Name: gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00
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हम सिंथेटिक जीवविज्ञान प्रयोगशाला-एसपीएसटी, टीजेयू-के सभी छात्रों को उनकी सामान्य मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही एफएसीएस प्रयोगों में उनकी सहायता के लिए झी ली और जियांगयांग झांग के साथ।

1. एसजीआरएनए / सीआरआरएनए अभिव्यक्ति कैसेट का डिजाइन और निर्माण
नोट: दो प्रकार के एसजीआरएनए / सीआरआरएनए अभिव्यक्ति कैसेट हैं: एक-नामित एसएनआर 5210-आरएनए पोलीमरेज़ III-निर्भर एसएनआर...

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प्रोटोकॉल ने "डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट-लर्न" (डीबीटीएल) जैविक इंजीनियरिंग चक्र और ड्राई-लैब और वेट-लैब प्रयोगों दोनों के संबंध में सिंथेटिक जीन डिजिटल सर्किट के लिए एक संभावित पूर्ण वर्कफ़्लो दिखाया। यहां, ?...

2011 में, शोधकर्ताओं ने एक कम्प्यूटेशनल विधि का प्रस्ताव दिया और डिजिटल सिंथेटिक जीन सर्किट1 के स्वचालित डिजाइन के लिए सॉफ्टवेयर का एक संबंधित टुकड़ा विकसित किया। एक उपयोगकर्ता को इनपुट (तीन या चार) की संख्या निर्दिष्ट करनी थी और सर्किट सत्य तालिका भरनी थी; इसने इलेक्ट्रॉनिक्स से तकनीकों का उपयोग करके सर्किट संरचना प्राप्त करने के लिए सभी आवश्यक जानकारी प्रदान की। सत्य तालिका का कर्णौघ मानचित्र विधि2 के माध्यम से दो बूलियन सूत्रों में अनुवाद किया गया था। प्रत्येक बूलियन सूत्र खंडों से बना होता है जो सर्किट इनपुट और उनके निषेधों (शाब्दिक) के बीच तर्क संचालन (योग या गुणन) का वर्णन करते हैं। सर्किट आउटपुट की गणना करने के लिए खंड, उनकी बारी में, या तो अभिव्यक्त (ओआर) या गुणा (एएनडी) होते हैं। प्रत्येक परिपथ को इसके दो संगत सूत्रों में से किसी एक के अनुसार महसूस किया जा सकता है: एक पीओएस (रकम का उत्पाद) रूप में लिखा गया है और दूसरा एसओपी (उत्पादों का योग) प्रतिनिधित्व में लिखा गया है। पूर्व में खंडों (यानी, बूलियन गेट) का गुणन होता है जिसमें शाब्दिक का तर्क योग होता है। उत्तरार्द्ध, इसके विपरीत, खंडों का एक योग है जहां शाब्दिक गुणा किए जाते हैं।
इलेक्ट्रिक सर्किट को ब्रेडबोर्ड पर, शारीरिक रूप से विभिन्न द्वारों को एक साथ वायर करके महसूस किया जा सकता है। विद्युत प्रवाह फाटकों के बीच संकेतों के आदान-प्रदान की अनुमति देता है, जिससे आउटपुट की गणना होती है।
जीव विज्ञान में, स्थिति अधिक जटिल है। एक बूलियन गेट को प्रतिलेखन इकाई (टीयू; यानी, यूकेरियोटिक कोशिकाओं के अंदर अनुक्रम "प्रमोटर-कोडिंग क्षेत्र-टर्मिनेटर" के रूप में महसूस किया जा सकता है, जहां प्रतिलेखन या अनुवाद (या दोनों) को विनियमित किया जाता है। इस प्रकार, कम से कम दो प्रकार के अणु एक जैविक वायरिंग स्थापित करते हैं: प्रतिलेखन कारक प्रोटीन और गैर-कोडिंग, एंटीसेंस आरएनए1।
एक जीन डिजिटल सर्किट को गेट की दो या तीन परतों में व्यवस्थित किया जाता है, अर्थात्: 1) इनपुट परत, जो हां (बफर) से बनी होती है और गेट नहीं होती है और इनपुट रसायनों को वायरिंग अणुओं में परिवर्तित करती है; 2) आंतरिक परत, जिसमें उतने ही टीयू होते हैं जितने कि संबंधित बूलियन सूत्र में खंड होते हैं। यदि सर्किट एसओपी सूत्र के अनुसार डिज़ाइन किया गया है, तो आंतरिक परत में प्रत्येक खंड तथाकथित वितरित आउटपुट आर्किटेक्चर में सर्किट आउटपुट (जैसे, प्रतिदीप्ति) का उत्पादन करेगा। यदि योग (पीओएस) सूत्र के उत्पाद का उपयोग किया जाता है, तो एक 3) अंतिम परत की आवश्यकता होती है, जिसमें आंतरिक परत से तारों के अणुओं को इकट्ठा करने वाला एक एकल गुणक द्वार होगा।
कुल मिलाकर, सिंथेटिक जीव विज्ञान में, एक ही सर्किट के लिए कई अलग-अलग योजनाएं तैयार की जा सकती हैं। वे टीयू और वायरिंग अणुओं दोनों की संख्या और प्रकार में भिन्न होते हैं। खमीर कोशिकाओं में लागू किए जाने वाले सबसे आसान समाधान को चुनने के लिए, प्रत्येक सर्किट डिज़ाइन एक जटिलता स्कोर एस के साथ जुड़ा हुआ है, जिसे
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;">
