Name: gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins at JoVE.com

Vi vill tacka alla studenter i Synthetic Biology lab-SPST, TJU-för deras allmänna hjälp, tillsammans med Zhi Li och Xiangyang Zhang för deras hjälp i FACS-experiment.

1. Design och konstruktion av sgRNA/crRNA-uttryckskassetten
OBS: Det finns två typer av sgRNA / crRNA-uttryckskassetter: en-benämnd SNR5210-består av RNA-polymeras III-beroende SNR52-promotor, sgRNA / crRNA-sekvensen och SUP4-terminatorn; en annan-förkortad som RGR 11-består av RNA-polymeras II-beroende ADH1-promotor, RGR-strukturen (ribozym-guide RNA-ribozym) som innehåller två ribozymer (en hammarhuvudribozym-HH och en hepatit d...

<ol>
	<li>Marchisio, M. A., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+design+of+digital+synthetic+gene+circuits.">Automatic design of digital synthetic gene circuits.</a> PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083 (2011).</li><li>Karnaugh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+map+method+for+synthesis+of+combinational+logic+circuits.">The map method for synthesis of combinational logic circuits.</a> Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).</li><li>Mandell, J. G., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+finger+tools:+custom+DNA-binding+domains+for+transcription+factors+and+nucleases.">Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases.</a> Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).</li><li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+effectors:+customizable+proteins+for+DNA+targeting.">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li><li>Drinnenberg, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+budding+yeast.">RNAi in budding yeast.</a> Science. 326 (5952), 544-550 (2009).</li><li>Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+logic+circuits+in+yeast+with+CRISPR-dCas9+NOR+gates.">Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates.</a> Nature Communications. 8, 15459 (2017).</li><li>Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+and+multifunctional+eukaryotic+transcription+factors+based+on+CRISPR/Cas.">Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas.</a> ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).</li><li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-mediated+control+of+gene+editing+and+synthetic+circuits+in+eukaryotic+cells.">Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 194 (2019).</li><li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast.">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131 (1), 129-134 (1993).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gao, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-processing+of+ribozyme-flanked+RNAs+into+guide+RNAs+in+vitro+and+in+vivo+for+CRISPR-mediated+genome+editing.">Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Yu, L., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+synthetic+transcriptional+networks+harnessing+dCas12a+and+Type+V-A+anti-CRISPR+proteins.">Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).</li><li>Zhang, Y., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bare+dSpCas9,+scaffold+gRNA,+and+type+II+anti-CRISPR+proteins+highly+favors+the+control+of+gene+expression+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).</li><li>Sheff, M. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cassettes+for+fluorescent+protein+tagging+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).</li><li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRdirect:+software+for+designing+CRISPR/Cas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites.">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li><li>Chee, M. K., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+redesigned+pRS+plasmid+shuttle+vectors+for+genetic+manipulation+of+Saccharomyces+cerevisiae.">New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides.">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. Fourth edition. , (2012).</li><li>Sanger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+nucleotide+sequences+in+DNA.">Determination of nucleotide sequences in DNA.</a> Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Zalatan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+complex+synthetic+transcriptional+programs+with+CRISPR+RNA+scaffolds.">Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds.</a> Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).</li><li>Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+terminators+be+used+as+insulators+into+yeast+synthetic+gene+circuits.">Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits.</a> Journal of Biological Engineering. 10, 19 (2016).</li><li>Rauch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CRISPR-Cas9+with+bacteriophage+proteins.">Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins.</a> Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).</li><li>Hynes, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+from+a+virulent+streptococcal+phage+inhibits+Streptococcus+pyogenes+Cas9.">An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9.</a> Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).</li><li>Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+natural+CRISPR-Cas12a+inhibitors.">Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors.</a> Science. 362 (6411), 236-239 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).</li><li>Hahne, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flowCore:+a+Bioconductor+package+for+high+throughput+flow+cytometry.">flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 106 (2009).</li><li>Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-based+biosensors+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae.</a> Journal of Biological Engineering. 12, 11 (2018).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+protein+disables+type+V+Cas12a+by+acetylation.">An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).</li></ol>

