Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Este estudo foi financiado pelo NIH DK103166.

Todos os experimentos e procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da East Carolina University (ECU) e conduzidos em conformidade com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e ECU sobre cuidados e uso de animais de laboratório. Camundongos knockout induzíveis e específicos do intestino foram gerados pelo cruzamento de camundongos transgênicos C57BL6 claudin-7-flox com camundongos Villin-CreERT219. Camundongos machos e fêmeas com idade de...

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	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. 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A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

A cultura organoide é um excelente modelo para o estudo da função das células-tronco, fisiologia intestinal, descoberta de medicamentos, doenças intestinais humanas e regeneração e reparo tecidual 7,8,9,10,11,26. Embora tenha muitas vantagens, pode ser um desafio estabelecer. Deve-se ter cuidado em todas as etapas ao l...

A cultura organoide intestinal é um sistema tridimensional (3D) ex vivo no qual as células-tronco são isoladas das criptas intestinais do tecido primário e plaqueadas em uma matriz de gel 1,2. Essas células-tronco são capazes de auto-renovação, auto-organização e funcionalidade de órgãos2. Os organoides imitam o microambiente tecidual e são mais semelhantes aos modelos in vivo do que os modelos de cultura celular in vitro bidimensionais (2D), embora menos manipuláveis que as células 3,4. Esse modelo elimina obstáculos encontrados em modelos 2D, como a falta de aderências célula-célula adequadas, interações célula-matriz e populações homogêneas, e também reduz as limitações dos modelos animais, incluindo altos custos e longos períodos de tempo5. Os organoides intestinais - também conhecidos como colonóides para aqueles cultivados a partir de células-tronco derivadas de criptas colônicas - são essencialmente mini-órgãos que contêm um epitélio, incluindo todos os tipos de células que estariam presentes in vivo, bem como um lúmen. Esse modelo permite a manipulação do sistema para estudar diversos aspectos do intestino, como o nicho de células-tronco, a fisiologia intestinal, a fisiopatologia e a morfogênese intestinal 3,5,6. Também fornece um ótimo modelo para a descoberta de medicamentos, estudando distúrbios intestinais humanos, como doença inflamatória intestinal (DII) e câncer colorretal, desenvolvimento de tratamento personalizado específico do paciente e estudo da regeneração tecidual 4,7,8,9. Além disso, o sistema organoide também pode ser utilizado para estudar a comunicação celular, o metabolismo de fármacos, a viabilidade, a proliferação e a resposta a estímulos 7,8. Embora os modelos animais possam ser usados para testar potenciais terapêuticas para condições patológicas intestinais, eles são bastante limitados, pois o estudo de várias drogas ao mesmo tempo representa um desafio. Há mais variáveis de confusão in vivo, e o custo e o tempo associados são altos e longos, respectivamente. Por outro lado, o sistema de cultura de organoides permite a triagem de muitas terapêuticas de uma só vez em um período de tempo mais curto e também permite o tratamento personalizado por meio do uso de cultura organoide derivada do paciente 4,8. A capacidade dos organoides colônicos de imitar a organização, o microambiente e a funcionalidade dos tecidos também os torna um excelente modelo para o estudo da regeneração e do reparo tecidual9. Nosso laboratório estabeleceu um sistema de cultura organoide do intestino delgado para estudar o efeito da claudina-7 nas funções das células-tronco do intestino delgado10. Neste estudo, um sistema de cultura de organoides do intestino grosso é estabelecido para estudar a capacidade, ou a falta de habilidade, das células-tronco de se auto-renovarem, diferenciarem e proliferarem em um modelo condicional de nocaute de claudina-7 (cKO).
A Claudin-7 é uma proteína de junção apertada (TJ) muito importante, altamente expressa no intestino e essencial para a manutenção da função e integridade do TJ11. Camundongos cKO sofrem de fenótipo semelhante ao da DII, exibindo inflamação grave, ulcerações, descamação de células epiteliais, adenomas e aumento dos níveis de citocinas11,12. Embora seja amplamente aceito que os claudins são vitais para a função de barreira epitelial, novos papéis para os claudins estão surgindo; estão envolvidos na proliferação, migração, progressão do câncer e função das células-tronco 10,12,13,14,15,16,17. Atualmente, não se sabe como a claudina-7 afeta o nicho de células-tronco e a função das células-tronco colônicas. Como o intestino se auto-renova rapidamente aproximadamente a cada 5-7 dias, a manutenção do nicho de células-tronco e o bom funcionamento das células-tronco ativas são vitais18. Aqui, um sistema é estabelecido para examinar os potenciais efeitos regulatórios da claudina-7 no nicho de células-tronco colônicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

