Name: gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins at JoVE.com

אנו רוצים להודות לכל הסטודנטים במעבדה לביולוגיה סינתטית - SPST, TJU - על עזרתם הכללית, יחד עם ג'י לי ושיאנגיאנג ז'אנג על עזרתם בניסויי FACS.

1. תכנון ובנייה של קלטת ביטוי sgRNA/crRNA
הערה: ישנם שני סוגים של קלטות ביטוי sgRNA/crRNA: SNR5210 המורכב ממקדם SNR52 תלוי RNA פולימראז III, רצף sgRNA/crRNA ומסיים SUP4; מבנה נוסף, המקוצר כ-RGR11, מורכב ממקדם ADH1 תלוי RNA פולימראז II, מבנה RGR (ribozyme-guide RNA-ribozyme) המכיל שני ?...

<ol>
	<li>Marchisio, M. A., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+design+of+digital+synthetic+gene+circuits.">Automatic design of digital synthetic gene circuits.</a> PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083 (2011).</li><li>Karnaugh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+map+method+for+synthesis+of+combinational+logic+circuits.">The map method for synthesis of combinational logic circuits.</a> Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).</li><li>Mandell, J. G., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+finger+tools:+custom+DNA-binding+domains+for+transcription+factors+and+nucleases.">Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases.</a> Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).</li><li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+effectors:+customizable+proteins+for+DNA+targeting.">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li><li>Drinnenberg, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+budding+yeast.">RNAi in budding yeast.</a> Science. 326 (5952), 544-550 (2009).</li><li>Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+logic+circuits+in+yeast+with+CRISPR-dCas9+NOR+gates.">Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates.</a> Nature Communications. 8, 15459 (2017).</li><li>Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+and+multifunctional+eukaryotic+transcription+factors+based+on+CRISPR/Cas.">Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas.</a> ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).</li><li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-mediated+control+of+gene+editing+and+synthetic+circuits+in+eukaryotic+cells.">Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 194 (2019).</li><li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast.">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131 (1), 129-134 (1993).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gao, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-processing+of+ribozyme-flanked+RNAs+into+guide+RNAs+in+vitro+and+in+vivo+for+CRISPR-mediated+genome+editing.">Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Yu, L., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+synthetic+transcriptional+networks+harnessing+dCas12a+and+Type+V-A+anti-CRISPR+proteins.">Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).</li><li>Zhang, Y., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bare+dSpCas9,+scaffold+gRNA,+and+type+II+anti-CRISPR+proteins+highly+favors+the+control+of+gene+expression+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).</li><li>Sheff, M. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cassettes+for+fluorescent+protein+tagging+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).</li><li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRdirect:+software+for+designing+CRISPR/Cas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites.">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li><li>Chee, M. K., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+redesigned+pRS+plasmid+shuttle+vectors+for+genetic+manipulation+of+Saccharomyces+cerevisiae.">New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides.">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. Fourth edition. , (2012).</li><li>Sanger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+nucleotide+sequences+in+DNA.">Determination of nucleotide sequences in DNA.</a> Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Zalatan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+complex+synthetic+transcriptional+programs+with+CRISPR+RNA+scaffolds.">Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds.</a> Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).</li><li>Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+terminators+be+used+as+insulators+into+yeast+synthetic+gene+circuits.">Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits.</a> Journal of Biological Engineering. 10, 19 (2016).</li><li>Rauch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CRISPR-Cas9+with+bacteriophage+proteins.">Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins.</a> Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).</li><li>Hynes, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+from+a+virulent+streptococcal+phage+inhibits+Streptococcus+pyogenes+Cas9.">An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9.</a> Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).</li><li>Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+natural+CRISPR-Cas12a+inhibitors.">Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors.</a> Science. 362 (6411), 236-239 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).</li><li>Hahne, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flowCore:+a+Bioconductor+package+for+high+throughput+flow+cytometry.">flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 106 (2009).</li><li>Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-based+biosensors+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae.</a> Journal of Biological Engineering. 12, 11 (2018).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+protein+disables+type+V+Cas12a+by+acetylation.">An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).</li></ol>

הפרוטוקול הראה זרימת עבודה מלאה אפשרית עבור מעגלים דיגיטליים של גנים סינתטיים, לאחר מחזור ההנדסה הביולוגית "תכנון-בנייה-בדיקה-למידה" (DBTL) ובנוגע לניסויי מעבדה יבשה ומעבדה רטובה. כאן, התמקדנו במערכת CRISPR-Cas, בעיקר dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a וחלבוני האנטי-קריספר המתאימים, על ידי תכנון ובנייה ברשתות שעת...