Protokollet visade ett möjligt komplett arbetsflöde för syntetiska gendigitala kretsar, efter "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) biologiska ingenjörscykel och avseende både torrlaboratorie- och våtlaboratorieexperiment. Här fokuserade vi på CRISPR-Cas-systemet, främst dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a och motsvarande anti-CRISPR-proteiner, genom att designa och bygga i S. cerevisiae små transkriptionsnätverk. Några av dem efterliknade booleska grindar, som är de grundläggande komponenterna i digitala k...

År 2011 föreslog forskare en beräkningsmetod och utvecklade en motsvarande mjukvara för automatisk design av digitala syntetiska genkretsar1. En användare var tvungen att ange antalet ingångar (tre eller fyra) och fylla i kretsens sanningstabell; Detta gav all nödvändig information för att härleda kretsstrukturen med hjälp av tekniker från elektronik. Sanningstabellen översattes till två booleska formler via Karnaugh-kartmetoden2. Varje boolesk formel består av satser som beskriver logiska operationer (summa eller multiplikation) bland (en del av) kretsingångarna och deras negationer (literalerna). Satser summeras i sin tur antingen (OR) eller multipliceras (AND) för att beräkna kretsutgången. Varje krets kan realiseras enligt någon av dess två motsvarande formler: en skriven i POS-form (produkt av summor) och den andra i SOP-representation (summa av produkter). Den förra består av en multiplikation av satser (dvs. booleska grindar) som innehåller en logisk summa av literalerna. Det senare är däremot en summa av satser där bokstaverna multipliceras.
Elektriska kretsar kan realiseras, på en brödbräda, genom att fysiskt koppla olika grindar tillsammans. Den elektriska strömmen tillåter utbyte av signaler mellan grindar, vilket leder till beräkning av utgången.
I biologi är situationen mer komplex. En boolesk grind kan realiseras som en transkriptionsenhet (TU; dvs sekvensen "promotorkodande regionterminator" inuti eukaryota celler), där transkription eller översättning (eller båda) regleras. Således etablerar åtminstone två typer av molekyler en biologisk ledning: transkriptionsfaktorproteinerna och de icke-kodande, antisens-RNA1.
En gendigital krets är organiserad i två eller tre lager av grindar, nämligen: 1) ingångsskiktet, som är tillverkat av JA (buffert) och INTE grindar och omvandlar ingångskemikalierna till ledningsmolekyler; 2) det inre skiktet, som består av lika många TU som det finns klausuler i motsvarande booleska formel. Om kretsen är utformad enligt SOP-formeln kommer varje klausul i det interna skiktet att producera kretsutgången (t.ex. fluorescens) i en så kallad distribuerad utgångsarkitektur. Om produkten av summa (POS) formel används, krävs ett 3) slutligt lager, vilket kommer att innehålla en enda multiplikativ grind som samlar ledningsmolekylerna från det inre skiktet.
Sammantaget kan i syntetisk biologi många olika system utformas för samma krets. De skiljer sig åt i antal och typ av både TU och ledningsmolekyler. För att välja den enklaste lösningen som ska implementeras i jästceller är varje kretsdesign associerad med en komplexitetspoäng S, definierad som
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;">
där A representerar antalet aktivatorer, R representerar antalet repressorer och a är mängden antisens-RNA-molekyler. Om antingen aktivatorer eller repressorer saknas från kretsen är deras bidrag till S noll. Därför är det svårare att realisera ett kretsschema i labbet (högt S) när det kräver ett stort antal ortogonala transkriptionsfaktorer. Detta innebär att nya aktivatorer och repressorer ska konstrueras de novo för att realisera hela ledningarna inuti de digitala kretsarna. I princip kan nya DNA-bindande proteiner monteras genom att använda zinkfingerproteiner3 och TAL-effektorer4 som mallar. Detta alternativ verkar dock för svårt och tidskrävande; därför bör man förlita sig mest på små RNA och translationsreglering för att slutföra komplexa genkretsar.
Ursprungligen utvecklades denna metod för att tillverka digitala kretsar i bakterier. I eukaryota celler, istället för antisens-RNA, är det faktiskt mer lämpligt att tala om mikroRNA (miRNA) eller små störande RNA (siRNA)5. RNAi-vägen är emellertid inte närvarande i jäst S. cerevisiae. Därför bör man välja helt transkriptionella nätverk. Antag att en krets behöver fem aktivatorer och fem repressorer; dess komplexitetspoäng skulle vara S = 32. Kretskomplexiteten kan minskas genom att ersätta de 10 transkriptionsfaktorerna med en enda dCas96 (nukleasbrist Cas9) smält till en aktiveringsdomän (AD). Som visas i7 fungerar dCas9-AD som en repressor i jäst när man binder en promotor mellan TATA-boxen och TSS (transkriptionsstartplatsen) och som en aktivator när den binds väl uppströms TATA-boxen. Således kan man ersätta 10 transkriptionsfaktorer med ett enda dCas9-AD-fusionsprotein och 10 sgRNA (single guide RNA) för en total komplexitetspoäng på S = 11. Det är snabbt och enkelt att syntetisera tio sgRNA, medan, som tidigare kommenterats, montering av 10 proteiner skulle kräva mycket längre och mer komplicerat arbete.