जहां ए सक्रियकर्ताओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, आर दमनकारियों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, और ए एंटीसेंस आरएनए अणुओं की मात्रा है। यदि या तो सक्रियकर्ता या दमनकारी सर्किट से अनुपस्थित हैं, तो एस में उनका योगदान शून्य है। इसलिए, प्रयोगशाला (उच्च एस) में एक सर्किट योजना का एहसास करना अधिक कठिन है जब इसे उच्च संख्या में ऑर्थोगोनल प्रतिलेखन कारकों की आवश्यकता होती है। इसका मतलब है कि डिजिटल सर्किट के अंदर पूर्ण तारों का एहसास करने के लिए नए सक्रियकर्ताओं और दमनकारियों को नए सिरे से इंजीनियर किया जाएगा। सिद्धांत रूप में, नोवेल डीएनए-बाइंडिंग प्रोटीन को जिंक फिंगर प्रोटीन3 और टीएएल प्रभावकों4 का उपयोग करके टेम्पलेट के रूप में इकट्ठा किया जा सकता है। हालांकि, यह विकल्प बहुत कठिन और समय लेने वाला प्रतीत होता है; इसलिए, जटिल जीन सर्किट को अंतिम रूप देने के लिए ज्यादातर छोटे आरएनए और अनुवाद विनियमन पर भरोसा करना चाहिए।
मूल रूप से, यह विधि बैक्टीरिया में डिजिटल सर्किट बनाने के लिए विकसित की गई थी। दरअसल, यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, एंटीसेंस आरएनए के बजाय, माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) या छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए) 5 के बारे में बात करना अधिक उपयुक्त है। हालांकि, आरएनएआई मार्ग खमीर एस सेरेविसिया में मौजूद नहीं है। इसलिए, किसी को पूरी तरह से ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क का विकल्प चुनना चाहिए। मान लीजिए कि एक सर्किट को पांच सक्रियकर्ताओं और पांच दमनकारियों की आवश्यकता होती है; इसका जटिलता स्कोर एस = 32 होगा। सर्किट जटिलता को 10 प्रतिलेखन कारकों को एक सक्रियण डोमेन (एडी) से जुड़े एकल डीसीएएस 96 (न्यूक्लियस की कमी वाले कैस 9) के साथ बदलकर कम किया जा सकता है। जैसा कि7 में दिखाया गया है, डीसीएएस 9-एडी टाटा बॉक्स और टीएसएस (ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट) के बीच प्रमोटर को बांधते समय खमीर में एक दमनकारी के रूप में काम करता है और टाटा बॉक्स के ऊपर अच्छी तरह से बांधने पर एक उत्प्रेरक के रूप में काम करता है। इस प्रकार, एस = 11 के कुल जटिलता स्कोर के लिए 10 प्रतिलेखन कारकों को एकल डीसीएएस 9-एडी संलयन प्रोटीन और 10 एसजीआरएनए (एकल गाइड आरएनए) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। दस एसजीआरएनए को संश्लेषित करना त्वरित और आसान है, जबकि, जैसा कि पहले टिप्पणी की गई थी, 10 प्रोटीन ों की असेंबली बहुत लंबे और अधिक जटिल काम की मांग करेगी।
वैकल्पिक रूप से, कोई दो ऑर्थोगोनल डीसीएएस प्रोटीन (जैसे, डीसीएएस 9 और डीसीएएस 12 ए) का उपयोग कर सकता है: एक एडी में फ्यूज करने के लिए, और दूसरा नंगे या दमन डोमेन के साथ संयोजन में। जटिलता स्कोर केवल एक इकाई (एस = 12) से बढ़ेगा। इसलिए, CRISPR-dCas सिस्टम S. Cerevisiae में बहुत जटिल जीन डिजिटल सर्किट के निर्माण की कुंजी हैं।
यह पेपर खमीर में dCas9- और dCas12a-आधारित रिप्रेसर्स और एक्टिवेटर्स दोनों की दक्षता को गहराई से दर्शाता है। परिणाम बताते हैं कि वे अपनी गतिविधि को अनुकूलित करने के लिए एसजीआरएनए की उच्च मात्रा की मांग नहीं करते हैं, इसलिए एपिसोमल प्लास्मिड को अधिमानतः टाला जाता है। इसके अलावा, डीसीएएस 9-आधारित सक्रियकर्ता एक मचान आरएनए (एससीआरएनए) का उपयोग करते समय कहीं अधिक प्रभावी होते हैं जो वीपी 64 एडी की प्रतियां भर्ती करता है। इसके विपरीत, मजबूत वीपीआर एडी से सीधे जुड़े होने पर डीसीएएस 12 ए अच्छी तरह से काम करता है। इसके अलावा, एक सिंथेटिक सक्रिय प्रमोटर एक्टिवेटर के कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर लक्ष्य साइटों की एक चर संख्या की मांग करता है (उदाहरण के लिए, डीसीएएस 12 ए-वीपीआर का उपयोग करते समय तीन, डीसीएएस 9-वीपी 64 के लिए छह, और डीसीएएस 9 और एससीआरएनए के साथ केवल एक)। एक दमनकारी के रूप में, प्रमोटर के बजाय कोडिंग क्षेत्र को बांधते समय डीसीएएस 12 ए अधिक तीक्ष्ण दिखाई देता है।
