Name: gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins at JoVE.com

Vi ønsker å takke alle studentene i Synthetic Biology lab-SPST, TJU-for deres generelle hjelp, sammen med Zhi Li og Xiangyang Zhang for deres hjelp i FACS-eksperimenter.

1. Design og konstruksjon av sgRNA / crRNA uttrykkskassett
MERK: Det finnes to typer sgRNA / crRNA-ekspresjonskasetter: en-kalt SNR5210-er sammensatt av RNA-polymerase III-avhengig SNR52-promotor, sgRNA / crRNA-sekvensen og SUP4-terminatoren; en annen forkortet RGR 11 består av RNA-polymerase II-avhengig ADH1-promotor, RGR-strukturen (ribozyme-guide RNA-ribozyme) som inneholder to ribozymer (et hammerhode ribozyme-HH og et hepatitt delt...

<ol>
	<li>Marchisio, M. A., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+design+of+digital+synthetic+gene+circuits.">Automatic design of digital synthetic gene circuits.</a> PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083 (2011).</li><li>Karnaugh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+map+method+for+synthesis+of+combinational+logic+circuits.">The map method for synthesis of combinational logic circuits.</a> Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).</li><li>Mandell, J. G., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+finger+tools:+custom+DNA-binding+domains+for+transcription+factors+and+nucleases.">Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases.</a> Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).</li><li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+effectors:+customizable+proteins+for+DNA+targeting.">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li><li>Drinnenberg, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+budding+yeast.">RNAi in budding yeast.</a> Science. 326 (5952), 544-550 (2009).</li><li>Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+logic+circuits+in+yeast+with+CRISPR-dCas9+NOR+gates.">Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates.</a> Nature Communications. 8, 15459 (2017).</li><li>Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+and+multifunctional+eukaryotic+transcription+factors+based+on+CRISPR/Cas.">Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas.</a> ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).</li><li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-mediated+control+of+gene+editing+and+synthetic+circuits+in+eukaryotic+cells.">Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 194 (2019).</li><li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast.">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131 (1), 129-134 (1993).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gao, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-processing+of+ribozyme-flanked+RNAs+into+guide+RNAs+in+vitro+and+in+vivo+for+CRISPR-mediated+genome+editing.">Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Yu, L., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+synthetic+transcriptional+networks+harnessing+dCas12a+and+Type+V-A+anti-CRISPR+proteins.">Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).</li><li>Zhang, Y., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bare+dSpCas9,+scaffold+gRNA,+and+type+II+anti-CRISPR+proteins+highly+favors+the+control+of+gene+expression+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).</li><li>Sheff, M. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cassettes+for+fluorescent+protein+tagging+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).</li><li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRdirect:+software+for+designing+CRISPR/Cas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites.">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li><li>Chee, M. K., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+redesigned+pRS+plasmid+shuttle+vectors+for+genetic+manipulation+of+Saccharomyces+cerevisiae.">New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides.">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. Fourth edition. , (2012).</li><li>Sanger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+nucleotide+sequences+in+DNA.">Determination of nucleotide sequences in DNA.</a> Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Zalatan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+complex+synthetic+transcriptional+programs+with+CRISPR+RNA+scaffolds.">Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds.</a> Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).</li><li>Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+terminators+be+used+as+insulators+into+yeast+synthetic+gene+circuits.">Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits.</a> Journal of Biological Engineering. 10, 19 (2016).</li><li>Rauch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CRISPR-Cas9+with+bacteriophage+proteins.">Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins.</a> Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).</li><li>Hynes, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+from+a+virulent+streptococcal+phage+inhibits+Streptococcus+pyogenes+Cas9.">An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9.</a> Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).</li><li>Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+natural+CRISPR-Cas12a+inhibitors.">Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors.</a> Science. 362 (6411), 236-239 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).</li><li>Hahne, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flowCore:+a+Bioconductor+package+for+high+throughput+flow+cytometry.">flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 106 (2009).</li><li>Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-based+biosensors+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae.</a> Journal of Biological Engineering. 12, 11 (2018).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+protein+disables+type+V+Cas12a+by+acetylation.">An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).</li></ol>

Protokollen viste en mulig komplett arbeidsflyt for syntetiske gen-digitale kretser, etter "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) biologisk ingeniørsyklus og om både tørrlaboratorie- og våtlaboratorieeksperimenter. Her fokuserte vi på CRISPR-Cas-systemet, hovedsakelig dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a og de tilsvarende anti-CRISPR-proteinene, ved å designe og bygge i S. cerevisiae små transkripsjonsnettverk. Noen av dem etterlignet boolske porter, som er de grunnleggende komponentene i digitale kretser. Alle kret...

