Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Это исследование финансировалось NIH DK103166.

Все эксперименты и процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Восточной Каролины (ECU) и проведены в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения и ECU по уходу за лабораторными животными и их использо?...

<ol>
	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

Органоидная культура является отличной моделью для изучения функции стволовых клеток, физиологии кишечника, открытия лекарств, кишечных заболеваний человека, атакже регенерации и восстановления тканей 7,8,9,10,11,26</...

Кишечная органоидная культура представляет собой трехмерную (3D) систему ex vivo, в которой стволовые клетки выделяют из кишечных крипт первичной ткани и покрывают в гелевую матрицу 1,2. Эти стволовые клетки способны к самообновлению, самоорганизации и функциональности органа2. Органоиды имитируют микроокружение тканей и больше похожи на модели in vivo, чем на двумерные (2D) модели культур клеток in vitro, хотя и менее манипулируемы, чем клетки 3,4. Эта модель устраняет препятствия, встречающиеся в 2D-моделях, такие как отсутствие надлежащих клеточно-клеточных спаек, клеточно-матричных взаимодействий и однородных популяций, а также уменьшает ограничения животных моделей, включая высокие затраты и длительные периоды времени5. Кишечные органоиды, также называемые колоноидами для тех, которые выращены из стволовых клеток, полученных из крипты толстой кишки, по существу являются мини-органами, которые содержат эпителий, включая все типы клеток, которые будут присутствовать in vivo, а также просвет. Эта модель позволяет манипулировать системой для изучения многих аспектов кишечника, таких как ниша стволовых клеток, физиология кишечника, патофизиология и морфогенез кишечника 3,5,6. Он также предоставляет отличную модель для открытия лекарств, изучения кишечных расстройств человека, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) и колоректальный рак, разработки персонализированного лечения для конкретного пациента и изучения регенерации тканей 4,7,8,9. Кроме того, органоидная система также может быть использована для изучения клеточной связи, метаболизма лекарств, жизнеспособности, пролиферации и ответа на стимулы 7,8. Хотя животные модели могут быть использованы для тестирования потенциальных терапевтических средств для кишечных патологических состояний, они довольно ограничены, поскольку изучение нескольких лекарств одновременно представляет собой проблему. Существует больше смешанных переменных in vivo, и связанные с ними затраты и время являются высокими и длинными, соответственно. С другой стороны, система органоидных культур позволяет проводить скрининг многих терапевтических средств одновременно за более короткий период времени, а также позволяет персонализировать лечение путем использования органоидной культуры, полученной от пациента 4,8. Способность органоидов толстой кишки имитировать организацию тканей, микроокружение и функциональность также делает их отличной моделью для изучения регенерации и восстановления тканей9. Наша лаборатория создала систему органоидных культур тонкой кишки для изучения влияния клаудина-7 на функции стволовых клеток тонкой кишки10. В этом исследовании установлена система культур органоидов толстого кишечника для изучения способности или отсутствия способности стволовых клеток к самообновлению, дифференцировке и пролиферации в условной модели нокаута claudin-7 (cKO).
Клодин-7 является очень важным белком плотного соединения (TJ), который высоко экспрессируется в кишечнике и необходим для поддержания функции и целостности TJ11. Мыши cKO страдают от фенотипа, подобного IBD, проявляя сильное воспаление, изъязвления, шелушение эпителиальных клеток, аденомы и повышенные уровни цитокинов11,12. Хотя широко признано, что клаудины жизненно важны для функции эпителиального барьера, появляются новые роли для клаудинов; они участвуют в пролиферации, миграции, прогрессировании рака и функции стволовых клеток 10,12,13,14,15,16,17. В настоящее время неизвестно, как клодин-7 влияет на нишу стволовых клеток и функцию стволовых клеток толстой кишки. Поскольку кишечник быстро самообновляется примерно каждые 5-7 дней, поддержание ниши стволовых клеток и правильное функционирование активных стволовых клеток имеет жизненно важное значение18. Здесь создана система для изучения потенциальных регуляторных эффектов клаудина-7 на нишу стволовых клеток толстой кишки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