एक दोष के रूप में, हालांकि, CRISPR-dCas9 / dCas12a सीधे रसायनों के साथ बातचीत नहीं करते हैं। इसलिए, इनपुट परत में उनका कोई उपयोग नहीं हो सकता है। इस कारण से, एंटी-सीआरआईएसपीआर प्रोटीन (एसीआर) युक्त वैकल्पिक बूलियन गेट डिजाइनों की जांच की गई है। एसीआरएस (डी) सीएएस प्रोटीन पर कार्य करते हैं औरउनके काम को रोकते हैं। इसलिए, वे CRISPR-(d) CAS सिस्टम की गतिविधि को संशोधित करने का एक साधन हैं। यह पेपर टाइप II Acrs और (d) Cas9 के बीच बातचीत का पूरी तरह से विश्लेषण करता है, साथ ही साथ टाइप V Acrs और (d) Cas12a में S. cerevisiae में। चूंकि एसीआरएस सीएएस प्रोटीन की तुलना में बहुत छोटे होते हैं, इसलिए एस्ट्रोजेन β-एस्ट्राडियोल के प्रति उत्तरदायी एक नॉट गेट मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर 9-एचबीडी (एचईआर) -से एसीआरआईआईए 4 के हार्मोन-बाइंडिंग डोमेन को फ्यूज करके बनाया गया था। इसके अलावा, गैलेक्टोज के साथ प्रेरण पर डीसीएएस 12 ए (-एडी) और एसीआरवीए को संवैधानिक रूप से व्यक्त करने वाले मुट्ठी भर हां और नॉट गेट्स महसूस किए गए थे। वर्तमान में, ये द्वार केवल अवधारणा के प्रमाण के रूप में कार्य करते हैं। हालांकि, वे खमीर कोशिकाओं में सिंथेटिक जीन डिजिटल सर्किट के कम्प्यूटेशनल स्वचालित डिजाइन को पूरा करने के लिए एल्गोरिदम के गहरे पुनर्विचार की दिशा में पहले कदम का भी प्रतिनिधित्व करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mL PCR 8-strip tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>403112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose-molecular biology grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>75510-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA gel extraction kit</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-GX-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSuite CS&#38;T research beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>650621</td>
			<td>Fluorescent beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSVerse flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall ST 16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli competent cells (Strain DH5&#945;)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18263-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL select Western Blotting detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd</td>
			<td>JY300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat 8-strip caps</td>
			<td>NEST</td>
			<td>406012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene synthesis company</td>
			<td>Azenta Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiFiScript cDNA synthesis kit</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2569M</td>
			<td>Kit used in step 6.2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysate solution (Zymolyase)</td>
			<td>zymoresearch</td>
			<td>E1004-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;10 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;1000 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;200 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII403</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII404</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII405</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII406</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII424</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTPGI_dSpCas9_VP64&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-fidelity DNApolymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-Acc65I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-SacI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 96&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td>Real-Time PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae CEN.PK2-1C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; 
			MAL2-8c; SUC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem-Loop Kit</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>AG0502</td>
			<td>Kit used in step 6.2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>186-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 Exonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR820Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YeaStar RNA kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins

सिंथेटिक जीन बूलियन गेट्स और डिजिटल सर्किट में चिकित्सा निदान से लेकर पर्यावरण देखभाल तक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है। CRISPR-Cas सिस्टम और उनके प्राकृतिक अवरोधकों की खोज - एंटी-CRISPR प्रोटीन (Acrs) - विवो जीन डिजिटल सर्किट में डिजाइन और कार्यान्वित करने के लिए एक नया उपकरण प्रदान करता है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो "डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट-लर्न" जैविक इंजीनियरिंग चक्र के विचार का पालन करता है और छोटे ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क स्थापित करने के लिए उनके संबंधित एसीआर के साथ मिलकर डीसीएएस 9 / डीसीएएस 12 ए का उपयोग करता है, जिनमें से कुछ बुलियन गेट्स की तरह व्यवहार करते हैं। ये परिणाम प्रतिलेखन कारकों के रूप में dCas9 / dCas12a के गुणों को इंगित करते हैं। विशेष रूप से, जीन अभिव्यक्ति के अधिकतम सक्रियण को प्राप्त करने के लिए, dSpCas9 को एक इंजीनियर मचान आरएनए के साथ बातचीत करने की आवश्यकता होती है जो VP64 सक्रियण डोमेन (AD) की कई प्रतियां एकत्र करता है। इसके विपरीत, डीसीएएस 12 ए को सी टर्मिनस पर, मजबूत वीपी 64-पी 65-आरटीए (वीपीआर) एडी के साथ जोड़ा जाएगा। इसके अलावा, सेल में एसजीआरएनए / सीआरआरएनए की मात्रा में वृद्धि करके दोनों कैस प्रोटीन की गतिविधि को बढ़ाया नहीं जाता है। यह लेख यह भी बताता है कि CRISPR-dCas-Acr इंटरैक्शन के आधार पर बूलियन गेट कैसे बनाएं। मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर का एसीआरआईआईए 4 फ्यूज्ड हार्मोन-बाइंडिंग डोमेन β-एस्ट्राडियोल के प्रति उत्तरदायी नॉट गेट का मूल है, जबकि इंड्यूसेबल जीएएल 1 प्रमोटर द्वारा संश्लेषित एसीआरवीए एक इनपुट के रूप में गैलेक्टोज के साथ यस और नॉट गेट्स दोनों की नकल करने की अनुमति देता है। बाद के सर्किट में, AcrVA5, dLbCas12a के साथ, सबसे अच्छा तर्क व्यवहार दिखाया।

