Name: gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins
Uploaded: 2022-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins at JoVE.com

Sentetik Biyoloji laboratuvarı SPST, TJU'nun tüm öğrencilerine genel yardımları için, Zhi Li ve Xiangyang Zhang ile birlikte FACS deneylerindeki yardımları için teşekkür etmek istiyoruz.

1. sgRNA/crRNA ekspresyon kasetinin tasarımı ve yapımı
NOT: İki tür sgRNA/crRNA ekspresyon kaseti vardır: bir terimli SNR5210-, RNA polimeraz III'e bağımlı SNR52 promotörü, sgRNA/crRNA dizisi ve SUP4 sonlandırıcısından oluşur; RGR11 olarak kısaltılan bir diğeri, RNA polimeraz II'ye bağımlı ADH1 promotörü, iki ribozim (bir çekiç kafalı ribozim-HH ve bir hepatit delta virüsü ribozim-HDV...

<ol>
	<li>Marchisio, M. A., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+design+of+digital+synthetic+gene+circuits.">Automatic design of digital synthetic gene circuits.</a> PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083 (2011).</li><li>Karnaugh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+map+method+for+synthesis+of+combinational+logic+circuits.">The map method for synthesis of combinational logic circuits.</a> Transactions of the American Institute of Electrical Engineers. 72 (9), 593-599 (1953).</li><li>Mandell, J. G., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+finger+tools:+custom+DNA-binding+domains+for+transcription+factors+and+nucleases.">Zinc finger tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases.</a> Nucleic Acids Research. 34, 516-523 (2006).</li><li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+effectors:+customizable+proteins+for+DNA+targeting.">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li><li>Drinnenberg, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+in+budding+yeast.">RNAi in budding yeast.</a> Science. 326 (5952), 544-550 (2009).</li><li>Gander, M. W., Vrana, J. D., Voje, W. E., Carothers, J. M., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+logic+circuits+in+yeast+with+CRISPR-dCas9+NOR+gates.">Digital logic circuits in yeast with CRISPR-dCas9 NOR gates.</a> Nature Communications. 8, 15459 (2017).</li><li>Farzadfard, F., Perli, S. D., Lu, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+and+multifunctional+eukaryotic+transcription+factors+based+on+CRISPR/Cas.">Tunable and multifunctional eukaryotic transcription factors based on CRISPR/Cas.</a> ACS Synthetic Biology. 2 (10), 604-613 (2013).</li><li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-mediated+control+of+gene+editing+and+synthetic+circuits+in+eukaryotic+cells.">Anti-CRISPR-mediated control of gene editing and synthetic circuits in eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 194 (2019).</li><li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast.">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131 (1), 129-134 (1993).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gao, Y., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-processing+of+ribozyme-flanked+RNAs+into+guide+RNAs+in+vitro+and+in+vivo+for+CRISPR-mediated+genome+editing.">Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 56 (4), 343-349 (2014).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Yu, L., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+synthetic+transcriptional+networks+harnessing+dCas12a+and+Type+V-A+anti-CRISPR+proteins.">Saccharomyces cerevisiae synthetic transcriptional networks harnessing dCas12a and Type V-A anti-CRISPR proteins.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (4), 870-883 (2021).</li><li>Zhang, Y., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bare+dSpCas9,+scaffold+gRNA,+and+type+II+anti-CRISPR+proteins+highly+favors+the+control+of+gene+expression+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Interaction of bare dSpCas9, scaffold gRNA, and type II anti-CRISPR proteins highly favors the control of gene expression in the yeast S. cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (1), 176-190 (2022).</li><li>Sheff, M. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cassettes+for+fluorescent+protein+tagging+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 21 (8), 661-670 (2004).</li><li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRdirect:+software+for+designing+CRISPR/Cas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites.">CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li><li>Chee, M. K., Haase, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+redesigned+pRS+plasmid+shuttle+vectors+for+genetic+manipulation+of+Saccharomyces+cerevisiae.">New and redesigned pRS plasmid shuttle vectors for genetic manipulation of Saccharomyces cerevisiae.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 2 (5), 515-526 (2012).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides.">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. Fourth edition. , (2012).</li><li>Sanger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+nucleotide+sequences+in+DNA.">Determination of nucleotide sequences in DNA.</a> Science. 214 (4526), 1205-1210 (1981).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Zalatan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+complex+synthetic+transcriptional+programs+with+CRISPR+RNA+scaffolds.">Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds.</a> Cell. 160 (1-2), 339-350 (2015).</li><li>Song, W., Li, J., Liang, Q., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+terminators+be+used+as+insulators+into+yeast+synthetic+gene+circuits.">Can terminators be used as insulators into yeast synthetic gene circuits.</a> Journal of Biological Engineering. 10, 19 (2016).</li><li>Rauch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CRISPR-Cas9+with+bacteriophage+proteins.">Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins.</a> Cell. 168 (1-2), 150-158 (2017).</li><li>Hynes, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+from+a+virulent+streptococcal+phage+inhibits+Streptococcus+pyogenes+Cas9.">An anti-CRISPR from a virulent streptococcal phage inhibits Streptococcus pyogenes Cas9.</a> Nature Microbiology. 2 (10), 1374-1380 (2017).</li><li>Watters, K. E., Fellmann, C., Bai, H. B., Ren, S. M., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+natural+CRISPR-Cas12a+inhibitors.">Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors.</a> Science. 362 (6411), 236-239 (2018).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 33 (20), 179 (2005).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).</li><li>Hahne, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=flowCore:+a+Bioconductor+package+for+high+throughput+flow+cytometry.">flowCore: a Bioconductor package for high throughput flow cytometry.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 106 (2009).</li><li>Li, J., Xu, Z., Chupalov, A., Marchisio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CRISPR-based+biosensors+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Anti-CRISPR-based biosensors in the yeast S. cerevisiae.</a> Journal of Biological Engineering. 12, 11 (2018).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anti-CRISPR+protein+disables+type+V+Cas12a+by+acetylation.">An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (4), 308-314 (2019).</li></ol>