O epitélio intestinal se regenera a cada 5-7 dias e é controlado pela população de células-tronco epiteliais intestinais (IESC) localizada na parte inferior da região da cripta. Os IESCs incluem células-tronco ativas, que se auto-renovam e se diferenciam em vários tipos de células epiteliais, e células-tronco quiescentes, que servem como células-tronco de reserva em caso de lesão. A regeneração do epitélio intestinal é controlada pelas capacidades de auto-renovação e diferenciação dessas IESCs ativas. Além disso, o equilíbrio da população de células-tronco criptas e a manutenção do nicho de células-tronco são essenciais para a regeneração intestinal. A cultura organoide é uma abordagem importante e atraente para estudar proteínas, moléculas de sinalização e pistas ambientais que regulam a sobrevivência e as funções das células-tronco. Este modelo é menos caro, menos demorado e mais manipulável do que os modelos animais. Os organoides também imitam o microambiente tecidual, proporcionando relevância in vivo. O presente protocolo descreve o isolamento de criptas colônicas, incorporando essas células de cripta isoladas em um sistema de matriz de gel tridimensional e cultivando células de cripta para formar organoides colônicos capazes de auto-organização, proliferação, auto-renovação e diferenciação. Este modelo permite manipular o ambiente - nocauteando proteínas específicas, como a claudina-7, ativando/desativando vias de sinalização, etc. - para estudar como esses efeitos influenciam o funcionamento das células-tronco colônicas. Especificamente, o papel da proteína claudina-7 de junção apertada na função das células-tronco colônicas foi examinado. Claudin-7 é vital para manter a homeostase intestinal e função de barreira e integridade. O knockout da claudina-7 em camundongos induz um fenótipo semelhante à doença inflamatória intestinal, exibindo inflamação intestinal, hiperplasia epitelial, perda de peso, ulcerações mucosas, descamação de células epiteliais e adenomas. Anteriormente, foi relatado que a claudina-7 é necessária para as funções das células-tronco epiteliais intestinais no intestino delgado. Neste protocolo, um sistema de cultura organoide colônica é estabelecido para estudar o papel da claudina-7 no intestino grosso.

A fim de examinar os efeitos regulatórios da claudina-7 sobre as células-tronco do cólon, criptas colônicas foram isoladas do tecido do cólon murino, conforme descrito acima e mostrado na Figura 1A. Uma vez que as criptas foram isoladas do tecido primário, elas foram revestidas em uma matriz 3D em uma placa de 96 poços para crescer por 11 dias (Figura 1). Criptas saudáveis normais fecharão o lúmen e se tornarão esferoides no dia 2 e, eventualmente, co...

