Name: gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00
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Queremos agradecer a todos os alunos do laboratório de Biologia Sintética - SPST, TJU - por sua ajuda geral, juntamente com Zhi Li e Xiangyang Zhang por sua assistência em experimentos FACS.

1. Projeto e construção do de expressão de sgRNA/crRNA
NOTA: Existem dois tipos de de expressão de sgRNA/crRNA: um denominado SNR5210-é composto pelo promotor SNR52 dependente de RNA polimerase III, a sequência sgRNA/crRNA e o terminador SUP4; outra, abreviada como RGR11, consiste no promotor ADH1 dependente de RNA polimerase II, a estrutura RGR (ribozima-guia RNA-ribozima) que contém duas ribozimas (uma ri...

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	<li>Marchisio, M. A., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+design+of+digital+synthetic+gene+circuits.">Automatic design of digital synthetic gene circuits.</a> PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083 (2011).</li><li>Karnaugh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+map+method+for+synthesis+of+combinational+logic+circuits.">The map method for synthesis of combinational logic circuits.</a> Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).</li><li>Mandell, J. G., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+finger+tools:+custom+DNA-binding+domains+for+transcription+factors+and+nucleases.">Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases.</a> Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).</li><li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+effectors:+customizable+proteins+for+DNA+targeting.">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li><li>Drinnenberg, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+budding+yeast.">RNAi in budding yeast.</a> Science. 326 (5952), 544-550 (2009).</li><li>Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+logic+circuits+in+yeast+with+CRISPR-dCas9+NOR+gates.">Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates.</a> Nature Communications. 8, 15459 (2017).</li><li>Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+and+multifunctional+eukaryotic+transcription+factors+based+on+CRISPR/Cas.">Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas.</a> ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).</li><li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-mediated+control+of+gene+editing+and+synthetic+circuits+in+eukaryotic+cells.">Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 194 (2019).</li><li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast.">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131 (1), 129-134 (1993).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gao, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-processing+of+ribozyme-flanked+RNAs+into+guide+RNAs+in+vitro+and+in+vivo+for+CRISPR-mediated+genome+editing.">Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Yu, L., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+synthetic+transcriptional+networks+harnessing+dCas12a+and+Type+V-A+anti-CRISPR+proteins.">Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).</li><li>Zhang, Y., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bare+dSpCas9,+scaffold+gRNA,+and+type+II+anti-CRISPR+proteins+highly+favors+the+control+of+gene+expression+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).</li><li>Sheff, M. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cassettes+for+fluorescent+protein+tagging+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).</li><li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRdirect:+software+for+designing+CRISPR/Cas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites.">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li><li>Chee, M. K., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+redesigned+pRS+plasmid+shuttle+vectors+for+genetic+manipulation+of+Saccharomyces+cerevisiae.">New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides.">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. Fourth edition. , (2012).</li><li>Sanger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+nucleotide+sequences+in+DNA.">Determination of nucleotide sequences in DNA.</a> Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Zalatan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+complex+synthetic+transcriptional+programs+with+CRISPR+RNA+scaffolds.">Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds.</a> Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).</li><li>Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+terminators+be+used+as+insulators+into+yeast+synthetic+gene+circuits.">Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits.</a> Journal of Biological Engineering. 10, 19 (2016).</li><li>Rauch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CRISPR-Cas9+with+bacteriophage+proteins.">Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins.</a> Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).</li><li>Hynes, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+from+a+virulent+streptococcal+phage+inhibits+Streptococcus+pyogenes+Cas9.">An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9.</a> Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).</li><li>Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+natural+CRISPR-Cas12a+inhibitors.">Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors.</a> Science. 362 (6411), 236-239 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).</li><li>Hahne, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flowCore:+a+Bioconductor+package+for+high+throughput+flow+cytometry.">flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 106 (2009).</li><li>Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-based+biosensors+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae.</a> Journal of Biological Engineering. 12, 11 (2018).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+protein+disables+type+V+Cas12a+by+acetylation.">An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).</li></ol>

O protocolo mostrou um possível fluxo de trabalho completo para circuitos digitais de genes sintéticos, seguindo o ciclo de engenharia biológica "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) e em experimentos de laboratório seco e úmido. Aqui, nós nos concentramos no sistema CRISPR-Cas, principalmente dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a, e as proteínas anti-CRISPR correspondentes, projetando e construindo em S. cerevisiae pequenas redes transcricionais. Alguns deles imitavam portões booleanos, que são os componentes bá...