आरएनए पोलीमरेज़ III-प्रकार प्रमोटर द्वारा एसजीआरएनए / सीआरआरएनए अभिव्यक्ति सबसे पहले, इस काम ने चित्रा 1 ए में दिखाए गए ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण सर्किट (सर्किट 1) की इंजीनियरिंग को संबो...

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Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

CRISPR-CAS सिस्टम और एंटी-CRISPR प्रोटीन को Saccharomyces cerevisiae में बूलियन गेट्स की योजना में एकीकृत किया गया था। नए छोटे तर्क सर्किट ने अच्छा प्रदर्शन दिखाया और डीसीएएस 9 / डीसीएएस 12 ए-आधारित प्रतिलेखन कारकों और एंटी-सीआरआईएसपीआर प्रोटीन के गुणों दोनों की समझ को गहरा कर दिया।

CRISPR-CAS सिस्टम और एंटी-CRISPR प्रोटीन पर आधारित जीन डिजिटल सर्किट

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

हमारा प्रोटोकॉल बताता है कि खमीर जीन डिजिटल सर्किट को कैसे डिजाइन, निर्माण और विश्लेषण किया जाए जो टाइप 2 और टाइप 5 सीआरआईएसपीआर डीसीएएस सिस्टम और संबंधित एंटी-सीआरआईएसपीआर प्रोटीन का उपयोग करते हैं। यह असेंबली स्टे है क्योंकि यह सेवाओं में सिंथेटिक ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क को इकट्ठा करने और परीक्षण करने के लिए शून्य मानक प्रक्रियाओं को इकट्ठा करता है। शुरू करने के लिए, एक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें जिसमें 20 से 40 नैनोग्राम डीएनए टेम्पलेट, एक माइक्रोलीटर फॉरवर्ड प्राइमर, एक माइक्रोलीटर रिवर्स प्राइमर, पांच माइक्रोलीटर डीएनटीपी मिश्रण, 0.5 माइक्रोलीटर डीएनए पोलीमरेज़, 10 माइक्रोलीटर 5एक्स डीएनए पोलीमरेज़ रिएक्शन बफर, और 50 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा तक डबल डिस्टिल्ड पानी शामिल है।पांडुलिपि में वर्णित थर्मोसाइकलर पर टचडाउन पीसीआर प्रोग्राम का उपयोग करके डीएनए अनुक्रमों को बढ़ाएं। जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से पीसीआर उत्पादों को अलग करें और डीएनए जेल निष्कर्षण किट के माध्यम से अगारोस जेल से डीएनए अनुक्रमों को पतला करें। गिब्सन असेंबली विधि का उपयोग करके, शुद्ध पीसीआर उत्पादों को कट-ओपन शटल वेक्टर में डालें, जिससे एक घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर इक्विमोलर डीएनए मिश्रण में प्रवेश किया जा सके।टचडाउन पीसीआर और गिब्सन असेंबली विधि के माध्यम से डीसीएएस 12 ए स्वीकारकर्ता वेक्टर का निर्माण करें जैसा कि पहले दिखाया गया है। खमीर कोडन अनुकूलित डीसीएएस 12 ए प्रोटीन को बीएएमएच 1 और एक्सहोल 1 के साथ पाचन के माध्यम से दो नव निर्मित स्वीकर्ता वैक्टर में डालें और टी 4 डीएनए लिगेज के साथ बंधाव करें। इसी तरह, टचडाउन पीसीआर और गिब्सन असेंबली विधि के माध्यम से एंटी-सीआरआईएसपीआर प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए पीआरएस 2403 शटल वेक्टर के आधार पर प्लास्मिड का निर्माण करें।माइक्रोस्कोपी सेल डिटेक्शन करने के लिए, सेल समाधान के दो माइक्रोलीटर को ग्लास स्लाइड पर रखें और इसे कवर स्लिप के साथ कवर करें। फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत, माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर को चालू करके प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। फ्लोरोसेंट लाइट सोर्स नंबर लिखने के बाद, कंप्यूटर पर माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें।माइक्रोस्कोप स्टेज पर स्लाइड रखें और हरी रोशनी के नीचे कोशिकाओं का अवलोकन करते हुए 40x ऑब्जेक्टिव लेंस चुनें। कोर्स फोकस नॉब को तब तक हिलाएं जब तक कि खमीर कोशिकाओं की समोच्च दिखाई न दे और कोशिकाओं को केंद्रित करने के लिए ठीक फोकस नॉब हो। कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, माइक्रोस्कोप फ़ील्ड ऑफ व्यू को बंद करने के बाद कंप्यूटर स्क्रीन पर स्विच करें और लाइव पर क्लिक करें।तीन से पांच सेकंड तक प्रतीक्षा करें। चित्र लेने और चित्र सहेजने के लिए कैप्चर पर क्लिक करें. इसके बाद, कंप्यूटर, माइक्रोस्कोप और फ्लोरोसेंट लाइट स्रोत को बंद करें।लेजर को गर्म करने के लिए माप से 20 मिनट पहले एफएसीएस मशीन पर स्विच करें और 300 माइक्रोलीटर डबल आसुत पानी के साथ सेल कल्चर के 20 माइक्रोलीटर मिलाएं। FACS मशीन से कनेक्ट कंप्यूटर पर FACS सॉफ़्टवेयर चलाएँ और एक नया प्रयोग बनाएँ। फिर माप पैरामीटर सेट करें।