Name: gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins at JoVE.com

Мы хотим поблагодарить всех студентов лаборатории синтетической биологии SPST, TJU за их общую помощь, а также Чжи Ли и Сянъян Чжан за помощь в экспериментах FACS.

1. Проектирование и конструирование кассеты экспрессии сгРНК/крРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует два типа кассет для экспрессии сгРНК/крРНК: одночленный SNR5210 - состоит из РНК-полимеразы III-зависимого промотора SNR52, последовательности сгРНК/крРНК и терм?...

<ol>
	<li>Marchisio, M. A., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+design+of+digital+synthetic+gene+circuits.">Automatic design of digital synthetic gene circuits.</a> PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083 (2011).</li><li>Karnaugh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+map+method+for+synthesis+of+combinational+logic+circuits.">The map method for synthesis of combinational logic circuits.</a> Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).</li><li>Mandell, J. G., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+finger+tools:+custom+DNA-binding+domains+for+transcription+factors+and+nucleases.">Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases.</a> Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).</li><li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+effectors:+customizable+proteins+for+DNA+targeting.">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li><li>Drinnenberg, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+budding+yeast.">RNAi in budding yeast.</a> Science. 326 (5952), 544-550 (2009).</li><li>Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+logic+circuits+in+yeast+with+CRISPR-dCas9+NOR+gates.">Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates.</a> Nature Communications. 8, 15459 (2017).</li><li>Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+and+multifunctional+eukaryotic+transcription+factors+based+on+CRISPR/Cas.">Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas.</a> ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).</li><li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-mediated+control+of+gene+editing+and+synthetic+circuits+in+eukaryotic+cells.">Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 194 (2019).</li><li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast.">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131 (1), 129-134 (1993).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gao, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-processing+of+ribozyme-flanked+RNAs+into+guide+RNAs+in+vitro+and+in+vivo+for+CRISPR-mediated+genome+editing.">Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Yu, L., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+synthetic+transcriptional+networks+harnessing+dCas12a+and+Type+V-A+anti-CRISPR+proteins.">Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).</li><li>Zhang, Y., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bare+dSpCas9,+scaffold+gRNA,+and+type+II+anti-CRISPR+proteins+highly+favors+the+control+of+gene+expression+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).</li><li>Sheff, M. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cassettes+for+fluorescent+protein+tagging+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).</li><li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRdirect:+software+for+designing+CRISPR/Cas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites.">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li><li>Chee, M. K., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+redesigned+pRS+plasmid+shuttle+vectors+for+genetic+manipulation+of+Saccharomyces+cerevisiae.">New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides.">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. Fourth edition. , (2012).</li><li>Sanger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+nucleotide+sequences+in+DNA.">Determination of nucleotide sequences in DNA.</a> Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Zalatan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+complex+synthetic+transcriptional+programs+with+CRISPR+RNA+scaffolds.">Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds.</a> Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).</li><li>Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+terminators+be+used+as+insulators+into+yeast+synthetic+gene+circuits.">Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits.</a> Journal of Biological Engineering. 10, 19 (2016).</li><li>Rauch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CRISPR-Cas9+with+bacteriophage+proteins.">Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins.</a> Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).</li><li>Hynes, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+from+a+virulent+streptococcal+phage+inhibits+Streptococcus+pyogenes+Cas9.">An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9.</a> Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).</li><li>Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+natural+CRISPR-Cas12a+inhibitors.">Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors.</a> Science. 362 (6411), 236-239 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).</li><li>Hahne, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flowCore:+a+Bioconductor+package+for+high+throughput+flow+cytometry.">flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 106 (2009).</li><li>Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-based+biosensors+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae.</a> Journal of Biological Engineering. 12, 11 (2018).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+protein+disables+type+V+Cas12a+by+acetylation.">An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).</li></ol>

Протокол показал возможный полный рабочий процесс для цифровых схем синтетических генов в соответствии с циклом биологической инженерии «Проектирование-Строительство-Тестирование-Обучение» (DBTL) и в отношении экспериментов как в сухой, так и в мокрой лаборатории. Здесь мы сосредоточи...