בשנת 2011, חוקרים הציעו שיטה חישובית ופיתחו תוכנה מתאימה לתכנון אוטומטי של מעגלי גנים סינתטיים דיגיטליים1. המשתמש היה צריך לציין את מספר הקלטים (שלוש או ארבע) ולמלא את טבלת האמת המעגלית; זה סיפק את כל המידע הדרוש כדי לגזור את מבנה המעגל באמצעות טכניקות מאלקטרוניקה. טבלת האמת תורגמה לשתי נוסחאות בוליאניות בשיטת מפת קרנאו2. כל נוסחה בוליאנית מורכבת ממשפטים המתארים פעולות לוגיות (סכום או כפל) בין (חלק) קלטי המעגל ושלילותיהם (הליטרלים). סעיפים, בתורם, מסוכמים (OR) או מוכפלים (AND) כדי לחשב את פלט המעגל. כל מעגל יכול להתממש על פי כל אחת משתי הנוסחאות המתאימות: האחת כתובה בצורת קופה (מכפלה של סכומים) והשנייה בצורת SOP (סכום מוצרים). הראשון מורכב מכפל של סעיפים (כלומר, שערים בוליאניים) המכילים סכום לוגי של הליטרלים. האחרון, לעומת זאת, הוא סכום של סעיפים שבהם מכפילים את המילוליים.
מעגלים חשמליים יכולים להתממש, על קרש לחם, על ידי חיווט פיזי של שערים שונים יחד. הזרם החשמלי מאפשר חילופי אותות בין השערים, מה שמוביל לחישוב הפלט.
בביולוגיה המצב מורכב יותר. שער בוליאני יכול להתממש כיחידת שעתוק (TU; כלומר, הרצף "מקדם-קידוד אזור-מסיים" בתוך תאים איקריוטים), שבו שעתוק או תרגום (או שניהם) מוסדרים. לפיכך, לפחות שני סוגים של מולקולות יוצרים חיווט ביולוגי: חלבוני גורם השעתוק והרנ"א האנטיסנס שאינו מקודד1.
מעגל דיגיטלי גנטי מאורגן בשתיים או שלוש שכבות של שערים, כלומר: 1) שכבת הקלט, העשויה משערי כן (חיץ) ולא וממירה את כימיקלי הקלט למולקולות חיווט; 2) השכבה הפנימית, המורכבת מכמה TUs שיש סעיפים בנוסחה הבוליאנית המתאימה. אם המעגל מתוכנן על פי נוסחת SOP, כל סעיף בשכבה הפנימית יפיק את פלט המעגל (למשל, פלואורסצנציה) במה שנקרא ארכיטקטורת פלט מבוזר. אם משתמשים בנוסחת המכפלה של סכום (POS), נדרשת שכבה סופית 3), שתכיל שער כפל יחיד האוסף את מולקולות החיווט מהשכבה הפנימית.
בסך הכל, בביולוגיה סינתטית, ניתן לתכנן סכמות רבות ושונות עבור אותו מעגל. הם נבדלים במספר ובסוג של TUs ומולקולות חיווט. על מנת לבחור את הפתרון הקל ביותר ליישום בתאי שמרים, כל תכנון מעגל משויך לציון סיבוכיות S, המוגדר כ
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;">
כאשר A מייצג את מספר המפעילים, R מייצג את מספר המדכאים, ו-A הוא כמות מולקולות האנטיסנס RNA. אם מפעילים או מדכאים נעדרים מהמעגל, תרומתם ל-S היא אפס. לכן, קשה יותר לממש סכמת מעגלים במעבדה (S גבוהה) כאשר היא דורשת מספר גבוה של גורמי שעתוק אורתוגונליים. משמעות הדבר היא כי מפעילים ומדכאים חדשים יונדסו דה נובו על מנת לממש את החיווט המלא בתוך המעגלים הדיגיטליים. באופן עקרוני, ניתן להרכיב חלבונים קושרי דנ"א חדשים באמצעות חלבוני אצבע אבץ3 ואפקטי TAL4 כתבניות. עם זאת, אפשרות זו נראית מפרכת מדי וגוזלת זמן; לכן, יש להסתמך בעיקר על רנ"א קטן ובקרת תרגום כדי לסיים מעגלי גנים מורכבים.
במקור, שיטה זו פותחה כדי לייצר מעגלים דיגיטליים בחיידקים. ואכן, בתאים איקריוטים, במקום רנ"א אנטיסנס, מתאים יותר לדבר על מיקרו-רנ"א (miRNAs) או על רנ"א מפריע קטן (siRNAs)5. עם זאת, מסלול RNAi אינו קיים שמרים S. cerevisiae. לפיכך, יש לבחור ברשתות תמלול מלאות. נניח שמעגל חשמלי זקוק לחמישה מפעילים וחמישה מדכאים; ציון הסיבוכיות שלו יהיה S = 32. ניתן להפחית את מורכבות המעגל על ידי החלפת 10 גורמי השעתוק ב- dCas96 יחיד (Cas9 חסר נוקלאז) המאוחה לתחום הפעלה (AD). כפי שמוצגב-7, dCas9-AD פועל כמדכא בשמרים בעת קשירת מקדם בין תיבת TATA ל-TSS (אתר התחלת שעתוק) וכמפעיל בעת קשירה טובה במעלה הזרם של תיבת TATA. לפיכך, ניתן להחליף 10 גורמי שעתוק בחלבון היתוך dCas9-AD יחיד ו-10 sgRNA (RNA מנחה יחיד) לקבלת ציון סיבוכיות כולל של S = 11. זה מהיר וקל לסנתז עשרה sgRNAs, בעוד שכפי שצוין קודם לכן, הרכבה של 10 חלבונים תדרוש עבודה ארוכה ומסובכת הרבה יותר.
לחלופין, ניתן להשתמש בשני חלבוני dCas אורתוגונליים (למשל, dCas9 ו-dCas12a): אחד כדי להתיך לאלצהיימר, והשני חשוף או בשילוב עם תחום דיכוי. ציון הסיבוכיות יגדל ביחידה אחת בלבד (S = 12). לפיכך, מערכות CRISPR-dCas הן המפתח לבניית מעגלים ספרתיים מורכבים מאוד של גנים בשמרי אפייה (S. cerevisiae).
מאמר זה מאפיין באופן עמוק את היעילות של מדכאים ומפעילים מבוססי dCas9 ו-dCas12a בשמרים. התוצאות מראות כי הם אינם דורשים כמות גבוהה של sgRNA כדי לייעל את פעילותם, ולכן פלסמידים אפיזומליים הם העדיפו להימנע. יתר על כן, מפעילים מבוססי dCas9 יעילים הרבה יותר בעת שימוש ב-RNA פיגום (scRNA) המגייס עותקים של VP64 AD. לעומת זאת, dCas12a עובד היטב כאשר הוא מאוחה ישירות ל-VPR AD החזק. יתר על כן, מקדם מופעל סינתטי דורש מספר משתנה של אתרי מטרה, בהתאם לתצורה של מפעיל (למשל, שלושה בעת שימוש dCas12a-VPR, שישה עבור dCas9-VP64, ורק אחד עם dCas9 ו scRNA). כמדחיק, dCas12a נראה נוקב יותר בעת קשירת אזור הקידוד ולא המקדם.