I 2011 foreslo forskere en beregningsmetode og utviklet et tilsvarende stykke programvare for automatisk utforming av digitale syntetiske genkretser1. En bruker måtte spesifisere antall innganger (tre eller fire) og fylle ut kretsens sannhetstabell; Dette ga all nødvendig informasjon for å utlede kretsstrukturen ved hjelp av teknikker fra elektronikk. Sannhetstabellen ble oversatt til to boolske formler via Karnaugh-kartmetoden2. Hver boolske formel er laget av klausuler som beskriver logiske operasjoner (sum eller multiplikasjon) blant (en del av) kretsinngangene og deres negasjoner (bokstavene). Klausuler blir i sin tur enten summert (OR) eller multiplisert (OG) for å beregne kretsutgangen. Hver krets kan realiseres i henhold til hvilken som helst av de to tilsvarende formlene: en skrevet i POS (produkt av summer) form og den andre i SOP (summen av produkter) representasjon. Den førstnevnte består av en multiplikasjon av setninger (dvs. boolske porter) som inneholder en logisk sum av bokstavene. Sistnevnte er derimot en sum av klausuler der bokstavene multipliseres.
Elektriske kretser kan realiseres, på et brødbrett, ved fysisk å koble forskjellige porter sammen. Den elektriske strømmen tillater utveksling av signaler mellom porter, noe som fører til beregning av utgangen.
I biologien er situasjonen mer kompleks. En boolsk port kan realiseres som en transkripsjonsenhet (TU; dvs. sekvensen "promoter-coding region-terminator" inne i eukaryote celler), hvor transkripsjon eller oversettelse (eller begge deler) er regulert. Dermed etablerer minst to typer molekyler en biologisk ledning: transkripsjonsfaktorproteinene og de ikke-kodende, antisense-RNAene1.
En gen digital krets er organisert i to eller tre lag med porter, nemlig: 1) inngangslaget, som er laget av JA (buffer) og IKKE porter og konverterer inngangskjemikaliene til ledningsmolekyler; 2) det indre laget, som består av like mange TUer som det er klausuler i den tilsvarende boolske formelen. Hvis kretsen er utformet i henhold til SOP-formelen, vil hver klausul i det indre laget produsere kretsutgangen (f.eks. fluorescens) i en såkalt distribuert utgangsarkitektur. Hvis formelen for sum (POS) brukes, kreves et 3) endelig lag, som vil inneholde en enkelt multiplikativ port som samler ledningsmolekylene fra det indre laget.
Samlet sett, i syntetisk biologi, kan mange forskjellige ordninger utformes for samme krets. De varierer i antall og type både TU og ledningsmolekyler. For å velge den enkleste løsningen som skal implementeres i gjærceller, er hver kretsdesign knyttet til en kompleksitetsscore S, definert som
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;">
hvor A representerer antall aktivatorer, R representerer antall repressorer, og a er mengden antisense RNA-molekyler. Hvis enten aktivatorer eller repressorer er fraværende fra kretsen, er deres bidrag til S null. Derfor er det vanskeligere å realisere et kretsskjema i laboratoriet (høy S) når det krever et høyt antall ortogonale transkripsjonsfaktorer. Dette betyr at nye aktivatorer og repressorer skal konstrueres for å realisere hele ledningene inne i de digitale kretsene. I prinsippet kan nye DNA-bindende proteiner settes sammen ved å bruke Zinc Finger proteiner3 og TAL effektorer4 som maler. Dette alternativet virker imidlertid for vanskelig og tidkrevende; Derfor bør man stole mest på små RNA og oversettelsesregulering for å fullføre komplekse genkretser.
Opprinnelig ble denne metoden utviklet for å fremstille digitale kretser i bakterier. Faktisk, i eukaryote celler, i stedet for antisense-RNAer, er det mer egnet til å snakke om mikroRNA (miRNA) eller små forstyrrende RNA (siRNAer)5. Imidlertid er RNAi-banen ikke tilstede i gjæren S. cerevisiae. Derfor bør man velge fullt transkripsjonsnettverk. Anta at en krets trenger fem aktivatorer og fem repressorer; dens kompleksitetspoeng vil være S = 32. Kretskompleksiteten kan reduseres ved å erstatte de 10 transkripsjonsfaktorene med en enkelt dCas96 (nukleasemangelfull Cas9) smeltet til et aktiveringsdomene (AD). Som vist i7, fungerer dCas9-AD som en repressor i gjær når du binder en promotor mellom TATA-boksen og TSS (transkripsjonsstartstedet) og som en aktivator når den binder godt oppstrøms for TATA-boksen. Dermed kan man erstatte 10 transkripsjonsfaktorer med et enkelt dCas9-AD-fusjonsprotein og 10 sgRNA (single guide RNAs) for en total kompleksitetsscore på S = 11. Det er raskt og enkelt å syntetisere ti sgRNAer, mens, som tidligere kommentert, vil samlingen av 10 proteiner kreve mye lengre og mer komplisert arbeid.
Alternativt kan man bruke to ortogonale dCas-proteiner (f.eks. dCas9 og dCas12a): en for å smelte sammen til en AD, og den andre naken eller i kombinasjon med et undertrykkelsesdomene. Kompleksitetsskåren vil øke med bare én enhet (S = 12). Derfor er CRISPR-dCas-systemer nøkkelen til konstruksjonen av svært intrikate gendigitale kretser i S. cerevisiae.