В 2011 году исследователи предложили вычислительный метод и разработали соответствующее программное обеспечение для автоматического проектирования цифровых синтетических генных схем1. Пользователь должен был указать количество входов (три или четыре) и заполнить таблицу истинности схемы; Это предоставило всю необходимую информацию для получения структуры схемы с использованием методов электроники. Таблица истинности была переведена в две логические формулы с помощью методакарты Карно 2. Каждая булева формула состоит из предложений, описывающих логические операции (сумма или умножение) между (частью) входов схемы и их отрицаний (литералов). Предложения, в свою очередь, либо суммируются (ИЛИ), либо умножаются (И) для вычисления выходного сигнала схемы. Каждая схема может быть реализована в соответствии с любой из двух соответствующих формул: одна записана в форме POS (произведение сумм), а другая - в представлении SOP (сумма произведений). Первый состоит из умножения предложений (т. е. булевых ворот), которые содержат логическую сумму литералов. Последний, напротив, представляет собой сумму предложений, в которых перемножаются литералы.
Электрические цепи могут быть реализованы на макетной плате путем физического соединения различных ворот вместе. Электрический ток позволяет обмениваться сигналами между вентилями, что приводит к вычислению выхода.
В биологии ситуация сложнее. Булевы ворота могут быть реализованы как транскрипционная единица (TU; т.е. последовательность «промотор-кодирующая область-терминатор» внутри эукариотических клеток), где транскрипция или трансляция (или и то, и другое) регулируются. Таким образом, по крайней мере, два вида молекул устанавливают биологическую связь: белки фактора транскрипции и некодирующие, антисмысловые РНК1.
Цифровая схема гена организована в два или три слоя вентилей, а именно: 1) входной слой, который состоит из затворов YES (буфер) и NOT и преобразует входные химические вещества в молекулы проводки; 2) внутренний слой, который состоит из стольких ТУ, сколько предложений в соответствующей булевой формуле. Если схема спроектирована в соответствии с формулой СОП, каждый пункт во внутреннем слое будет производить выходной сигнал схемы (например, флуоресценцию) в так называемой распределенной выходной архитектуре. Если используется формула произведения суммы (POS), то требуется 3) конечный слой, который будет содержать один мультипликативный затвор, собирающий молекулы проводки из внутреннего слоя.
В целом, в синтетической биологии для одной и той же схемы может быть разработано множество различных схем. Они различаются по количеству и виду как TU, так и молекул проводки. Чтобы выбрать самое простое решение, которое будет реализовано в дрожжевых клетках, каждая схема связана с оценкой сложности S, определяемой как
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;">
где A — количество активаторов, R — количество репрессоров, a — количество молекул антисмысловой РНК. Если в цепи отсутствуют активаторы или репрессоры, их вклад в S равен нулю. Следовательно, сложнее реализовать схему в лаборатории (высокий S), когда требуется большое количество ортогональных факторов транскрипции. Это означает, что новые активаторы и репрессоры должны быть спроектированы заново, чтобы реализовать полную проводку внутри цифровых цепей. В принципе, новые ДНК-связывающие белки могут быть собраны с использованием белков цинкового пальца3 и эффекторовTAL 4 в качестве шаблонов. Однако этот вариант представляется слишком трудным и трудоемким; поэтому следует полагаться в основном на малые РНК и регуляцию трансляции для завершения сложных генных цепей.
Первоначально этот метод был разработан для изготовления цифровых схем у бактерий. Действительно, в эукариотических клетках вместо антисмысловых РНК более уместно говорить о микроРНК (миРНК) или малых интерферирующих РНК (миРНК)5. Однако путь РНКи отсутствует у дрожжей S. cerevisiae. Следовательно, следует выбирать полностью транскрипционные сети. Предположим, что для цепи требуется пять активаторов и пять репрессоров; его оценка сложности будет S = 32. Сложность схемы может быть уменьшена путем замены 10 факторов транскрипции одним dCas96 (Cas9 с дефицитом нуклеазы), слитым с активационным доменом (AD). Как показано нарисунке 7, dCas9-AD работает как репрессор у дрожжей при связывании промотора между коробкой TATA и TSS (начальным сайтом транскрипции) и как активатор при связывании значительно выше по течению от коробки TATA. Таким образом, можно заменить 10 факторов транскрипции одним слитым белком dCas9-AD и 10 сгРНК (одиночными направляющими РНК) для общей оценки сложности S = 11. Синтезировать десять сгРНК можно быстро и легко, в то время как, как отмечалось ранее, сборка 10 белков потребовала бы гораздо более длительной и сложной работы.
В качестве альтернативы можно использовать два ортогональных белка dCas (например, dCas9 и dCas12a): один для слияния с AD, а другой голый или в сочетании с доменом репрессии. Оценка сложности увеличится всего на одну единицу (S = 12). Следовательно, системы CRISPR-dCas являются ключом к построению очень сложных цифровых схем генов у S. cerevisiae.
В данной работе подробно охарактеризована эффективность репрессоров и активаторов на основе dCas9 и dCas12a у дрожжей. Результаты показывают, что они не требуют большого количества сгРНК для оптимизации своей активности, поэтому эписомальные плазмиды предпочтительно избегают. Более того, активаторы на основе dCas9 гораздо более эффективны при использовании каркасной РНК (скРНК), которая рекрутирует копии VP64 AD. Напротив, dCas12a хорошо работает при непосредственном слиянии с сильным AD VPR. Кроме того, синтетический активированный промотор требует переменного числа целевых сайтов, в зависимости от конфигурации активатора (например, три при использовании dCas12a-VPR, шесть для dCas9-VP64 и только один с dCas9 и скРНК). В качестве репрессора dCas12a кажется более острым при связывании кодирующей области, а не промотора.
Однако недостатком является то, что CRISPR-dCas9/dCas12a не взаимодействуют с химическими веществами напрямую. Поэтому они могут быть бесполезны на входном уровне. По этой причине были исследованы альтернативные конструкции булевых затворов, содержащие белки анти-CRISPR (Acrs). Acrs действуют на (d)Cas белки и ингибируют их работу8. Следовательно, они являются средством модуляции активности систем CRISPR-(d)Cas. В данной работе подробно анализируются взаимодействия между типом II Acrs и (d)Cas9, а также типом V Acrs и (d)Cas12a у S. cerevisiae. Поскольку Acrs намного меньше, чем белки Cas, ворота NOT, реагирующие на эстроген β-эстрадиол, были построены путем слияния гормонсвязывающего домена рецептора эстрогеначеловека 9-HBD (hER) - с AcrIIA4. Кроме того, было реализовано несколько вентилей ДА и НЕ, которые конститутивно экспрессировали dCas12a(-AD) и AcrVA при индукции с галактозой. В настоящее время эти ворота служат только доказательством концепции. Тем не менее, они также представляют собой первый шаг к глубокому переосмыслению алгоритма для выполнения вычислительного автоматического проектирования цифровых схем синтетических генов в дрожжевых клетках.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mL PCR 8-strip tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>403112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose-molecular biology grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>75510-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA gel extraction kit</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-GX-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSuite CS&#38;T research beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>650621</td>
			<td>Fluorescent beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSVerse flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall ST 16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli competent cells (Strain DH5&#945;)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18263-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL select Western Blotting detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd</td>
			<td>JY300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat 8-strip caps</td>
			<td>NEST</td>
			<td>406012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene synthesis company</td>
			<td>Azenta Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiFiScript cDNA synthesis kit</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2569M</td>
			<td>Kit used in step 6.2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysate solution (Zymolyase)</td>
			<td>zymoresearch</td>
			<td>E1004-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;10 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;1000 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;200 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII403</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII404</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII405</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII406</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII424</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTPGI_dSpCas9_VP64&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-fidelity DNApolymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-Acc65I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-SacI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 96&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td>Real-Time PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae CEN.PK2-1C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; 
			MAL2-8c; SUC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem-Loop Kit</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>AG0502</td>
			<td>Kit used in step 6.2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>186-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 Exonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR820Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YeaStar RNA kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins

Логические вентили синтетических генов и цифровые схемы имеют широкий спектр применения, от медицинской диагностики до заботы об окружающей среде. Открытие систем CRISPR-Cas и их естественных ингибиторов — белков анти-CRISPR (Acrs) — предоставляет новый инструмент для разработки и реализации цифровых схем генов in vivo . Здесь мы описываем протокол, который следует идее цикла биологической инженерии «Проектирование-Строительство-Тестирование-Обучение» и использует dCas9/dCas12a вместе с соответствующими Acrs для создания небольших транскрипционных сетей, некоторые из которых ведут себя как логические ворота, в Saccharomyces cerevisiae. Эти результаты указывают на свойства dCas9/dCas12a в качестве факторов транскрипции. В частности, для достижения максимальной активации экспрессии генов dSpCas9 должен взаимодействовать с сконструированной каркасной РНК, которая собирает несколько копий домена активации VP64 (AD). Напротив, dCas12a должен быть сплавлен на конце C с сильным VP64-p65-Rta (VPR) AD. Кроме того, активность обоих белков Cas не усиливается за счет увеличения количества сгРНК/крРНК в клетке. В этой статье также объясняется, как построить логические вентили на основе взаимодействия CRISPR-dCas-Acr. Слитый гормон-связывающий домен AcrIIA4 рецептора эстрогена человека является ядром ворот NOT, реагирующих на β-эстрадиол, тогда как AcrVA, синтезированные индуцируемым промотором GAL1 , позволяют имитировать как YES, так и NOT gates с галактозой в качестве входа. В последних схемах AcrVA5 вместе с dLbCas12a показали наилучшее логическое поведение.