Кишечный эпителий регенерирует каждые 5-7 дней и контролируется популяцией кишечных эпителиальных стволовых клеток (IESC), расположенной в нижней части области крипты. К КЭСК относятся активные стволовые клетки, которые самообновляются и дифференцируются в различные типы эпителиальных клеток, и покоящиеся стволовые клетки, которые служат резервными стволовыми клетками в случае травмы. Регенерация кишечного эпителия контролируется самообновляющимися и дифференцирующими возможностями этих активных ИЭСК. Кроме того, баланс популяции стволовых клеток крипты и поддержание ниши стволовых клеток имеют важное значение для регенерации кишечника. Органоидная культура является важным и привлекательным подходом к изучению белков, сигнальных молекул и сигналов окружающей среды, которые регулируют выживание и функции стволовых клеток. Эта модель дешевле, менее трудоемка и более манипулируема, чем модели животных. Органоиды также имитируют микроокружение тканей, обеспечивая актуальность in vivo . Настоящий протокол описывает изоляцию крипт толстой кишки, встраивание этих изолированных клеток крипты в трехмерную систему гелевой матрицы и культивирование клеток крипты с образованием органоидов толстой кишки, способных к самоорганизации, пролиферации, самообновлению и дифференцировке. Эта модель позволяет манипулировать окружающей средой, выбивая специфические белки, такие как клодин-7, активируя / деактивируя сигнальные пути и т. Д., Чтобы изучить, как эти эффекты влияют на функционирование стволовых клеток толстой кишки. В частности, была изучена роль белка плотного соединения claudin-7 в функции стволовых клеток толстой кишки. Клаудин-7 жизненно важен для поддержания кишечного гомеостаза и барьерной функции и целостности. Нокаут клавдина-7 у мышей вызывает воспалительный фенотип, подобный заболеванию кишечника, демонстрирующий воспаление кишечника, гиперплазию эпителия, потерю веса, изъязвления слизистой оболочки, шелушение эпителиальных клеток и аденомы. Ранее сообщалось, что клаудин-7 необходим для функций эпителиальных стволовых клеток кишечника в тонком кишечнике. В этом протоколе устанавливается система культуры толстой кишки для изучения роли клаудина-7 в толстой кишке.

Чтобы изучить регуляторные эффекты клаудина-7 на стволовые клетки толстой кишки, крипты толстой кишки были выделены из ткани толстой кишки мышей, как описано выше и показано на рисунке 1A. Как только крипты были выделены из первичной ткани, они были покрыты 3D-матрицей в 96-?...

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Настоящий протокол описывает создание органоидной системы толстой кишки для изучения активности и функционирования стволовых клеток толстой кишки в нокаут-модели клодина-7.