Em 2011, pesquisadores propuseram um método computacional e desenvolveram um software correspondente para o projeto automático de circuitos gênicos sintéticos digitais1. Um usuário tinha que especificar o número de entradas (três ou quatro) e preencher a tabela verdade do circuito; Isso forneceu todas as informações necessárias para derivar a estrutura do circuito usando técnicas da eletrônica. A tabela verdade foi traduzida em duas fórmulas booleanas através do método do mapa de Karnaugh2. Cada fórmula booleana é feita de cláusulas que descrevem operações lógicas (soma ou multiplicação) entre (parte de) as entradas do circuito e suas negações (os literais). As cláusulas, por sua vez, são somadas (OR) ou multiplicadas (AND) para calcular a saída do circuito. Cada circuito pode ser realizado de acordo com qualquer uma de suas duas fórmulas correspondentes: uma escrita em forma de POS (produto de somas) e a outra em representação de SOP (soma de produtos). O primeiro consiste em uma multiplicação de orações (isto é, portas booleanas) que contêm uma soma lógica dos literais. Esta última, ao contrário, é uma soma de orações onde os literais são multiplicados.
Os circuitos elétricos podem ser realizados, em uma protoboard, conectando fisicamente diferentes portões juntos. A corrente elétrica permite a troca de sinais entre as comportas, o que leva ao cálculo da saída.
Na biologia, a situação é mais complexa. Uma porta booleana pode ser realizada como uma unidade de transcrição (TU; ou seja, a sequência "promotor-codificador de região-terminador" dentro de células eucarióticas), onde a transcrição ou tradução (ou ambas) são reguladas. Assim, pelo menos dois tipos de moléculas estabelecem uma fiação biológica: as proteínas do fator de transcrição e os RNAs antisenso não codificadores1.
Um circuito digital de genes é organizado em duas ou três camadas de portas, a saber: 1) a camada de entrada, que é feita de portas SIM (tampão) e NÃO e converte os produtos químicos de entrada em moléculas de fiação; 2) a camada interna, que consiste em tantas TUs quantas forem as cláusulas na fórmula booleana correspondente. Se o circuito for projetado de acordo com a fórmula SOP, cada cláusula na camada interna produzirá a saída do circuito (por exemplo, fluorescência) em uma chamada arquitetura de saída distribuída. Se o produto da fórmula da soma (POS) for usado, então uma camada final 3) é necessária, que conterá uma única porta multiplicativa coletando as moléculas de fiação da camada interna.
No geral, em biologia sintética, muitos esquemas diferentes podem ser projetados para o mesmo circuito. Eles diferem no número e no tipo de TUs e moléculas de fiação. A fim de escolher a solução mais fácil de ser implementada em células de levedura, cada projeto de circuito é associado a um escore de complexidade S, definido como
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;">
onde A representa o número de ativadores, R representa o número de repressores e a é a quantidade de moléculas de RNA antisense. Se ativadores ou repressores estiverem ausentes do circuito, sua contribuição para S é zero. Portanto, é mais difícil realizar um esquema de circuito em laboratório (S alto) quando ele requer um alto número de fatores de transcrição ortogonais. Isso significa que novos ativadores e repressores devem ser projetados de novo para realizar a fiação completa dentro dos circuitos digitais. Em princípio, novas proteínas ligadoras de DNA podem ser montadas usando as proteínas Zinc Finger3 e TAL efetores4 como modelos. No entanto, essa opção parece muito árdua e demorada; portanto, deve-se confiar principalmente em pequenos RNAs e regulação da tradução para finalizar circuitos gênicos complexos.
Originalmente, este método foi desenvolvido para fabricar circuitos digitais em bactérias. De fato, em células eucarióticas, em vez de RNAs antisense, é mais adequado falar em microRNAs (miRNAs) ou pequenos RNAs interferentes (siRNAs)5. Entretanto, a via RNAi não está presente na levedura S. cerevisiae. Assim, deve-se optar por redes totalmente transcricionais. Suponha que um circuito precise de cinco ativadores e cinco repressores; seu escore de complexidade seria S = 32. A complexidade do circuito pode ser reduzida substituindo os 10 fatores de transcrição por um único dCas96 (Cas9 deficiente em nuclease) fundido a um domínio de ativação (AD). Como mostrado em7, dCas9-AD funciona como um repressor em levedura ao ligar um promotor entre a caixa TATA e o TSS (local de início da transcrição) e como um ativador ao ligar bem a montante da caixa TATA. Assim, pode-se substituir 10 fatores de transcrição por uma única proteína de fusão dCas9-AD e 10 sgRNAs (RNAs guia únicos) por um escore de complexidade total de S = 11. É rápido e fácil sintetizar dez sgRNAs, enquanto, como comentado anteriormente, a montagem de 10 proteínas demandaria um trabalho muito mais longo e complicado.
Alternativamente, pode-se usar duas proteínas dCas ortogonais (por exemplo, dCas9 e dCas12a): uma para fundir-se a um AD e a outra nua ou em combinação com um domínio de repressão. O escore de complexidade aumentaria em apenas uma unidade (S = 12). Assim, os sistemas CRISPR-dCas são a chave para a construção de circuitos digitais gênicos muito intrincados em S. cerevisiae.
