Celsius. Etter 24 timer, fjern 30% sukrose fra brønnene ved vakuumsug før du tilsetter 10 mikroliter PBS til hver brønn. Bruk en pipettespiss til å skrape bunnen av brønnen forsiktig for å dissosiere de kuppelholdige organoider.Fjern deretter PBS som inneholder de dissosierte organoider fra brønnen med en pipette og overfør den til en merket plastform fylt 90% med optimal skjæretemperatur, eller OCT, forbindelse. Fortsett prosessen til alle organoider er fjernet fra alle brønner. Tilsett 2-metylbutan til en Dewar-kolbe i rustfritt stål som inneholder tørrispellets, nok til å dekke pellets.Flash-fryse organoiden som inneholder OCT-blokk ved å holde den jevnt over 2-metylbutan. Til slutt lagrer du den organoidholdige OCT-blokken ved minus 80 grader Celsius til den er klar til å seksjonere. Det representative bildet fremhever den vellykkede veksten av kolonoider fra normale krypter som inneholder claudin-7.Kryptene som inneholder claudin-7 begynte å danne sfæroider ved dag to, begynte å spire på dag fem, og fortsatte å vokse og spire til de ble høstet på dag ni. I motsetning til dette klarte krypter som manglet claudin-7 ikke å danne skikkelige kolonoider. Etter behandling med 4-hydroksytamoxifen i to til tre dager, dukket claudin-7 knockoutkryptene opp som sirkulære klumper av celler.I motsetning til kontrollen vokste kryptene ikke til sunne sfæroider. Immunfluorescensfarging for claudin-7 i høstet kontroll og de betingede knockoutorganoider bekreftet den vellykkede knockout av claudin-7 i kultur. Kontrollkolonoidene viste svært lite apoptotisk signal på dag ni.Imidlertid viste claudin-7 knockout kolonoider høy apoptose samtidig. Sørg for delvis størkning før plating. Plating før delvis størkning vil føre til at gelmatrisen sprer seg og kuppelen ikke blir dannet, noe som påvirker kryptenes overlevelse og vekst.Denne protokollen kan brukes til narkotikaforskning, studere cellulær kommunikasjon, stoffskifte, levedyktighet, spredning og utvikling av pasientspesifikk personlig behandling. Etableringen av organoidkultur har revolusjonert studiet av sykdommer og personlig medisin.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studier av virale vektorer i et tredimensjonalt Liver Modell repopulated med Human leverkreft cellelinje HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokoll for Rapid Post mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytte oppover: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensjonale invasjonen analysen protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

En tredimensjonal Tymusatrofi kultur system for å generere murine indusert pluripotent Stem Cell-avledet tumor antigen-spesifikke Tymusatrofi nybyggere

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal stamceller isolert fra cellulose vev og co kultur kreftceller å studere deres samhandling

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tredimensjonale bein ekstracellulær Matrix modell for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow analytiske analyse av mitokondrie reaktive oksygen arter i murine blodkreft stem og stamceller og MLL-AF9 drevet leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering av celledød ved hjelp av cellefri supernatant av probiotika i tredimensjonale sfæroidkulturer av kolorektale kreftceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

En tredimensjonal modell av sfæroider for å studere kolonkreft stamceller

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...