Alternativt kan man använda två ortogonala dCas-proteiner (t.ex. dCas9 och dCas12a): ett för att smälta till en AD, och det andra naket eller i kombination med en repressionsdomän. Komplexitetspoängen skulle öka med endast en enhet (S = 12). Därför är CRISPR-dCas-system nyckeln till konstruktionen av mycket invecklade digitala genkretsar i S. cerevisiae.
Denna artikel karakteriserar djupt effektiviteten hos både dCas9- och dCas12a-baserade repressorer och aktivatorer i jäst. Resultaten visar att de inte kräver en hög mängd sgRNA för att optimera sin aktivitet, så episomala plasmider undviks företrädesvis. Dessutom är dCas9-baserade aktivatorer mycket effektivare när man använder ett ställnings-RNA (scRNA) som rekryterar kopior av VP64 AD. Däremot fungerar dCas12a bra när den smälts direkt till den starka VPR AD. Dessutom kräver en syntetisk aktiverad promotor ett varierande antal målplatser, beroende på aktivatorns konfiguration (t.ex. tre vid användning av dCas12a-VPR, sex för dCas9-VP64 och endast en med dCas9 och ett scRNA). Som en repressor verkar dCas12a mer skarp när den binder kodningsregionen snarare än promotorn.
Som en nackdel interagerar dock CRISPR-dCas9/dCas12a inte direkt med kemikalier. Därför kanske de inte är till någon nytta i inmatningslagret. Av denna anledning har alternativa booleska grindkonstruktioner innehållande anti-CRISPR-proteiner (Acrs) undersökts. Acrs verkar på (d) Cas-proteiner och hämmar deras arbete8. Därför är de ett sätt att modulera aktiviteten hos CRISPR-(d) Cas-system. Denna uppsats analyserar grundligt interaktionerna mellan typ II Acrs och (d) Cas9, liksom typ V Acrs och (d) Cas12a i S. cerevisiae. Eftersom Acrs är mycket mindre än Cas-proteiner, byggdes en INTE grind som svarar på östrogen β-östradiol genom att smälta den hormonbindande domänen hos den humana östrogenreceptorn9-HBD (hER) till AcrIIA4. Dessutom realiserades en handfull JA- och NOT-grindar som uttryckte dCas12a(-AD) konstitutivt och AcrVA vid induktion med galaktos. För närvarande tjänar dessa grindar endast som ett bevis på konceptet. Men de representerar också det första steget mot en djup omprövning av algoritmen för att utföra den beräkningsautomatiska designen av syntetiska gendigitala kretsar i jästceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mL PCR 8-strip tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>403112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose-molecular biology grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>75510-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA gel extraction kit</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-GX-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSuite CS&#38;T research beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>650621</td>
			<td>Fluorescent beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSVerse flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall ST 16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli competent cells (Strain DH5&#945;)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18263-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL select Western Blotting detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd</td>
			<td>JY300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat 8-strip caps</td>
			<td>NEST</td>
			<td>406012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene synthesis company</td>
			<td>Azenta Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiFiScript cDNA synthesis kit</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2569M</td>
			<td>Kit used in step 6.2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysate solution (Zymolyase)</td>
			<td>zymoresearch</td>
			<td>E1004-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;10 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;1000 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;200 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII403</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII404</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII405</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII406</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII424</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTPGI_dSpCas9_VP64&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-fidelity DNApolymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-Acc65I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-SacI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 96&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td>Real-Time PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae CEN.PK2-1C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; 
			MAL2-8c; SUC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem-Loop Kit</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>AG0502</td>
			<td>Kit used in step 6.2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>186-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 Exonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR820Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YeaStar RNA kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins

Syntetiska genbooleska grindar och digitala kretsar har ett brett spektrum av applikationer, från medicinsk diagnostik till miljövård. Upptäckten av CRISPR-Cas-systemen och deras naturliga hämmare - anti-CRISPR-proteinerna (Acrs) - ger ett nytt verktyg för att designa och implementera digitala genkretsar in vivo . Här beskriver vi ett protokoll som följer idén om "Design-Build-Test-Learn" biologisk ingenjörscykel och använder dCas9 / dCas12a tillsammans med deras motsvarande Acrs för att etablera små transkriptionsnätverk, av vilka några beter sig som booleska grindar, i Saccharomyces cerevisiae. Dessa resultat pekar ut egenskaperna hos dCas9/dCas12a som transkriptionsfaktorer. I synnerhet, för att uppnå maximal aktivering av genuttryck, måste dSpCas9 interagera med ett konstruerat ställnings-RNA som samlar in flera kopior av VP64-aktiveringsdomänen (AD). Däremot ska dCas12a smältas samman vid C-änden med den starka VP64-p65-Rta (VPR) AD. Dessutom förstärks inte aktiviteten hos båda Cas-proteinerna genom att öka mängden sgRNA / crRNA i cellen. Den här artikeln förklarar också hur man bygger booleska grindar baserat på CRISPR-dCas-Acr interaktion. Den AcrIIA4-smälta hormonbindande domänen hos den humana östrogenreceptorn är kärnan i en NOT-grind som svarar på β-östradiol, medan AcrVAs syntetiserade av den inducerbara GAL1-promotorn tillåter att efterlikna både JA- och NOT-grindar med galaktos som ingång. I de senare kretsarna visade AcrVA5, tillsammans med dLbCas12a, det bästa logiska beteendet.

sgRNA/crRNA-uttryck av ett RNA-polymeras III-typ promotor Först behandlade detta arbete konstruktionen av transkriptionsaktiveringskretsen (krets 1) som visas i figur 1A. Den innehöll tre grundläggande komponenter: 1) genen som kodar för yEGFP (reportern), som föregicks av en serie olika syntetiska promotorer som gav målplatser för dCas9/dCas12a-AD; 2) en jästkodonoptimerad version av dCas9 eller dCas12a smält till en aktiveringsdomän (VP64 respektive VPR) och i...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins at JoVE.com

Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

CRISPR-Cas-system och anti-CRISPR-proteiner integrerades i schemat av booleska grindar i Saccharomyces cerevisiae. De nya små logiska kretsarna visade god prestanda och fördjupade förståelsen för både dCas9/dCas12a-baserade transkriptionsfaktorer och egenskaperna hos anti-CRISPR-proteiner.