כחיסרון, עם זאת, CRISPR-dCas9/dCas12a אינם מתקשרים ישירות עם כימיקלים. לכן, ייתכן שלא יועיל להם בשכבת הקלט. מסיבה זו נחקרו עיצובי שערים בוליאניים חלופיים המכילים חלבונים אנטי-קריספר (Acrs). Acrs לפעול על (d)Cas חלבונים ולעכב את פעולתם8. לפיכך, הם אמצעי לווסת את הפעילות של מערכות CRISPR-(d)Cas. מאמר זה מנתח ביסודיות את האינטראקציות בין סוג II Acrs ו- (d)Cas9, כמו גם סוג V Acrs ו- (d)Cas12a ב- S. cerevisiae. מכיוון ש-Acrs קטנים בהרבה מחלבוני Cas, שער NOT המגיב לאסטרוגן β-אסטרדיול נבנה על ידי איחוי תחום קשירת ההורמונים של קולטן האסטרוגן האנושי 9-HBD(hER)-ל-AcrIIA4. חוץ מזה, קומץ שערים של כן ו-NOT שביטאו dCas12a(-AD) באופן מכונן ו-AcrVAs עם אינדוקציה עם גלקטוז מומשו. כיום, שערים אלה משמשים רק כהוכחת היתכנות. עם זאת, הם גם מייצגים את הצעד הראשון לקראת חשיבה מחודשת עמוקה על האלגוריתם לביצוע התכנון האוטומטי החישובי של מעגלים דיגיטליים של גנים סינתטיים בתאי שמרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mL PCR 8-strip tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>403112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose-molecular biology grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>75510-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA gel extraction kit</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-GX-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSuite CS&#38;T research beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>650621</td>
			<td>Fluorescent beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSVerse flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall ST 16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli competent cells (Strain DH5&#945;)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18263-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL select Western Blotting detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd</td>
			<td>JY300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat 8-strip caps</td>
			<td>NEST</td>
			<td>406012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene synthesis company</td>
			<td>Azenta Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiFiScript cDNA synthesis kit</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2569M</td>
			<td>Kit used in step 6.2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysate solution (Zymolyase)</td>
			<td>zymoresearch</td>
			<td>E1004-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;10 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;1000 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;200 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII403</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII404</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII405</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII406</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII424</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTPGI_dSpCas9_VP64&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-fidelity DNApolymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-Acc65I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-SacI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 96&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td>Real-Time PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae CEN.PK2-1C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; 
			MAL2-8c; SUC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem-Loop Kit</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>AG0502</td>
			<td>Kit used in step 6.2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>186-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 Exonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR820Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YeaStar RNA kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins

גנים סינתטיים לשערים בוליאניים ולמעגלים דיגיטליים יש מגוון רחב של יישומים, החל מאבחון רפואי ועד לטיפול סביבתי. גילוי מערכות CRISPR-Cas והמעכבים הטבעיים שלהן - חלבוני האנטי-קריספר (Acrs) - מספק כלי חדש לתכנון ויישום מעגלים דיגיטליים של גנים in vivo . כאן, אנו מתארים פרוטוקול העוקב אחר הרעיון של מחזור ההנדסה הביולוגית "תכנון-בנייה-בדיקה-למידה" ועושה שימוש ב- dCas9/dCas12a יחד עם ה- Acrs המתאימים שלהם כדי ליצור רשתות שעתוק קטנות, שחלקן מתנהגות כמו שערים בוליאניים, ב - Saccharomyces cerevisiae. תוצאות אלה מציינות את המאפיינים של dCas9/dCas12a כגורמי שעתוק. בפרט, כדי להשיג הפעלה מקסימלית של ביטוי גנים, dSpCas9 צריך לקיים אינטראקציה עם RNA פיגום מהונדס שאוסף עותקים מרובים של תחום ההפעלה VP64 (AD). לעומת זאת, dCas12a יאוחה, במסוף C, עם VP64-p65-Rta (VPR) AD חזק. יתר על כן, הפעילות של שני חלבוני Cas אינה משופרת על ידי הגדלת כמות sgRNA/crRNA בתא. מאמר זה גם מסביר כיצד לבנות שערים בוליאניים בהתבסס על אינטראקציית CRISPR-dCas-Acr. תחום קשירת ההורמונים המאוחה AcrIIA4 של קולטן האסטרוגן האנושי הוא הליבה של שער NOT המגיב ל-β-אסטרדיול, בעוד ש-AcrVAs המסונתזים על ידי מקדם GAL1 המושרה מאפשרים לחקות שערי כן ו-NOT עם גלקטוז כקלט. במעגלים האחרונים, AcrVA5, יחד עם dLbCas12a, הראו את ההתנהגות הלוגית הטובה ביותר.