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Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Este protocolo fornece um método para estudar a função das células-tronco do cólon em um ambiente manipulável com menor custo no tempo do que os modelos animais. A cultura organoide permite o estudo da função das células-tronco em um ambiente livre de sistema imunológico. Isso permite identificar os efeitos de uma causa específica, como o nocaute da claudina-7.Compreender os mecanismos da função das células-tronco pode lançar luz sobre novos alvos terapêuticos para doenças debilitantes, como a doença inflamatória intestinal e o câncer colorretal. Para começar o isolamento de criptas colônicas do rato eutanasiado, faça uma incisão de aproximadamente dois centímetros abaixo da linha média do mouse. Em seguida, prenda a pele para trás para expor o abdômen.Corte o cólon logo abaixo do ceco do lado proximal e acima do reto do lado distal para isolar o cólon. Em seguida, remova o tecido adiposo ligado ao cólon usando fórceps. Depois de empurrar as fezes do cólon isolado com a extremidade plana da pinça, corte o tecido aberto longitudinalmente.Lave o tecido 10 a 15 vezes com PBS frio, girando o tecido em torno de PBS entre lavagens com fórceps. Em seguida, usando um par de tesouras limpas e afiadas, corte o tecido em pequenos pedaços que variam de aproximadamente três a cinco milímetros. Depois de isolar o cólon de outro rato eutanasiado, combine todos os pedaços de tecido em um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo meios de dissociação epitelial fria e incube os pedaços de tecido do cólon em meios de dissociação epitelial por 90 minutos a quatro graus Celsius com balanço suave.Após a incubação, permita que os fragmentos de tecido afundem no fundo do tubo. Uma vez assentado, descarte o meio de dissociação epitelial sem interromper os fragmentos de tecido. Repita o processo ao lavar o tecido 10 a 15 vezes com PBS frio.Descarte o máximo de PBS possível durante a lavagem final. Em seguida, adicione meios de dissociação de cripta fria aos pedaços de tecido do cólon lavados em um tubo de 50 mililitros e agite por cinco a 10 minutos à mão. Sob o exaustor de cultura de células, filtre o meio que contém o tecido com um filtro de células de nylon de 70 mícrons em um tubo de centrífuga de 50 mililitros fresco.Após filtração, centrifugar o tubo a 200 G durante 10 minutos à temperatura ambiente, seguido de eliminar o sobrenadante sem perturbar as criptas peletizadas. Ressuscite o pellet em três a quatro mililitros de PBS frio. Pipeta 10 microlitros da suspensão da cripta em uma linha em uma lâmina de microscópio.Usando o microscópio, conte o número de criptas longas e cheias para estimar a concentração de criptas e calcule o volume apropriado de criptas necessárias para chapear 10 criptas por microlitro em uma placa de 96 poços. Centrifugar um volume apropriado de criptas isoladas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro a 200 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante usando uma pipeta de 1.000 microlitros sem interromper as criptas peletizadas.Em seguida, adicione 100 microlitros de matriz de gel às criptas peletizadas sem introduzir bolhas de ar. Aguarde um a dois minutos até que a matriz de gel esteja parcialmente solidificada. Em seguida, placa de 10 microlitros da matriz de gel misturada com as criptas em cada poço de uma placa de cultura pré-aquecida de 96 poços para formar uma forma de cúpula.Aguarde de 10 a 20 minutos para que a matriz de gel seja totalmente ajustada, colocando a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius sob dióxido de carbono a 5%. Finalmente, adicione 100 microlitros da solução de trabalho recém-preparada de meio L-WRN suplementado com antibióticos a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Para colher os organoides, remova os meios antigos dos poços aplicando sucção a vácuo e fixe os organoides com paraformaldeído a 4% por uma hora à temperatura ambiente.Em seguida, remova 4% de paraformaldeído dos poços por sucção a vácuo e trate os organoides com 100 microlitros de 30% de sacarose por poço a quatro graus Celsius. Após 24 horas, retire 30% de sacarose dos poços por sucção a vácuo antes de adicionar 10 microlitros de PBS a cada poço. Use uma ponta de pipeta para arranhar suavemente o fundo do poço para dissociar os organoides contendo cúpula.Em seguida, remova o PBS contendo os organoides dissociados do poço com uma pipeta e transfira-o para um molde de plástico rotulado preenchido 90% com temperatura de corte ideal, ou OCT, composto. Continue o processo até que todos os organoides tenham sido removidos de todos os poços. Adicionar 2-metilbutano a um balão Dewar de aço inoxidável contendo pellets de gelo seco, o suficiente para cobrir os pellets.Congele rapidamente o organoide contendo o bloco OCT, mantendo-o constantemente acima do 2-metilbutano. Finalmente, armazene o bloco OCT contendo organoides a menos 80 graus Celsius até que esteja pronto para a seção. A imagem representativa destaca o crescimento bem-sucedido de colonóides a partir de criptas normais contendo claudin-7.As criptas contendo claudin-7 começaram a formar esferoides no segundo dia, começaram a brotar no quinto dia e continuaram crescendo e brotando até serem colhidas no nono dia. Em contraste, criptas sem claudin-7 não conseguiram formar colonóides adequados. Após o tratamento com 4-hidroxitamoxifeno por dois a três dias, as criptas nocauteadoras de claudina-7 apareceram como aglomerados circulares de células.Ao contrário do controle, as criptas não se transformaram em esferoides saudáveis. A coloração por imunofluorescência para claudina-7 no controle colhido e os organoides knockout condicionais confirmaram o knockout bem-sucedido da claudina-7 em cultura. Os colonóides de controle exibiram muito pouco sinal apoptótico no nono dia.No entanto, os colonóides knockout de claudin-7 exibiram alta apoptose ao mesmo tempo. Garantir a solidificação parcial antes do revestimento. O revestimento antes da solidificação parcial fará com que a matriz de gel se espalhe e a cúpula não seja formada, afetando a sobrevivência e o crescimento das criptas.Este protocolo pode ser utilizado para a descoberta de medicamentos, estudando a comunicação celular, o metabolismo de medicamentos, a viabilidade, a proliferação e o desenvolvimento de tratamento personalizado específico do paciente. O estabelecimento da cultura organoide revolucionou o estudo de doenças e a medicina personalizada.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Estudo de Vetores Virais em um tridimensional do fígado Modelo repovoada com a linha de células humanas carcinoma hepatocelular HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Pesquisa do câncer

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Modelo de matriz extracelular óssea tridimensional para osteossarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Um modelo tridimensional de esferoides para estudar células-tronco de câncer de cólon

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...