Digitala genkretsar baserade på CRISPR-Cas-system och anti-CRISPR-proteiner

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

Vårt protokoll förklarar hur man designar, bygger och analyserar digitala jästgenkretsar som använder typ två och typ fem CRISPR dCas-system och motsvarande anti-CRISPR-proteiner. Det är monteringsvistelse eftersom det samlar noll standardprocedurer för att montera och testa syntetiska transkriptionsnätverk i tjänster. För att börja, förbered en reaktionsblandning innehållande 20 till 40 nanogram DNA-mall, en mikroliter framåtprimer, en mikroliter omvänd primer, fem mikroliter DNTP-blandning, 0,5 mikroliter DNA-polymeras, 10 mikroliter 5x DNA-polymerasreaktionsbuffert och dubbeldestillerat vatten upp till en total volym av 50 mikroliter.Förstärk DNA-sekvenserna med hjälp av touchdown PCR-programmet på en termocykler som beskrivs i manuskriptet. Isolera PCR-produkterna via gelelektrofores och späd DNA-sekvenserna från agarosgelen via ett DNA-gelextraktionskit. Använd Gibson-monteringsmetoden och sätt in de renade PCR-produkterna i den uppskurna skyttelvektorn genom att släppa in den ekvimolära DNA-blandningen vid 50 grader Celsius i en timme.Konstruera dCas12a-acceptervektorn via touchdown PCR och Gibson-monteringsmetoden som visats tidigare. Sätt in jästkodonoptimerade dCas12a-proteiner i de två nykonstruerade acceptorvektorerna via matsmältning med BamH1 och Xhol1 och ligering med T4 DNA-ligas. På samma sätt konstruera plasmiderna baserat på pRS2403-skyttelvektorn för att uttrycka anti-CRISPR-proteinerna via touchdown PCR och Gibson-monteringsmetoden.För att utföra mikroskopicelldetektering, placera två mikroliter av celllösningen på en glasskiva och täck den med en täckglas. Observera cellerna under ett fluorescensmikroskop genom att slå på den fluorescerande ljuskällan, mikroskopet och datorn. När du har skrivit ner numret för fluorescerande ljuskälla öppnar du mikroskopprogramvaran på datorn.Sätt bilden på mikroskopsteget och välj 40x objektivlinsen medan du observerar cellerna under det gröna ljuset. Flytta kursens fokusratt tills konturen av jästceller visas och den fina fokusratten för att fokusera cellerna. För att upptäcka cellerna, efter att ha stängt mikroskopfältet, växla till datorskärmen och klicka på live.Vänta i tre till fem sekunder. Klicka på fånga för att ta en bild och spara bilden. Stäng sedan av datorn, mikroskopet och lysrörskällan.Slå på FACS-maskinen 20 minuter före mätningarna för att värma upp lasern och blanda 20 mikroliter av cellkulturen med 300 mikroliter dubbeldestillerat vatten. Kör FACS-programvaran på datorn som är ansluten till FACS-maskinen och skapa ett nytt experiment. Ställ sedan in mätparametrarna.Välj sedan filtret enligt excitations- och emissionsvåglängderna för proverna och ställ in förvärvscellnumret till 10 000. Justera FITC-filterspänningen genom att mäta intensiteten hos fluorescerande pärlor, se till att den relativa skillnaden i kulornas intensitet mellan två på varandra följande experiment inte överstiger 5%Tvätta maskinen med dubbeldestillerat vatten i några sekunder för att ta bort eventuella överflödiga pärlor. Mät provets fluorescensintensitet och klicka på förhandsgranskningen medan du väntar i tre till fem sekunder för provinjektionsstabilitet.Klicka slutligen på förvärva. Mät pärlorna igen i slutet av experimentet. Efter att ha kontrollerat om den relativa skillnaden mellan de två pärlmätningarna överstiger 5%Exportera FACS-data som FCS-filer.