Экспрессия сгРНК/крРНК промотором РНК-полимеразы III типа Во-первых, эта работа была посвящена проектированию схемы активации транскрипции (схема 1), показанной на рисунке 1A. Он содержал три основных компонента: 1) ген, кодирующий yEGFP (репортер), которому предшест...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins at JoVE.com

Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

Системы CRISPR-Cas и анти-CRISPR белки были интегрированы в схему булевых ворот у Saccharomyces cerevisiae. Новые небольшие логические схемы показали хорошую производительность и углубили понимание как факторов транскрипции на основе dCas9/dCas12a, так и свойств белков анти-CRISPR.

Цифровые схемы генов на основе систем CRISPR-Cas и белков анти-CRISPR

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

Наш протокол объясняет, как проектировать, создавать и анализировать цифровые схемы генов дрожжей, в которых используются системы CRISPR dCas второго и пятого типов и соответствующие белки анти-CRISPR. Это сборка, потому что она собирает ноль стандартных процедур для сборки и тестирования синтетических транскрипционных сетей в сервисах. Для начала приготовьте реакционную смесь, содержащую от 20 до 40 нанограммов матрицы ДНК, один микролитр прямого праймера, один микролитр обратного праймера, пять микролитров смеси DNTP, 0,5 микролитра ДНК-полимеразы, 10 микролитров 5-кратного реакционного буфера ДНК-полимеразы и двойную дистиллированную воду до общего объема 50 микролитров.Амплификация последовательностей ДНК с помощью программы ПЦР на термоциклере, как описано в рукописи. Изолируйте продукты ПЦР с помощью гель-электрофореза и разбавьте последовательности ДНК из агарозного геля с помощью набора для экстракции геля ДНК. Используя метод сборки Гибсона, вставьте очищенные продукты ПЦР в разрезанный вектор челнока, впустив эквимолярную смесь ДНК при температуре 50 градусов Цельсия в течение одного часа.Постройте вектор-акцептор dCas12a с помощью ПЦР с приземлением и метода сборки Гибсона, как показано ранее. Вставьте оптимизированные для дрожжевого кодона белки dCas12a в два вновь построенных акцепторных вектора путем расщепления BamH1 и Xhol1 и лигирования ДНК-лигазой Т4. Точно так же сконструируйте плазмиды на основе челночного вектора pRS2403 для экспрессии белков анти-CRISPR с помощью ПЦР с приземлением и метода сборки Гибсона.Чтобы выполнить микроскопическое обнаружение клеток, поместите два микролитра клеточного раствора на предметное стекло и накройте его покровным стеклом. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом, включив флуоресцентный источник света, микроскоп и компьютер. Записав номер источника флуоресцентного света, откройте программное обеспечение микроскопа на компьютере.Поместите предметное стекло на столик микроскопа и выберите 40-кратный объектив, наблюдая за клетками под зеленым светом. Перемещайте ручку фокусировки курса, пока не появится контур дрожжевых клеток и тонкая ручка фокусировки, чтобы сфокусировать клетки. Чтобы обнаружить клетки, после закрытия поля зрения микроскопа переключитесь на экран компьютера и нажмите на живое.Подождите три-пять секунд. Нажмите на захват, чтобы сделать снимок и сохранить снимок. Затем выключите компьютер, микроскоп и источник флуоресцентного света.Включите аппарат FACS за 20 минут до измерений, чтобы разогреть лазер и смешать 20 микролитров клеточной культуры с 300 микролитрами двойной дистиллированной воды. Запустите программное обеспечение FACS на компьютере, подключенном к компьютеру FACS, и создайте новый эксперимент. Затем установите параметры измерения.Затем выберите фильтр в соответствии с длинами волн возбуждения и излучения образцов и установите номер ячейки сбора данных на 10 000. Отрегулируйте напряжение фильтра FITC, измерив интенсивность флуоресцентных шариков, убедившись, что относительная разница в интенсивности шариков между двумя последовательными экспериментами не превышает 5%Промойте машину двойной дистиллированной водой в течение нескольких секунд, чтобы удалить любые возможные лишние шарики. Измерьте интенсивность флуоресценции образца и нажмите на предварительный просмотр, ожидая от трех до пяти секунд для стабильности впрыска образца.Наконец, нажмите «Приобрести». Измерьте бусины еще раз в конце эксперимента. Проверив, превышает ли относительная разница между измерениями двух шариков 5%Экспортируйте данные FACS в виде файлов FCS.