Name: three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Denna studie finansierades av NIH DK103166.

Alla djurförsök och procedurer godkändes av East Carolina University (ECU) Animal Care and Use Committee (IACUC) och genomfördes i enlighet med riktlinjer från National Institutes of Health och ECU om laboratoriedjurvård och användning. Inducerbara, tarmspecifika claudin-7 knockout-möss genererades genom att korsa C57BL6 claudin-7-flox transgena möss med Villin-CreERT2 möss19. Manliga och kvinnliga möss i åldern 3 månader användes i denna studie.
1. ...

<ol>
	<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids:+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology.">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li><li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+development+and+application+of+human+organoids.">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).</li><li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research.">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).</li><li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications.">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li><li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+3D+cell+culture+models:+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research.">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li><li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intesitnal+enteroids/organoids:+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases.">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration.">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li><li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation.">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice.">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li><li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudins+in+intestines:+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases.">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).</li><li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy:+a+clinical+perspective.">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li><li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+(MET)+to+inhibit+colon+tumorigenesis.">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement.">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120 (2015).</li><li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer:+a+review.">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay.">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7.">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li><li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia.">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).</li><li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity.">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li><li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina.">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).</li><li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice:+relationship+with+thiol+metabolism.">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-&#946;-catenin+signaling.">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-&#946;-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).</li><li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+organoids:+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease.">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li></ol>

Organoidodling är en utmärkt modell för att studera stamcellsfunktion, tarmfysiologi, läkemedelsupptäckt, mänskliga tarmsjukdomar och vävnadsregenerering och reparation 7,8,9,10,11,26. Även om det har många fördelar kan det vara utmanande att etablera. Försiktighet måste vidtas i alla steg under hela protokollet, ...

Tarmorganoidodling är ett tredimensionellt (3D) ex vivo-system där stamceller isoleras från tarmkrypterna i primärvävnaden och pläteras till en gelmatris 1,2. Dessa stamceller kan självförnya, självorganisera och organfunktionalitet2. Organoider efterliknar vävnadsmikromiljön och liknar mer in vivo-modeller än tvådimensionella (2D) in vitro-cellodlingsmodeller, även om de är mindre manipuleringsbara än cellerna 3,4. Denna modell eliminerar hinder som uppstår i 2D-modeller, såsom brist på korrekta cell-celladhesioner, cellmatrisinteraktioner och homogena populationer, och minskar också begränsningarna för djurmodeller, inklusive höga kostnader och långa tidsperioder5. Tarmorganoider - även kallade kolonoider för de som odlas från kolonkrypt-härledda stamceller - är i huvudsak miniorgan som innehåller ett epitel inklusive alla celltyper som skulle vara närvarande in vivo, liksom en lumen. Denna modell möjliggör manipulation av systemet för att studera många aspekter av tarmen, såsom stamcellsnischen, tarmfysiologi, patofysiologi och tarmmorfogenes 3,5,6. Det ger också en bra modell för läkemedelsupptäckt, studerar mänskliga tarmsjukdomar som inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och kolorektal cancer, patientspecifik personlig behandlingsutveckling och studerar vävnadsregenerering 4,7,8,9. Dessutom kan organoidsystemet också användas för att studera cellulär kommunikation, läkemedelsmetabolism, livskraft, proliferation och svar på stimuli 7,8. Medan djurmodeller kan användas för att testa potentiella terapier för tarmpatologiska tillstånd, är de ganska begränsade, eftersom det är en utmaning att studera flera läkemedel samtidigt. Det finns fler förvirrande variabler in vivo, och tillhörande kostnad och tid är höga respektive långa. Å andra sidan möjliggör organoidodlingssystemet screening av många terapier samtidigt under en kortare tidsperiod och möjliggör också personlig behandling genom användning av patient-härledd organoidkultur 4,8. Förmågan hos kolonorganoider att efterlikna vävnadsorganisation, mikromiljö och funktionalitet gör dem också till en utmärkt modell för att studera regenerering och vävnadsreparation9. Vårt laboratorium har etablerat ett tunntarmsorganoidodlingssystem för att studera effekten av claudin-7 på tunntarmens stamcellsfunktioner10. I denna studie etableras ett magorganoidodlingssystem för att studera stamcellers förmåga, eller brist på förmåga, att självförnya, differentiera och sprida sig i en villkorlig claudin-7 knockout (cKO) -modell.
Claudin-7 är ett mycket viktigt protein med tät korsning (TJ) som uttrycks starkt i tarmen och är viktigt för att upprätthålla TJ-funktion och integritet11. cKO-möss lider av en IBD-liknande fenotyp och uppvisar allvarlig inflammation, sårbildning, epitelcellsloughing, adenom och ökade cytokinnivåer11,12. Även om det är allmänt accepterat att claudins är avgörande för epitelbarriärfunktion, växer nya roller för claudins fram; De är involverade i spridning, migration, cancerprogression och stamcellsfunktion 10,12,13,14,15,16,17. Det är för närvarande okänt hur claudin-7 påverkar stamcellsnischen och funktionen hos kolonstamceller. Eftersom tarmen snabbt förnyas ungefär var 5-7: e dag är det viktigt att upprätthålla stamcellsnischen och att de aktiva stamcellerna fungerar korrekt18. Här etableras ett system för att undersöka de potentiella regulatoriska effekterna av claudin-7 på kolonstamcellsnischen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>United States Plastic Corp</td>
			<td>78564</td>
			<td>anesthesia chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>69715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>277258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>J61899.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>579002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-7 anti-murine rabbit antibody</td>
			<td>Immuno-Biological Laboratories&#160;</td>
			<td>18875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass (24 x 50-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12544E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>vwr</td>
			<td>25608-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RCF BME, Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>gel matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 anti-rabbit antibody</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1173F61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose with L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FLoid Imaging System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4477136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gel II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4059-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M) Buffer Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ cell death detection kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>07-893-8440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-WRN Media</td>
			<td>Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse surgical kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum cutting temperature (OCT) compound&#160;</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza Rack</td>
			<td>vwr</td>
			<td>10129-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S-279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter (0.22 &#181;m; cellulose acetate)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional culture of murine colonic crypts to study intestinal stem cell function ex vivo