Dette papiret karakteriserer dypt effektiviteten til både dCas9- og dCas12a-baserte repressorer og aktivatorer i gjær. Resultatene viser at de ikke krever en høy mengde sgRNA for å optimalisere aktiviteten, så episomale plasmider unngås fortrinnsvis. Videre er dCas9-baserte aktivatorer langt mer effektive når de bruker et stillas RNA (scRNA) som rekrutterer kopier av VP64 AD. I motsetning til dette fungerer dCas12a godt når den smeltes direkte til den sterke VPR AD. Videre krever en syntetisk aktivert promotor et variabelt antall målsteder, avhengig av konfigurasjonen av aktivatoren (f.eks. tre ved bruk av dCas12a-VPR, seks for dCas9-VP64, og bare en med dCas9 og et scRNA). Som en repressor virker dCas12a mer skarp når den binder kodeområdet i stedet for promotoren.
Som en ulempe interagerer imidlertid ikke CRISPR-dCas9 / dCas12a direkte med kjemikalier. Derfor kan de være til ingen nytte i inndatalaget. Av denne grunn har alternative boolske portdesign som inneholder anti-CRISPR-proteiner (Acrs) blitt undersøkt. ACR virker på (d) Cas-proteiner og hemmer deres arbeid8. Derfor er de et middel til å modulere aktiviteten til CRISPR-(d) Cas-systemer. Denne artikkelen analyserer grundig interaksjonene mellom type II Acrs og (d) Cas9, samt type V Acrs og (d) Cas12a i S. cerevisiae. Siden Acrs er mye mindre enn Cas-proteiner, ble en NOT-port som reagerer på østrogen β-østradiol bygget ved å fusjonere det hormonbindende domenet til den humane østrogenreseptoren 9-HBD (hER) - til AcrIIA4. Dessuten ble en håndfull YES- og NOT-porter som uttrykte dCas12a(-AD) konstitutivt og AcrVA ved induksjon med galaktose realisert. For tiden tjener disse portene bare som et bevis på konsept. Imidlertid representerer de også det første skrittet mot en dyp nytenkning av algoritmen for å utføre den beregningsmessige automatiske utformingen av syntetiske gen-digitale kretser i gjærceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mL PCR 8-strip tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>403112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose-molecular biology grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>75510-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA gel extraction kit</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-GX-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSuite CS&#38;T research beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>650621</td>
			<td>Fluorescent beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSVerse flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall ST 16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli competent cells (Strain DH5&#945;)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18263-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL select Western Blotting detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd</td>
			<td>JY300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat 8-strip caps</td>
			<td>NEST</td>
			<td>406012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene synthesis company</td>
			<td>Azenta Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiFiScript cDNA synthesis kit</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2569M</td>
			<td>Kit used in step 6.2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysate solution (Zymolyase)</td>
			<td>zymoresearch</td>
			<td>E1004-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;10 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;1000 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;200 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII403</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII404</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII405</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII406</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII424</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTPGI_dSpCas9_VP64&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-fidelity DNApolymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-Acc65I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-SacI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 96&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td>Real-Time PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae CEN.PK2-1C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; 
			MAL2-8c; SUC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem-Loop Kit</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>AG0502</td>
			<td>Kit used in step 6.2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>186-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 Exonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR820Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YeaStar RNA kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins

Syntetisk gen Boolske porter og digitale kretser har et bredt spekter av applikasjoner, fra medisinsk diagnostikk til miljøvern. Oppdagelsen av CRISPR-Cas-systemene og deres naturlige hemmere - anti-CRISPR-proteinene (Acrs) - gir et nytt verktøy for å designe og implementere in vivo gen digitale kretser. Her beskriver vi en protokoll som følger ideen om "Design-Build-Test-Learn" biologisk ingeniørsyklus og bruker dCas9 / dCas12a sammen med deres tilsvarende Acrs for å etablere små transkripsjonsnettverk, hvorav noen oppfører seg som boolske porter, i Saccharomyces cerevisiae. Disse resultatene peker på egenskapene til dCas9/dCas12a som transkripsjonsfaktorer. Spesielt for å oppnå maksimal aktivering av genuttrykk, må dSpCas9 samhandle med et konstruert stillas-RNA som samler flere kopier av VP64-aktiveringsdomenet (AD). I motsetning til dette skal dCas12a smeltes, på C-terminalen, med den sterke VP64-p65-Rta (VPR) AD. Videre forsterkes ikke aktiviteten til begge Cas-proteinene ved å øke mengden sgRNA / crRNA i cellen. Denne artikkelen forklarer også hvordan du bygger boolske porter basert på CRISPR-dCas-ACR-interaksjonen. Det AcrIIA4-smeltede hormonbindende domenet til den humane østrogenreseptoren er kjernen i en NOT-port som reagerer på β-østradiol, mens AcrVAs syntetisert av den induserbare GAL1-promotoren tillater å etterligne både YES- og NOT-porter med galaktose som inngang. I sistnevnte kretser viste AcrVA5, sammen med dLbCas12a, den beste logiske oppførselen.