ביטוי sgRNA/crRNA על ידי מקדם RNA פולימראז מסוג III ראשית, עבודה זו התייחסה להנדסה של מעגל הפעלת השעתוק (מעגל 1) המוצג באיור 1A. הוא הכיל שלושה מרכיבים בסיסיים: 1) הגן המקודד ל-yEGFP (המדווח), שקדמו לו סדרה של מקדמים סינתטיים שונים שסיפקו אתרי מטרה עבור dCas9/dCas12a-AD; 2) גרסה ממוטבת קו?...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins at JoVE.com

Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר שולבו בתוכנית של שערים בוליאניים בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae). המעגלים הלוגיים הקטנים החדשים הראו ביצועים טובים והעמיקו את ההבנה של גורמי שעתוק מבוססי dCas9/dCas12a והתכונות של חלבונים אנטי-קריספר.

מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

הפרוטוקול שלנו מסביר כיצד לתכנן, לבנות ולנתח מעגלים דיגיטליים של גנים של שמרים המשתמשים במערכות CRISPR dCas מסוג שתיים וחמש ובחלבוני האנטי-קריספר המתאימים. זה הרכבה להישאר כי זה אוסף אפס נהלים סטנדרטיים כדי להרכיב ולבדוק רשתות תמלול סינתטי בשירותים. כדי להתחיל, הכינו תערובת תגובה המכילה 20 עד 40 ננוגרם של תבנית DNA, מיקרוליטר אחד של פריימר קדמי, מיקרוליטר אחד של פריימר הפוך, חמישה מיקרוליטרים של תערובת DNTP, 0.5 מיקרוליטר של DNA פולימראז, 10 מיקרוליטרים של חיץ תגובת DNA פולימראז 5x, ומים מזוקקים פעמיים עד לנפח כולל של 50 מיקרוליטר.להגביר את רצפי ה- DNA באמצעות תוכנית ה- PCR touchdown על thermocycler כמתואר בכתב היד. בודדו את מוצרי ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ודללו את רצפי ה-DNA מג'ל האגרוז באמצעות ערכת מיצוי ג'ל DNA. באמצעות שיטת ההרכבה של גיבסון, הכניסו את מוצרי ה-PCR המטוהרים לווקטור המעבורת החתוך-פתוח על ידי הכנסת תערובת הדנ"א השקולה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.בנה את וקטור הקבלה dCas12a באמצעות PCR טאצ'דאון ושיטת ההרכבה של גיבסון כפי שהודגם בעבר. הכנס את קודון השמרים הממוטב לחלבוני dCas12a לשני וקטורי הקבלה החדשים שנבנו באמצעות עיכול עם BamH1 ו- Xhol1 וקשירה עם ליגאז DNA T4. באופן דומה, בנו את הפלסמידים על בסיס וקטור המעבורת pRS2403 כדי לבטא את חלבוני האנטי-קריספר באמצעות PCR טאצ'דאון ושיטת ההרכבה של גיבסון.כדי לבצע זיהוי תאי מיקרוסקופיה, הניחו שני מיקרוליטרים של תמיסת התא על מגלשת זכוכית וכסו אותה בהחלקת כיסוי. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי הפעלת מקור האור הפלואורסצנטי, המיקרוסקופ והמחשב. לאחר כתיבת מספר מקור האור הפלואורסצנטי, פתח את תוכנת המיקרוסקופ במחשב.הניחו את השקופית על במת המיקרוסקופ ובחרו את עדשת ה-40x האובייקטיבית תוך התבוננות בתאים תחת האור הירוק. הזיזו את ידית מיקוד המסלול עד שיופיע קווי המתאר של תאי השמרים ואת ידית המיקוד העדינה כדי למקד את התאים. כדי לזהות את התאים, לאחר סגירת שדה הראייה של המיקרוסקופ לעבור למסך המחשב ולחץ על חי.המתן שלוש עד חמש שניות. לחץ על צלם כדי לצלם תמונה ולשמור את התמונה. לאחר מכן, כבה את המחשב, המיקרוסקופ ומקור האור הפלואורסצנטי.הפעל את מכונת FACS 20 דקות לפני המדידות כדי לחמם את הלייזר ולערבב 20 מיקרוליטר של תרבית התאים עם 300 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפול. הפעל את תוכנת FACS במחשב המחובר למחשב FACS וצור ניסוי חדש. לאחר מכן הגדר את פרמטרי המדידה.לאחר מכן, בחר את המסנן בהתאם לאורכי גל העירור והפליטה של הדגימות והגדר את מספר תא הרכישה ל -10, 000. כוונן את מתח מסנן FITC על ידי מדידת עוצמת החרוזים הפלואורסצנטיים, וודא שההבדל היחסי בעוצמת החרוזים בין שני ניסויים עוקבים אינו עולה על 5% שטוף את המכונה במים מזוקקים כפול למשך מספר שניות כדי להסיר חרוזים עודפים אפשריים. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של הדגימה ולחץ על תצוגה מקדימה תוך המתנה של שלוש עד חמש שניות ליציבות הזרקת הדגימה.לבסוף לחץ על רכישה. מדדו שוב את החרוזים בסוף הניסוי. לאחר בדיקה אם ההבדל היחסי בין שתי מדידות החרוזים עולה על 5%ייצא את נתוני FACS כקבצי FCS.פתח את סטודיו R וטען את BDverse_analysis התסריט. R כדי לנתח את קבצי FCS. הגדר את שם הניסוי כ- ename, נתיב הספרייה שבו מאוחסנים קבצי FCS כ- dir_d וקובצי התוצאה ייווצרו כ- dir_r.לאחר מכן, הגדר את ערוץ הפלואורסצנטיות. הגדר את מספר הדגימות שנמדדו. הממדים של חלקות נקודות והאורך המרבי של ציר x ו- y עבור חלקות עמודות וחלקות תיבות.בחר את שיטת הדירוג על ידי הסרת hashtag מן השורות המתאימות. בחר בעצם flowSet המגודר בהתאם לשיטת gating שנבחרה וברזולוציית התוויית הנקודות, שצריכה להיות שווה לפחות ל- 256. בטל את הערות שתי הוראות הסינון כדי להסיר מדידות שבהן הפלואורסצנטיות שלילית ולהסיר חריגות עקב ניסויים אחרים כמתואר בכתב היד.לחץ על המקור והפעל את הסקריפט. כל הקבצים המכילים את תוצאות הניתוח נוצרים ב- dir_r. יעילות ההפעלה הטובה ביותר של dSpCas9-VP64 הושגה כאשר היו שישה אתרי יעד של lexOp במקדם הסינתטי.בעוד עבור dCas12a-VPR יעילות ההפעלה הגבוהה ביותר כאשר שלושה עותקים של lexOp הוכנסו לתוך המקדם הסינתטי. ההפעלה על ידי RNA קריספר ורנ"א מנחה יחיד הממוקם על פלסמיד אינטגרטיבי הייתה גבוהה פי 1.4 עד 2.4, ופי 1.1 עד 1.5 יותר מאשר כאשר הונחה על פלסמיד אפיזומלי. תוצאות RT-qPCR הראו כי וקטור אפיזומלי הפיק רמה גבוהה בהרבה של RNA קריספר מדריך יחיד מאשר וקטור אינטגרטיבי, ללא קשר למערכת הביטוי.יעילות ההפעלה של dSpCas9 מורכב RNA פיגומים גיוס MCP-VP64 נבדקה. RNA הפיגום שהכיל סוג פראי יחיד וסיכת ראש F6MS2 נתן הפעלה של פי 5.27 ופי 4.3 בהתאמה. עם זאת, השילוב של שתי סיכות הראש הביא לקיפול של 7.54 עם יעילות ההפעלה הגבוהה ביותר.ארבעה מקדמים שונים שימשו כדי להניע את הביטוי של שלושה סוגים של אנטי קריספר סוג 2, מה שמראה שהם עובדים באופן תלוי מינון. מקדם חזק הפחית את רמת הפלואורסצנטיות ל-0.21, 0.11 ו-0.13 מערכו בהתאמה. עקומת הטיטרציה מראה שהמעגל מתנהג כמו הילוך קשר עם יחס הפעלה לסירוגין שמתקרב ל-2.3.סוג חמש אנטי-קריספר A אחד מפחית את ביטוי הפלואורסצנטיות של denAS-Cas12a ו-dLB-Cas12a כמפעילים מ-19% ל-71%הקשר בין מפעילים ומדכאים נחקר כאשר Acr-VA הציג תנודות גדולות בביצועיו כאשר הופק על ידי pGAL1 תחת pTEF1 וגנטי CYC1t-pCYC1noTata מסוג חמש אנטי-CRISPR-A1 הראה דיכוי מסוים ב-dLB Cas12a החשוף בלבד. מכונת FACS היא שברירית, ולכן יש לטפל בה בזהירות. תמיסת התא לעולם לא צריכה להיות צפופה מדי והמכונה תישמר נקייה.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Electrical Engineering

Bioengineering

Unit 1

DC Circuit Analysis

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

רקמות מבוסס Agarose מחקה פאנטום אופטי עבור ' מאטום לשקוף ' ספקטרוסקופיה

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

גישה Microfluidic המבוססות על Droplet ו ננו-ספירה-PCR הגברה עבור חד גדילי DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

שיטות לVivo בדיקות ביומכנית על מקלעת ברכאל בחזירונים

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

האלקטרו-מערכות מבוססות-פלטפורמת מיקרופלואידיקה דיגיטלית עבור מערכת חיסונית אוטומטית מקושרת אנזימים

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

הנדסה אמינה ושליטה במעגלי גנים אופטוגנטיים יציבים בתאי יונקים

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...