Tarmepitelet regenererar var 5-7: e dag och styrs av tarmepitelstamcellspopulationen (IESC) som ligger längst ner i kryptregionen. IESC inkluderar aktiva stamceller, som självförnyar och differentieras till olika epitelcelltyper, och vilande stamceller, som fungerar som reservstamceller vid skada. Regenerering av tarmepitelet styrs av de självförnyande och differentierande egenskaperna hos dessa aktiva IESC: er. Dessutom är balansen mellan kryptstamcellspopulationen och underhållet av stamcellsnischen avgörande för tarmregenerering. Organoidodling är ett viktigt och attraktivt tillvägagångssätt för att studera proteiner, signalmolekyler och miljösignaler som reglerar stamcellsöverlevnad och funktioner. Denna modell är billigare, mindre tidskrävande och mer manipuleringsbar än djurmodeller. Organoider efterliknar också vävnadsmikromiljön, vilket ger in vivo-relevans . Det nuvarande protokollet beskriver isoleringen av kolonkrypter, bäddar in dessa isolerade kryptceller i ett tredimensionellt gelmatrissystem och odlar kryptceller för att bilda kolonorganoider som kan självorganisera, proliferation, självförnyelse och differentiering. Denna modell gör det möjligt för en att manipulera miljö-slå ut specifika proteiner som claudin-7, aktivera/inaktivera signalvägar etc.-för att studera hur dessa effekter påverkar funktionen hos kolonstamceller. Specifikt undersöktes rollen av tight junction protein claudin-7 i kolonstamcellsfunktionen. Claudin-7 är avgörande för att upprätthålla tarmhomeostas och barriärfunktion och integritet. Knockout av claudin-7 hos möss inducerar en inflammatorisk tarmsjukdomsliknande fenotyp som uppvisar tarminflammation, epitelial hyperplasi, viktminskning, slemhinnesår, epitelcellsloughing och adenom. Tidigare rapporterades att claudin-7 krävs för tarmepitelstamcellsfunktioner i tunntarmen. I detta protokoll upprättas ett kolonorganoidodlingssystem för att studera rollen av claudin-7 i tjocktarmen.