Öppna R studio och läs in skriptet BDverse_analysis. R för att analysera FCS-filerna. Ange experimentnamnet som ename, katalogsökvägen där FCS-filerna lagras som dir_d och resultatfilerna skapas som dir_r.Ställ sedan in fluorescenskanalen. Ange antalet prover som mättes. Måtten på punktdiagram och den maximala längden på x- och y-axeln för stapeldiagram och låddiagram.Välj bedömningsmetod genom att ta bort hashtaggen från motsvarande rader. Välj det flowSet-objekt som är grindat och som motsvarar den valda grindmetoden och punktdiagrammets upplösning, som ska vara minst lika med 256. Avkommentera de två filtreringsinstruktionerna för att ta bort mätningar där fluorescens är negativ och för att ta bort avvikande värden på grund av andra experiment som beskrivs i manuskriptet.Tryck på source och kör skriptet. Alla filer som innehåller resultaten från analysen skapas i dir_r. Den bästa aktiveringseffektiviteten för dSpCas9-VP64 uppnåddes när det fanns sex lexOp-målplatser på den syntetiska promotorn.Medan för dCas12a-VPR högsta aktiveringseffektivitet när tre kopior av lexOp sattes in i den syntetiska promotorn. Aktiveringen av CRISPR-RNA och enkelstyrt RNA lokaliserat på en integrativ plasmid var 1,4 till 2,4 och 1,1 till 1,5 gånger högre än när den placerades på en episomal plasmid. RT-qPCR-resultat visade att en episomal vektor producerade en mycket högre nivå av RNA CRISPR RNA med enkel guide än den integrativa vektorn, oavsett uttryckssystem.Aktiveringseffektiviteten hos den komplexa dSpCas9 och ställnings-RNA som rekryterar MCP-VP64 testades. Ställnings-RNA innehållande en enda vildtyp och F6MS2-hårnål gav en 5,27 respektive en 4,3-faldig aktivering. Kombinationen av de två hårnålarna resulterade dock i 7,54 gånger med högsta aktiveringseffektivitet.Fyra olika promotorer användes för att driva uttrycket av tre typer av typ två anti CRISPR som visar att de fungerade på ett dosberoende sätt. En stark promotor reducerade fluorescensnivån till 0,21, 0,11 respektive 0,13 av dess värde. Titreringskurvan visar att kretsen beter sig som en knutgång med ett på till av-förhållande som närmar sig 2,3.Typ fem anti-CRISPR A en minskar fluorescensuttrycket av både denAS-Cas12a och dLB-Cas12a som aktivatorer från 19% till 71%Förhållandet mellan aktivatorer och repressorer studerades där Acr-VA visade stora fluktuationer i dess prestanda när den producerades av pGAL1 under pTEF1 och genetisk CYC1t-pCYC1noTata typ fem anti-CRISPR-A1 visade viss repression endast på den nakna dLB Cas12a. FACS-maskinen är svag, därför ska den hanteras varsamt. Celllösningen får aldrig vara för tät och maskinen ska hållas ren.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Electrical Engineering

Bioengineering

Unit 1

DC Circuit Analysis

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tredimensionell cellkulturmodell för mätning av effekterna av interstitialvätska Flow på Tumörcellinvasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Undersöka Receptor-ligand System av Cellulosome med AFM-baserad Single-molekyl Force spektroskopi

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Mönstring bioaktiva proteiner eller peptider på Hydrogel med fotokemi för biologiska tillämpningar

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

Agaros-baserade vävnad härma optiska fantomer för diffus reflektans spektroskopi

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

En Droplet-baserade mikroflödessystem strategi och Microsphere-PCR-amplifiering för enkelsträngat DNA amplikoner

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

En Multilayer Microfluidic plattform för ledning av långvarig cell-fri genuttryck

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Metoder för in vivo biomekaniska tester på brachial plexus i neonatal smågrisar

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Elektrowetting-baserad digital mikrofluidik plattform för automatiserad enzym-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Tillförlitligt konstruera och kontrollera stabila optogenetiska genkretsar i däggdjursceller

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Rekonstituering av aktinbaserad rörlighet med kommersiellt tillgängliga proteiner

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...