Трехмерная культура склепков толстой кишки мышей для изучения функции стволовых клеток кишечника Ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Этот протокол предоставляет метод изучения функции стволовых клеток толстой кишки в манипулируемой среде с меньшими затратами во времени, чем животные модели. Органоидная культура позволяет изучать функцию стволовых клеток в безиммунной среде. Это позволяет точно определить последствия конкретной причины, такой как нокаут клодина-7.Понимание механизмов функции стволовых клеток может пролить свет на новые терапевтические цели для изнурительных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника и колоректальный рак. Чтобы начать изоляцию толстых склепов от усыпленной мыши, сделайте разрез примерно на два дюйма ниже средней линии мыши. Затем зажмите кожу обратно, чтобы обнажить живот.Отрежьте толстую кишку чуть ниже половой оболочки с проксимальной стороны и над прямой кишкой с дистальной стороны, чтобы изолировать толстую кишку. Далее удаляют жировую ткань, прикрепленную к толстой кишке с помощью щипцов. После выталкивания кала из изолированной толстой кишки плоским концом щипцов разрезают ткань, открытую продольно.Промыть ткань от 10 до 15 раз холодным PBS, закручивая ткань вокруг PBS между стиражами щипцами. Затем, используя пару чистых, острых ножниц, разрежьте ткань на мелкие кусочки размером примерно от трех до пяти миллиметров. После выделения толстой кишки от другой усыпленной мыши соедините все кусочки ткани в 50-миллилитровую центрифужную трубку, содержащую холодные эпителиальные диссоциационные среды, и инкубируйте кусочки ткани толстой кишки в эпителиальной диссоциационной среде в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия с мягким раскачиванием.После инкубации дайте фрагментам ткани опуститься на дно трубки. После оседания отбросьте эпителиальные диссоциационные среды, не нарушая фрагменты тканей. Повторите процесс при промывке салфетки 10 - 15 раз холодным ПБС.Выбросьте как можно больше PBS во время окончательной стирки. Затем добавьте холодную среду диссоциации крипты к вымытым кусочкам ткани толстой кишки в 50-миллилитровой трубке и встряхните в течение пяти-10 минут вручную. Под капотом клеточной культуры фильтруют среду, содержащую ткань, с помощью 70-микронного нейлонового клеточного сетчатого фильтра в свежую 50-миллилитрную центрифужную трубку.После фильтрации центрифугируют трубку при 200 Г в течение 10 минут при комнатной температуре с последующим выбросом супернатанта, не нарушая гранулированные крипты. Повторно суспендируйте гранулу в трех-четырех миллилитрах холодного PBS. Пипетка 10 микролитров суспензии крипты в линии на предметном стекле микроскопа.Используя микроскоп, подсчитайте количество полных, длинных крипт, чтобы оценить концентрацию крипты и рассчитать соответствующий объем крипт, необходимых для пластины 10 крипт на микролитр в 96-луночной пластине. Центрифугировать соответствующий объем изолированных крипт в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке при 200 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем удалите супернатант с помощью пипетки объемом 1000 микролитров, не нарушая гранулированные крипты.Затем добавьте 100 микролитров гелевой матрицы в гранулированные крипты без введения пузырьков воздуха. Подождите одну-две минуты, пока гелевая матрица частично затвердеет. Затем пластину 10 микролитров гелевой матрицы смешивают с криптами в каждой лунке предварительно нагретой 96-луночной культуральной пластины, чтобы сформировать куполообразную форму.Подождите от 10 до 20 минут, чтобы гелевая матрица была полностью установлена, поместив пластину в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислого газа. Наконец, добавьте 100 микролитров свежеприготовленного рабочего раствора среды L-WRN, дополненного антибиотиками, в каждую лунку и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия под 5% углекислым газом в течение 24 часов. Чтобы извлечь органоиды, удалите старые среды из скважин путем применения вакуумного всасывания и зафиксируйте органоиды с 4% параформальдегидом в течение одного часа при комнатной температуре.Затем удаляют 4% параформальдегида из скважин вакуумным всасыванием и обрабатывают органоиды 100 микролитрами 30% сахарозы на скважину при четырех градусах Цельсия. Через 24 часа удалите 30% сахарозы из скважин вакуумным всасыванием, прежде чем добавлять 10 микролитров PBS в каждую скважину. Используйте наконечник пипетки, чтобы аккуратно поцарапать дно колодца, чтобы диссоциировать купольные органоиды.Затем удалите PBS, содержащий диссоциированные органоиды, из колодца пипеткой и перенесите его в маркированную пластиковую форму, заполненную на 90% оптимальной температурой резания, или OCT, соединение. Продолжайте процесс до тех пор, пока все органоиды не будут удалены из всех колодцев. Добавьте 2-метилбутан в колбу dewar из нержавеющей стали, содержащую гранулы сухого льда, достаточно, чтобы покрыть гранулы.Мгновенно заморозьте органоид, содержащий блок ОКТ, неуклонно удерживая его над 2-метилбутаном. Наконец, храните органоидный блок OCT при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к разделению. Репрезентативное изображение подчеркивает успешный рост колоноидов из нормальных крипт, содержащих клаудин-7.Склепы, содержащие клаудин-7, начали образовывать сфероиды ко второму дню, начали распускаться на пятый день и продолжали расти и распускаться, пока их не собрали на девятый день. Напротив, склепы, в которых отсутствовал клодин-7, не смогли сформировать надлежащих колоноидов. После лечения 4-гидрокситамоксифеном в течение двух-трех дней нокаутирующие крипты клаудина-7 появились в виде круглых скоплений клеток.В отличие от контрольных, крипты не выросли в здоровых сфероидов. Иммунофлуоресцентное окрашивание на клодин-7 в собранном контроле и условные нокаутирующие органоиды подтвердили успешное выбивание клаудина-7 в культуре. Контрольные колоноиды демонстрировали очень мало апоптотического сигнала на девятый день.Однако нокаутирующие колоноиды клаудина-7 одновременно демонстрировали высокий апоптоз. Обеспечьте частичное затвердевание перед нанесением покрытия. Покрытие перед частичным затвердеванием приведет к распространению гелевой матрицы, и купол не будет сформирован, что повлияет на выживание и рост крипт.Этот протокол может быть использован для открытия лекарств, изучения клеточной связи, метаболизма лекарств, жизнеспособности, пролиферации и разработки персонализированного лечения для конкретного пациента. Создание органоидной культуры произвело революцию в изучении болезней и персонализированной медицине.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Изучение вирусных векторов в Трехмерные модели печени заселен с клеточной линии человеческого гепатоцеллюлярной карциномой HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Протокол для быстрой Посмертное культуре клеток диффузной Характеристическая Понтийской глиомы (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Assays клеток опухоли стволовых клеток глиобластомы мозга исследования миграции и вторжения

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Трехмерная тимическая культурная система для генерации Murine индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных Опухолевые антигена конкретных Тимических эмигрантов

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Мезенхимальных стволовых клеток изолированно от ткани пульпы и культуры совместно с раковых клеток, чтобы изучить их взаимодействия

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Внеклеточная матрица модель трехмерных костей для остеосаркомы

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Трехмерная модель сфероидов для изучения стволовых клеток рака толстой кишки

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...