För att undersöka de regulatoriska effekterna av claudin-7 på kolonstamceller isolerades kolonkrypter från murin kolonvävnad enligt beskrivningen ovan och visas i figur 1A. När krypterna isolerades från primärvävnaden pläterades de i en 3D-matris i en 96-brunnsplatta för att växa i 11 dagar (figur 1). Normala friska krypter stänger lumen och blir sfäroider vid dag 2 och börjar så småningom spira och bilda de olika epitelcelltyperna ungefär dag ...

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo at JoVE.com

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Detta protokoll beskriver upprättandet av ett murint kolonorganoidsystem för att studera aktiviteten och funktionen hos kolonstamceller i en claudin-7 knockout-modell.

Tredimensionell kultur av murina kolonkrypter för att studera tarmstamcellsfunktion ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Detta protokoll ger en metod för att studera funktionen hos kolonstamceller i en manipuleringsbar miljö med lägre kostnad i tid än djurmodeller. Organoidodling möjliggör studier av stamcellsfunktion i en immunfri miljö. Detta gör det möjligt att fastställa effekterna av en specifik orsak, såsom knockout av claudin-7.Att förstå mekanismerna för stamcellsfunktion kan belysa nya terapeutiska mål för försvagande sjukdomar som inflammatorisk tarmsjukdom och kolorektal cancer. För att börja isolera kolonkrypter från den avlivade musen, gör ett snitt på cirka två tum längs musens mittlinje. Fäst sedan tillbaka huden för att exponera buken.Skär tjocktarmen strax under coecum från den proximala sidan och ovanför ändtarmen från den distala sidan för att isolera tjocktarmen. Ta sedan bort fettvävnaden som är fäst vid tjocktarmen med pincett. Efter att ha tryckt ut avföring från den isolerade tjocktarmen med den plana änden av pincett, skär vävnaden öppen i längdriktningen.Tvätta vävnaden 10 till 15 gånger med kall PBS genom att virvla runt vävnaden i PBS mellan tvättar med pincett. Skär sedan vävnaden i små bitar från cirka tre till fem millimeter med en ren, skarp sax. Efter att ha isolerat tjocktarmen från en annan avlivad mus, kombinera alla vävnadsbitar i ett 50-ml centrifugrör innehållande kallt epiteldissociationsmedium och inkubera kolonvävnadsbitarna i epiteldissociationsmedier i 90 minuter vid fyra grader Celsius med mild gungning.Efter inkubation, låt vävnadsfragmenten sjunka till botten av röret. När det är avgjort, kassera epiteldissociationsmediet utan att störa vävnadsfragmenten. Upprepa processen när du tvättar vävnaden 10 till 15 gånger med kall PBS.Kassera så mycket PBS som möjligt under den slutliga tvätten. Lägg sedan till kallt kryptdissociationsmedium till de tvättade kolonvävnadsbitarna i ett 50-milliliters rör och skaka i fem till 10 minuter för hand. Under cellodlingshuven filtrerar du mediet som innehåller vävnaden med en 70-mikron nyloncellsil i ett färskt 50 ml centrifugrör.Efter filtrering, centrifugera röret vid 200 G i 10 minuter vid rumstemperatur, följt av att kasta supernatanten utan att störa de pelleterade krypterna. Återsuspendera pelleten i tre till fyra milliliter kall PBS. Pipettera 10 mikroliter av kryptsuspensionen i en linje på en mikroskopbild.Använd mikroskopet och räkna antalet fulla, långa krypter för att uppskatta kryptkoncentrationen och beräkna lämplig volym krypter som krävs för att platta 10 krypter per mikroliter i en 96-brunnsplatta. Centrifugera en lämplig volym isolerade krypter i ett 1,5-milliliter mikrocentrifugrör vid 200 G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Ta sedan bort supernatanten med en pipett på 1 000 mikroliter utan att störa de pelleterade krypterna.Tillsätt sedan 100 mikroliter gelmatris till de pelleterade krypterna utan att införa luftbubblor. Vänta i en till två minuter tills gelmatrisen delvis stelnat. Sedan blandas 10 mikroliter av gelmatrisen med krypterna i varje brunn i en förvärmd odlingsplatta med 96 brunnar för att bilda en kupolform.Låt 10 till 20 minuter för gelmatrisen vara helt inställd genom att placera plattan i en inkubator vid 37 grader Celsius under 