sgRNA / crRNA-ekspresjon av en RNA-polymerase III-type promotor Først adresserte dette arbeidet prosjekteringen av transkripsjonsaktiveringskretsen (krets 1) vist i figur 1A. Den inneholdt tre grunnleggende komponenter: 1) genet som koder for yEGFP (reporteren), som ble innledet av en serie forskjellige syntetiske promotorer som ga målsteder for dCas9 / dCas12a-AD; 2) en gjærkodonoptimalisert versjon av dCas9 eller dCas12a smeltet sammen til et aktiveringsdomene (henho...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins at JoVE.com

Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

CRISPR-Cas-systemer og anti-CRISPR-proteiner ble integrert i skjemaet til boolske porter i Saccharomyces cerevisiae. De nye små logiske kretsene viste god ytelse og utdypet forståelsen av både dCas9/dCas12a-baserte transkripsjonsfaktorer og egenskapene til anti-CRISPR-proteiner.

Digitale genkretser basert på CRISPR-Cas-systemer og anti-CRISPR-proteiner

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

Vår protokoll forklarer hvordan man designer, bygger og analyserer gjærgenets digitale kretser som bruker type to og type fem CRISPR dCas-systemer og de tilsvarende anti-CRISPR-proteinene. Det er montering opphold fordi den samler null standard prosedyrer for å sette sammen og teste syntetiske transkripsjonsnettverk i tjenester. For å begynne å lage en reaksjonsblanding som inneholder 20 til 40 nanogram DNA-mal, en mikroliter fremoverprimer, en mikroliter omvendt primer, fem mikroliter DNTP-blanding, 0,5 mikroliter DNA-polymerase, 10 mikroliter 5x DNA-polymerasereaksjonsbuffer og dobbeltdestillert vann opp til et totalt volum på 50 mikroliter.Forsterk DNA-sekvensene ved hjelp av touchdown PCR-programmet på en termosyklist som beskrevet i manuskriptet. Isoler PCR-produktene via gelelektroforese og fortynn DNA-sekvensene fra agarosegelen via et DNA-gelekstraksjonssett. Bruk Gibson-monteringsmetoden, sett de rensede PCR-produktene inn i den kuttåpne skyttelvektoren ved å la den ekvimolare DNA-blandingen ved 50 grader Celsius i en time.Konstruer dCas12a-akseptørvektoren via touchdown-PCR og Gibson-monteringsmetoden som vist tidligere. Sett inn gjærkodonoptimaliserte dCas12a-proteiner i de to nykonstruerte akseptorvektorene via fordøyelse med BamH1 og Xhol1 og ligering med T4 DNA-ligase. På samme måte konstruerer du plasmidene basert på pRS2403-skyttelvektoren for å uttrykke anti-CRISPR-proteinene via touchdown-PCR og Gibson-monteringsmetoden.For å utføre mikroskopi celledeteksjon, plasser to mikroliter av celleoppløsningen på et lysbilde og dekk det med et deksel. Observer cellene under et fluorescensmikroskop ved å slå på fluorescerende lyskilde, mikroskop og datamaskin. Etter å ha skrevet ned det fluorescerende lyskildenummeret, åpner du mikroskopprogramvaren på datamaskinen.Sett lysbildet på mikroskopstadiet og velg 40x objektivlinsen mens du observerer cellene under det grønne lyset. Beveg kursfokusknappen til konturen av gjærceller vises og finfokusknappen for å fokusere cellene. For å oppdage cellene, etter å ha lukket mikroskopets synsfelt, bytt til dataskjermen og klikk på live.Vent i tre til fem sekunder. Klikk på capture for å ta et bilde og lagre bildet. Deretter slår du av datamaskinen, mikroskopet og fluorescerende lyskilde.Slå på FACS-maskinen 20 minutter før målingene for å varme opp laseren og bland 20 mikroliter av cellekulturen med 300 mikroliter dobbeltdestillert vann. Kjør FACS-programvaren på datamaskinen som er koblet til FACS-maskinen, og opprett et nytt eksperiment. Angi deretter måleparametrene.Velg deretter filteret i henhold til prøvenes eksitasjons- og utslippsbølgelengder og sett oppkjøpscellenummeret til 10.000. Juster FITC-filterspenningen ved å måle intensiteten til fluorescerende perler, slik at den relative forskjellen i intensiteten til perlene mellom to påfølgende eksperimenter ikke overstiger 5%Vask maskinen med dobbelt destillert vann i noen sekunder for å fjerne eventuelle overflødige perler. Mål fluorescensintensiteten og klikk på forhåndsvisning mens du venter i tre til fem sekunder på prøveinjeksjonsstabilitet.Til slutt klikker du på hente. Mål perlene igjen på slutten av eksperimentet. Etter å ha kontrollert om den relative forskjellen mellom de to perlemålingene overstiger 5 %Eksporter FACS-dataene som FCS-filer.