Este trabalho caracteriza profundamente a eficiência de repressores e ativadores à base de dCas9 e dCas12a em leveduras. Os resultados mostram que eles não demandam uma grande quantidade de sgRNA para otimizar sua atividade, de modo que plasmídeos epissomais são preferencialmente evitados. Além disso, ativadores baseados em dCas9 são muito mais eficazes quando se usa um RNA de andaime (scRNA) que recruta cópias do AD VP64. Em contraste, o dCas12a funciona bem quando fundido diretamente ao forte VPR AD. Além disso, um promotor ativado sintético demanda um número variável de locais alvo, dependendo da configuração do ativador (por exemplo, três quando se usa dCas12a-VPR, seis em dCas9-VP64 e apenas um com dCas9 e um scRNA). Como repressor, dCas12a parece mais incisivo ao ligar a região codificadora do que o promotor.
Como desvantagem, no entanto, CRISPR-dCas9/dCas12a não interagem diretamente com produtos químicos. Portanto, eles podem não ser úteis na camada de entrada. Por esta razão, projetos alternativos de portas booleanas contendo proteínas anti-CRISPR (Acrs) têm sido investigados. Os acrs atuam sobre as proteínas (d)Cas e inibem seu funcionamento8. Portanto, eles são um meio para modular a atividade dos sistemas CRISPR-(d)Cas. Este trabalho analisa minuciosamente as interações entre Acrs tipo II e (d)Cas9, bem como acrs tipo V e (d)Cas12a em S. cerevisiae. Uma vez que os Acrs são muito menores do que as proteínas Cas, uma porta NOT responsiva ao estrogênio β-estradiol foi construída pela fusão do domínio de ligação hormonal do receptor de estrogênio humano 9-HBD(hER)-ao AcrIIA4. Além disso, um punhado de portas SIM e NÃO que expressavam dCas12a(-AD) constitutivamente e AcrVAs na indução com galactose foram realizados. Atualmente, esses portões servem apenas como uma prova de conceito. No entanto, eles também representam o primeiro passo para um profundo repensar do algoritmo para realizar o projeto automático computacional de circuitos digitais de genes sintéticos em células de levedura.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mL PCR 8-strip tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>403112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose-molecular biology grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>75510-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA gel extraction kit</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-GX-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSuite CS&#38;T research beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>650621</td>
			<td>Fluorescent beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSVerse flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall ST 16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli competent cells (Strain DH5&#945;)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18263-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL select Western Blotting detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd</td>
			<td>JY300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat 8-strip caps</td>
			<td>NEST</td>
			<td>406012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene synthesis company</td>
			<td>Azenta Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiFiScript cDNA synthesis kit</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2569M</td>
			<td>Kit used in step 6.2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysate solution (Zymolyase)</td>
			<td>zymoresearch</td>
			<td>E1004-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;10 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;1000 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;200 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII403</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII404</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII405</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII406</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII424</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTPGI_dSpCas9_VP64&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-fidelity DNApolymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-Acc65I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-SacI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 96&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td>Real-Time PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae CEN.PK2-1C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; 
			MAL2-8c; SUC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem-Loop Kit</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>AG0502</td>
			<td>Kit used in step 6.2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>186-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 Exonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR820Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YeaStar RNA kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins

Os portões booleanos de genes sintéticos e os circuitos digitais têm uma ampla gama de aplicações, desde diagnósticos médicos até cuidados ambientais. A descoberta dos sistemas CRISPR-Cas e seus inibidores naturais - as proteínas anti-CRISPR (Acrs) - fornece uma nova ferramenta para projetar e implementar circuitos digitais gênicos in vivo . Aqui, descrevemos um protocolo que segue a ideia do ciclo de engenharia biológica "Design-Build-Test-Learn" e faz uso de dCas9/dCas12a juntamente com seus Acrs correspondentes para estabelecer pequenas redes transcricionais, algumas das quais se comportam como portões booleanos, em Saccharomyces cerevisiae. Estes resultados apontam as propriedades de dCas9/dCas12a como fatores de transcrição. Em particular, para alcançar a ativação máxima da expressão gênica, dSpCas9 precisa interagir com um RNA de andaime projetado que coleta múltiplas cópias do domínio de ativação VP64 (AD). Em contraste, dCas12a deve ser fundido, no terminal C, com o forte VP64-p65-Rta (VPR) AD. Além disso, a atividade de ambas as proteínas Cas não é aumentada pelo aumento da quantidade de sgRNA/crRNA na célula. Este artigo também explica como criar portas booleanas com base na interação CRISPR-dCas-Acr. O domínio de ligação hormonal fundido AcrIIA4 do receptor de estrogênio humano é o núcleo de uma porta NOT responsiva ao β-estradiol, enquanto AcrVAs sintetizados pelo promotor induzível GAL1 permite imitar ambas as portas SIM e NÃO com galactose como entrada. Nos últimos circuitos, AcrVA5, juntamente com dLbCas12a, apresentou o melhor comportamento lógico.