Откройте R studio и загрузите сценарий BDverse_analysis. R для анализа файлов FCS. Задайте имя эксперимента как ename, путь к каталогу, в котором хранятся файлы FCS, как dir_d и файлы результатов будут созданы как dir_r.Далее устанавливаем флуоресцентный канал. Установите количество измеряемых образцов. Размеры точечных диаграмм и максимальная длина осей x и y для гистограмм и блочных диаграмм.Выберите метод оценки, удалив хэштег из соответствующих строк. Выберите объект flowSet gated, соответствующий выбранному методу стробирования, и разрешение точечного графика, которое должно быть не менее 256. Раскомментируйте две инструкции по фильтрации, чтобы удалить измерения, в которых флуоресценция отрицательна, и удалить выбросы, вызванные другими экспериментами, как описано в рукописи.Нажмите источник и запустите сценарий. Все файлы, содержащие результаты анализа, создаются в dir_r. Наилучшая эффективность активации dSpCas9-VP64 была достигнута при наличии шести целевых сайтов lexOp на синтетическом промоторе.В то время как для dCas12a-VPR наибольшая эффективность активации, когда три копии lexOp были вставлены в синтетический промотор. Активация CRISPR РНК и одной направляющей РНК, расположенной на интегративной плазмиде, была в 1,4–2,4 и от 1,1 до 1,5 раза выше, чем при размещении на эписомальной плазмиде. Результаты ОТ-кПЦР показали, что эписомальный вектор продуцирует гораздо более высокий уровень однонаправляющей РНК CRISPR RNA, чем интегративный вектор, независимо от системы экспрессии.Проверена эффективность активации комплекса dSpCas9 и каркасной РНК-рекрутинга MCP-VP64. РНК каркаса, содержащая один дикий тип и шпильку F6MS2, дала 5,27 и 4,3-кратную активацию соответственно. Тем не менее, комбинация двух шпилек привела к 7,54 раза с самой высокой эффективностью активации.Четыре различных промотора использовались для стимулирования экспрессии трех видов анти-CRISPR второго типа, показывая, что они работают дозозависимым образом. Сильный промотор снижал уровень флуоресценции до 0,21, 0,11 и 0,13 от его значения соответственно. Кривая титрования показывает, что цепь ведет себя как узелковая походка с отношением включения и выключения, приближающимся к 2,3.Анти-CRISPR A пятого типа снижает экспрессию флуоресценции как denAS-Cas12a, так и dLB-Cas12a в качестве активаторов с 19% до 71%Была изучена связь между активаторами и репрессорами, где Acr-VA демонстрировал большие колебания в своих характеристиках при продуцировании pGAL1 при pTEF1, а генетический CYC1t-pCYC1noTata пятого типа анти-CRISPR-A1 показал некоторое подавление только на голом dLB Cas12a. Машина FACS хрупкая, поэтому с ней следует обращаться осторожно. Клеточный раствор никогда не должен быть слишком плотным, а машина должна содержаться в чистоте.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Electrical Engineering

Bioengineering

Unit 1

DC Circuit Analysis

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Трехмерные модели культуры клеток для измерения действию тканевой жидкости потока на опухолевой инвазии сотовых

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Кучность биоактивные белки или пептидов на гидрогеля с помощью фотохимии биологических приложений

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

На основе агарозы ткани, подражая оптических фантомы для диффузного отражения спектроскопии

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Подход, основанный на капельки Microfluidic и микросферы ПЦР-амплификации для одноцепочечной ДНК ампликонов

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Многослойная микрофлюидная платформа для проведения длительного выражения генов без клеток

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Методы биомеханического тестирования In Vivo на брахиальном сплетении у неонатальных поросяток

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Электроуттинг на основе цифровой микрофлюидной платформы для автоматизированного фермента связанных Иммуносорбент Ассей

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Надежное проектирование и управление стабильными оптогенетическими генными цепями в клетках млекопитающих

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Восстановление подвижности на основе актина с помощью коммерчески доступных белков

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...