इसके बाद, नमूने के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के अनुसार फ़िल्टर का चयन करें और अधिग्रहण सेल नंबर को 10,000 पर सेट करें। फ्लोरोसेंट मोतियों की तीव्रता को मापकर एफआईटीसी फिल्टर वोल्टेज को समायोजित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि दो लगातार प्रयोगों के बीच मोतियों की तीव्रता में सापेक्ष अंतर 5% से अधिक नहीं है, किसी भी संभावित अतिरिक्त मोतियों को हटाने के लिए मशीन को कुछ सेकंड के लिए डबल आसुत पानी से धोएं। नमूना प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें और नमूना इंजेक्शन स्थिरता के लिए तीन से पांच सेकंड तक प्रतीक्षा करते हुए पूर्वावलोकन पर क्लिक करें।अंत में अधिग्रहण पर क्लिक करें। प्रयोग के अंत में मोतियों को फिर से मापें। यह जांचने के बाद कि क्या दो मोतियों के माप के बीच सापेक्ष अंतर 5% से अधिक है, एफएसीएस डेटा को एफसीएस फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें।आर स्टूडियो खोलें और स्क्रिप्ट BDverse_analysis लोड करें। एफसीएस फाइलों का विश्लेषण करने के लिए आर। प्रयोग नाम को ename के रूप में सेट करें, निर्देशिका पथ जहां FCS फ़ाइलें dir_d के रूप में संग्रहीत होती हैं और परिणाम फ़ाइलें dir_r के रूप में बनाई जाएंगी।इसके बाद, प्रतिदीप्ति चैनल सेट करें। मापे गए नमूनों की संख्या सेट करें. डॉट प्लॉट के आयाम और बार प्लॉट और बॉक्स प्लॉट के लिए एक्स और वाई अक्ष की अधिकतम लंबाई।संबंधित पंक्तियों से हैशटैग को हटाकर ग्रेडिंग विधि चुनें। चुनी हुई गेटिंग विधि और डॉट प्लॉट रिज़ॉल्यूशन के अनुरूप फ़्लोसेट ऑब्जेक्ट गेटेड का चयन करें, जो कम से कम 256 के बराबर होना चाहिए। उन मापों को हटाने के लिए दो फ़िल्टरिंग निर्देशों को अनकमेंट करें जहां प्रतिदीप्ति नकारात्मक है और पांडुलिपि में वर्णित अन्य प्रयोगों के कारण आउटलायर्स को हटाने के लिए।स्रोत दबाएँ और स्क्रिप्ट चलाएँ। विश्लेषण से परिणामों वाली सभी फाइलें dir_r में बनाई जाती हैं। DSPcas9-VP64 की सबसे अच्छी सक्रियण दक्षता तब हासिल की गई थी जब सिंथेटिक प्रमोटर पर छह लेक्सऑप लक्ष्य साइटें थीं।जबकि डीसीएएस 12 ए-वीपीआर के लिए उच्चतम सक्रियण दक्षता जब लेक्सॉप की तीन प्रतियां सिंथेटिक प्रमोटर में डाली गई थीं। एक एकीकृत प्लास्मिड पर स्थित सीआरआईएसपीआर आरएनए और सिंगल गाइड आरएनए द्वारा सक्रियण 1.4 से 2.4 था, और एपिसोमल प्लास्मिड पर रखे जाने की तुलना में 1.1 से 1.5 गुना अधिक था। आरटी-क्यूपीसीआर परिणामों से पता चला है कि एक एपिसोमल वेक्टर ने अभिव्यक्ति प्रणाली के बावजूद एकीकृत वेक्टर की तुलना में एकल गाइड आरएनए सीआरआईएसपीआर आरएनए का बहुत अधिक स्तर उत्पन्न किया।एमसीपी-वीपी 64 की भर्ती करने वाले जटिल डीएसपीसीएएस 9 और पाड़ आरएनए भर्ती की सक्रियण दक्षता का परीक्षण किया गया था। एक जंगली प्रकार और एफ 6 एमएस 2 हेयरपिन युक्त पाड़ आरएनए ने क्रमशः 5.27 और 4.3 गुना सक्रियण दिया। हालांकि, दो हेयरपिन के संयोजन के परिणामस्वरूप उच्चतम सक्रियण दक्षता के साथ 7.54 गुना हो गया।चार अलग-अलग प्रमोटरों का उपयोग तीन प्रकार के टाइप 2 एंटी सीआरआईएसपीआर की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए किया गया था, यह दिखाते हुए कि वे खुराक पर निर्भर तरीके से काम करते हैं। एक मजबूत प्रमोटर ने प्रतिदीप्ति स्तर को क्रमशः 0.21, 0.11 और 0.13 तक कम कर दिया। अनुमापन वक्र से पता चलता है कि सर्किट एक गाँठ चाल की तरह व्यवहार करता है जिसमें ऑन-टू-ऑफ अनुपात 2.3 तक पहुंचता है।टाइप पांच एंटी-सीआरआईएसपीआर ए एक सक्रियकर्ता के रूप में डेनएएस-कैस 12 ए और डीएलबी-कैस 12 ए दोनों की प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति को 19% से 71% तक कम कर देता है, सक्रियकर्ताओं और दमनकारियों के बीच संबंध का अध्ययन किया गया था जहां एसीआर-वीए ने पीटीईएफ 1 के तहत पीजीएएल 1 द्वारा उत्पादित होने पर अपने प्रदर्शन में बड़े उतार-चढ़ाव प्रदर्शित किए और आनुवंशिक सीवाईसी 1 टी-पीसीवाईसी 1 नोटाटा टाइप पांच एंटी-सीआरआईएसपीआर-ए 1 ने केवल डीएलबी पर कुछ दमन दिखाया। एफएसीएस मशीन कमजोर है, इसलिए इसे सावधानी से संभाला जाना चाहिए। सेल समाधान कभी भी बहुत घना नहीं होना चाहिए और मशीन को साफ रखा जाना चाहिए।