Expressão de sgRNA/crRNA por um promotor do tipo RNA polimerase III Primeiramente, este trabalho abordou a engenharia do circuito de ativação transcricional (circuito 1) mostrado na Figura 1A. Ele continha três componentes básicos: 1) o gene que codifica para yEGFP (o repórter), que foi precedido por uma série de diferentes promotores sintéticos que forneceram locais-alvo para dCas9/dCas12a-AD; 2) uma versão otimizada para códons de levedura de dCas9 ou dCas12a ...

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Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

Sistemas CRISPR-Cas e proteínas anti-CRISPR foram integrados ao esquema de portões booleanos em Saccharomyces cerevisiae. Os novos circuitos lógicos pequenos mostraram bom desempenho e aprofundaram a compreensão dos fatores de transcrição baseados em dCas9/dCas12a e das propriedades das proteínas anti-CRISPR.

Circuitos Digitais Gênicos Baseados em Sistemas CRISPR-Cas e Proteínas Anti-CRISPR

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

Nosso protocolo explica como projetar, construir e analisar circuitos digitais de genes de levedura que fazem uso de sistemas de dCas CRISPR tipo dois e tipo cinco e as proteínas anti-CRISPR correspondentes. É a montagem porque reúne zero procedimentos padrão para montar e testar redes transcricionais sintéticas em serviços. Para começar, prepare uma mistura de reação contendo 20 a 40 nanogramas de molde de DNA, um microlitro de primer direto, um microlitro de primer reverso, cinco microlitros de mistura DNTP, 0,5 microlitros de DNA polimerase, 10 microlitros de tampão de reação de DNA polimerase 5x e água bidestilada até um volume total de 50 microlitros.Amplificar as sequências de DNA usando o programa de PCR touchdown em um termociclador conforme descrito no manuscrito. Isolar os produtos da PCR por eletroforese em gel e diluir as sequências de DNA do gel de agarose através de um kit de extração em gel de DNA. Usando o método de montagem de Gibson, insira os produtos de PCR purificados no vetor de vaivém aberto cortado, deixando entrar a mistura de DNA equimolar a 50 graus Celsius por uma hora.Construa o vetor aceitador dCas12a via PCR touchdown e o método de montagem Gibson, conforme demonstrado anteriormente. Inserir as proteínas dCas12a otimizadas para o códon de levedura nos dois vetores aceptores recém-construídos via digestão com BamH1 e Xhol1 e ligadura com T4 DNA ligase. Similarmente, construir os plasmídeos com base no vetor de vaivém pRS2403 para expressar as proteínas anti-CRISPR via touchdown PCR e o método de montagem de Gibson.Para realizar a detecção de células de microscopia, coloque dois microlitros da solução celular em uma lâmina de vidro e cubra-a com uma lamínula. Observe as células sob um microscópio de fluorescência, ligando a fonte de luz fluorescente, o microscópio e o computador. Depois de anotar o número da fonte de luz fluorescente, abra o software do microscópio no computador.Coloque a lâmina no palco do microscópio e escolha a lente objetiva de 40x enquanto observa as células sob a luz verde. Mova o botão de foco do curso até que o contorno das células de levedura apareça e o botão de foco fino para focar as células. Para detectar as células, depois de fechar o campo de visão do microscópio mudar para a tela do computador e clique em ao vivo.Aguarde de três a cinco segundos. Clique na captura para tirar uma foto e salvá-la. Em seguida, desligue o computador, o microscópio e a fonte de luz fluorescente.Ligue a máquina FACS 20 minutos antes das medições para aquecer o laser e misture 20 microlitros da cultura celular com 300 microlitros de água bidestilada. Execute o software FACS no computador conectado à máquina FACS e crie um novo experimento. Em seguida, defina os parâmetros de medição.Em seguida, selecione o filtro de acordo com os comprimentos de onda de excitação e emissão das amostras e defina o número da célula de aquisição como 10.000. Ajuste a tensão do filtro FITC medindo a intensidade das esferas fluorescentes, garantindo que a diferença relativa na intensidade das contas entre dois experimentos consecutivos não exceda 5%Lave a máquina com água destilada dupla por alguns segundos para remover qualquer possível excesso de contas. Meça a intensidade da fluorescência da amostra e clique na visualização enquanto aguarda de três a cinco segundos para a estabilidade da injeção da amostra.Por fim, clique em adquirir. Meça as contas novamente no final do experimento. Depois de verificar se a diferença relativa entre as duas medidas de contas excede 5%Exporte os dados FACS como arquivos FCS.Abra o R studio e carregue o script BDverse_analysis. R para analisar os arquivos FCS. Defina o nome do experimento como ename, o caminho do diretório onde os arquivos FCS são armazenados como dir_d e os arquivos de resultado serão criados como dir_r.Em seguida, defina o canal de fluorescência. Defina o número de amostras que foram medidas. As dimensões dos gráficos de pontos e o comprimento máximo dos eixos x e y para gráficos de barras e gráficos de caixa.Escolha o método de classificação removendo a hashtag das linhas correspondentes. Selecione o objeto flowSet fechado correspondente ao método de gating escolhido e a resolução do gráfico de pontos, que deve ser pelo menos igual a 256. Descomente as duas instruções de filtragem para remover medidas onde a fluorescência é negativa e para remover outliers devido a outros experimentos, conforme descrito no manuscrito.Pressione o código-fonte e execute o script. Todos os arquivos contendo os resultados da análise são criados em dir_r. A melhor eficiência de ativação de dSpCas9-VP64 foi alcançada quando havia seis locais-alvo de lexOp no promotor sintético.Enquanto para dCas12a-VPR maior eficiência de ativação quando três cópias de lexOp foram inseridas no promotor sintético. A ativação por RNA CRISPR e RNA guia único localizado em um plasmídeo integrativo foi 1,4 a 2,4, e 1,1 a 1,5 vezes maior do que quando colocado em um plasmídeo epissomal. Os resultados da RT-qPCR mostraram que um vetor epissomal produziu um nível muito maior de RNA guia único CRISPR do que o vetor integrador, independentemente do sistema de expressão.A eficiência de ativação do complexo dSpCas9 e do recrutamento de RNA de andaime MCP-VP64 foi testada. O RNA do andaime contendo um único tipo selvagem e hairpin F6MS2 deu uma ativação de 5,27 e 4,3 vezes, respectivamente. No entanto, a combinação dos dois pinos resultou em 7,54 vezes com a maior eficiência de ativação.Quatro promotores diferentes foram usados para conduzir a expressão de três tipos de tipo dois anti CRISPR, mostrando que eles funcionavam de maneira dependente da dose. Um promotor forte reduziu o nível de fluorescência para 0,21, 0,11 e 0,13 de seu valor, respectivamente. A curva de titulação mostra que o circuito se comporta como uma marcha de nó com uma relação liga/desliga próxima de 2,3.O tipo cinco anti-CRISPR A reduz a expressão de fluorescência de ambos denAS-Cas12a e dLB-Cas12a como ativadores de 19% para 71%A relação entre ativadores e repressores foi estudada onde o Acr-VA exibiu grandes flutuações em seu desempenho quando produzido por pGAL1 sob pTEF1 e o genético CYC1t-pCYC1noTata tipo cinco anti-CRISPR-A1 mostrou alguma repressão apenas no dLB Cas12a nu. A máquina FACS é frágil, portanto deve ser manuseada com cuidado. A solução celular nunca deve ser demasiado densa e a máquina deve ser mantida limpa.

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Um modelo tridimensional de Cultura Celular para avaliar os efeitos de fluxo de fluido intersticial na invasão da célula tumoral

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

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Reconstituição da Motilidade à Base de Actina com Proteínas Comercialmente Disponíveis

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