Åpne R-studio og last inn skriptet BDverse_analysis. R for å analysere FCS-filene. Sett eksperimentnavnet som ename, katalogbanen der FCS-filene er lagret som dir_d og resultatfilene opprettes som dir_r.Sett deretter fluorescenskanalen. Angi antall prøver som ble målt. Dimensjonene til punktdiagrammer og den maksimale lengden på x- og y-aksen for stolpediagrammer og boksplott.Velg vurderingsmetode ved å fjerne hashtaggen fra de tilsvarende linjene. Velg flowSet-objektet som tilsvarer den valgte gating-metoden og punktplottoppløsningen, som skal være minst lik 256. Fjern kommentarer fra de to filtreringsinstruksjonene for å fjerne målinger der fluorescens er negativ og for å fjerne avvik på grunn av andre eksperimenter som beskrevet i manuskriptet.Trykk på kilden og kjør skriptet. Alle filene som inneholder resultatene fra analysen, opprettes i dir_r. Den beste aktiveringseffektiviteten til dSpCas9-VP64 ble oppnådd da det var seks lexOp-målsteder på den syntetiske promotoren.Mens for dCas12a-VPR høyeste aktiveringseffektivitet når tre kopier av lexOp ble satt inn i den syntetiske promotoren. Aktiveringen av CRISPR RNA og enkelt guide-RNA lokalisert på et integrerende plasmid var 1, 4 til 2, 4 og 1, 1 til 1, 5 ganger høyere enn når den ble plassert på et episomalt plasmid. RT-qPCR-resultater viste at en episomal vektor produserte et mye høyere nivå av enkeltguide RNA CRISPR RNA enn den integrerende vektoren, uavhengig av ekspresjonssystemet.Aktiveringseffektiviteten til den komplekse dSpCas9 og stillas-RNA-rekrutteringen MCP-VP64 ble testet. Stillas-RNA-et som inneholdt en enkelt villtype og F6MS2-hårnål ga henholdsvis 5,27 og 4,3 ganger aktivering. Kombinasjonen av de to hårnålene resulterte imidlertid i 7,54 ganger med den høyeste aktiveringseffektiviteten.Fire forskjellige promotorer ble brukt til å drive uttrykket av tre typer type to anti CRISPR som viste at de fungerte på en doseavhengig måte. En sterk promotor reduserte fluorescensnivået til henholdsvis 0,21, 0,11 og 0,13 av verdien. Titreringskurven viser at kretsen oppfører seg som en knutegang med et av og på-forhold som nærmer seg 2,3.Type fem anti-CRISPR A reduserer fluorescensuttrykket til både denAS-Cas12a og dLB-Cas12a som aktivatorer fra 19% til 71%Forholdet mellom aktivatorer og repressorer ble studert der Acr-VA-en viste store svingninger i ytelsen når den ble produsert av pGAL1 under pTEF1 og genetisk CYC1t-pCYC1noTata type fem anti-CRISPR-A1 viste bare noe undertrykkelse på den nakne dLB Cas12a. FACS-maskinen er skrøpelig, derfor skal den håndteres nøye. Celleoppløsningen skal aldri være for tett, og maskinen skal holdes ren.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Electrical Engineering

Bioengineering

Unit 1

DC Circuit Analysis

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tredimensjonal Cell Kultur Modell for å måle effekten av interstitiell væske Flow på Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Gransker Receptor-ligandsysternene med Cellulosome med AFM-baserte Single-molekyl kraft spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mønstre bioaktive proteiner eller peptider på Hydrogel bruker fotokjemi for biologiske programmer

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

Agarose-baserte vev Mimicking optisk Phantoms for diffus refleksjon spektroskopi

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

En dråpe Microfluidic tilnærming og Microsphere PCR forsterkning for Single-strandet DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En flerlags Mikrovæskebasert plattform for gjennomføring av langvarig Cell-gratis Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Metoder for in vivo biomekaniske testing på brachialis plexus i nyfødt grisunger

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Elektrowetting-basert digital mikrofluidikkplattform for automatisert enzym-koblet immunosorbent analyse

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Pålitelig prosjektering og kontroll av stabile optogenetiske genkretser i pattedyrceller

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Rekonstituering av aktinbasert motilitet med kommersielt tilgjengelige proteiner

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...