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Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

ट्यूमर सेल आक्रमण पर बीचवाला द्रव प्रवाह के प्रभाव को मापने के लिए तीन आयामी सेल संस्कृति मॉडल

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

AFM आधारित एकल अणु शक्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ Cellulosome के रिसेप्टर ligand सिस्टम की जांच कर

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Hydrogel पर जैव सक्रिय प्रोटीन या पेप्टाइड्स पैटर्न जैविक अनुप्रयोगों के लिए Photochemistry का उपयोग

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

Agarose आधारित फैलाना चिंतनशील स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए ऑप्टिकल प्रेतों नकल उतार ऊतक

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

एक छोटी बूंद आधारित Microfluidic दृष्टिकोण और Microsphere-एकल असहाय डीएनए के लिए पीसीआर प्रवर्धन Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

लंबे समय तक सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के संचालन के लिए एक बहुपरत Microfluidic मंच

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

नवजात पिलेट्स में ब्रैकियल प्लेक्सस पर वीवो बायोमैकेनिकल परीक्षण में विधियां

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

स्वचालित एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख के लिए इलेक्ट्रोवेटिंग-आधारित डिजिटल माइक्रोफ्लूइडिक्स प्लेटफॉर्म

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

मज़बूती से इंजीनियरिंग और स्तनधारी कोशिकाओं में स्थिर ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट को नियंत्रित करना

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Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन के साथ एक्टिन-आधारित गतिशीलता का पुनर्गठन

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...