5% koldioxid. Slutligen tillsätt 100 mikroliter av den nyberedda arbetslösningen av L-WRN-media kompletterad med antibiotika till varje brunn och inkubera plattan vid 37 grader Celsius under 5% koldioxid i 24 timmar. För att skörda organoiderna, ta bort gamla medier från brunnarna genom att applicera vakuumsugning och fixera organoiderna med 4% paraformaldehyd i en timme vid rumstemperatur.Ta sedan bort 4% paraformaldehyd från brunnarna genom vakuumsugning och behandla organoiderna med 100 mikroliter 30% sackaros per brunn vid fyra grader Celsius. Efter 24 timmar, ta bort 30% sackaros från brunnarna genom vakuumsugning innan du tillsätter 10 mikroliter PBS till varje brunn. Använd en pipettspets för att försiktigt repa botten av brunnen för att dissociera de kupolinnehållande organoiderna.Ta sedan bort PBS som innehåller de dissocierade organoiderna från brunnen med en pipett och överför den till en märkt plastform fylld 90% med optimal skärtemperatur, eller OCT, förening. Fortsätt processen tills alla organoider har tagits bort från alla brunnar. Tillsätt 2-metylbutan till en Dewar-kolv av rostfritt stål som innehåller torrispellets, tillräckligt för att täcka pelletsen.Flash-frys den organoid som innehåller OCT-blocket genom att stadigt hålla den ovanför 2-metylbutan. Slutligen förvara det organoidinnehållande OCT-blocket vid minus 80 grader Celsius tills det är klart att delas. Den representativa bilden belyser den framgångsrika tillväxten av koloider från normala krypter som innehåller claudin-7.Krypterna som innehåller claudin-7 började bilda sfäroider vid dag två, började spira på dag fem och fortsatte att växa och spira tills de skördades på dag nio. Däremot misslyckades krypter som saknade claudin-7 att bilda ordentliga kolonoider. Efter behandling med 4-hydroxytamoxifen i två till tre dagar uppträdde claudin-7 knockout-krypterna som cirkulära klumpar av celler.Till skillnad från kontrollen växte krypterna inte till friska sfäroider. Immunofluorescensfärgning för claudin-7 i den skördade kontrollen och de villkorliga knockoutorganoiderna bekräftade den framgångsrika knockouten av claudin-7 i kulturen. Kontrollkolonioiderna uppvisade mycket liten apoptotisk signal på dag nio.Claudin-7 knockout-kolonioider visade dock hög apoptos samtidigt. Säkerställ partiell stelning före plätering. Plätering före partiell stelning kommer att få gelmatrisen att spridas och kupolen kommer inte att bildas, vilket påverkar krypternas överlevnad och tillväxt.Detta protokoll kan användas för läkemedelsupptäckt, studera cellulär kommunikation, läkemedelsmetabolism, livskraft, spridning och utveckla patientspecifik personlig behandling. Etableringen av organoidkultur har revolutionerat studien av sjukdomar och personlig medicin.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Studie av virala vektorer i en Tredimensionell Lever modell nyinsatta med Human Hepatocellulär cancer HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytta uppåt: Ett enkelt och flexibelt In Vitro tredimensionella Invasion Assay protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Ett tredimensionellt thymic kultur system för att generera murin inducerad pluripotenta stamcells härledda tumör antigen-specifika thymic emigranter

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymala stamceller isolering från massa vävnad och samtidig kultur med cancerceller för att studera deras interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Tredimensionella ben extracellulärmatrix modell för osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flödescytometrisk analys av mitokondriella reaktiva syreradikaler i murina hematopoietiska Stem och progenitorceller och MLL-AF9 driven leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Utvärdera celldöd med hjälp av cellfri supernatant av probiotika i tredimensionella sfäroidkulturer av kolorektalcancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

En tredimensionell modell av sfäroider för att studera tjocktarmscancerstamceller

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...