Protokol, "Tasarla-Yap-Test Et-Öğren" (DBTL) biyolojik mühendislik döngüsünü takiben ve hem kuru laboratuvar hem de ıslak laboratuvar deneyleriyle ilgili sentetik gen dijital devreleri için olası bir tam iş akışı gösterdi. Burada, CRISPR-Cas sistemine, özellikle dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a ve buna karşılık gelen anti-CRISPR proteinlerine, S. cerevisiae küçük transkripsiyonel ağlarını tasarlayarak ve inşa ederek odaklandık. Bazıları dijital devrelerin temel bileşenleri olan Boole...

2011 yılında, araştırmacılar hesaplamalı bir yöntem önerdiler ve dijital sentetik gen devrelerinin otomatik tasarımı için karşılık gelen bir yazılım parçası geliştirdiler1. Bir kullanıcının giriş sayısını (üç veya dört) belirtmesi ve devre doğruluk tablosunu doldurması gerekiyordu; Bu, elektronikten teknikler kullanarak devre yapısını türetmek için gerekli tüm bilgileri sağladı. Doğruluk tablosu, Karnaugh harita yöntemi2 aracılığıyla iki Boole formülüne çevrildi. Her Boole formülü, devre girişleri ve bunların olumsuzlamaları (değişmez değerler) arasındaki (bir kısmı) mantık işlemlerini (toplama veya çarpma) tanımlayan yan tümcelerden oluşur. Yan tümceler, sırasıyla, devre çıkışını hesaplamak için ya toplanır (OR) ya da çarpılır (AND). Her devre, karşılık gelen iki formülden herhangi birine göre gerçekleştirilebilir: biri POS (toplamların ürünü) formunda, diğeri SÇP (ürünlerin toplamı) temsilinde yazılmıştır. İlki, değişmez değerlerin mantıksal bir toplamını içeren cümleciklerin (yani, Boole kapıları) çarpımından oluşur. İkincisi, aksine, değişmez değerlerin çarpıldığı bir cümle toplamıdır.
Elektrik devreleri, bir breadboard üzerinde, farklı kapıları fiziksel olarak birbirine bağlayarak gerçekleştirilebilir. Elektrik akımı, kapılar arasında sinyal alışverişine izin verir ve bu da çıkışın hesaplanmasına yol açar.
Biyolojide durum daha karmaşıktır. Bir Boole kapısı, transkripsiyon veya translasyonun (veya her ikisinin) düzenlendiği bir transkripsiyon birimi (TU; yani, ökaryotik hücreler içindeki "promotör-kodlayıcı bölge-sonlandırıcı" dizisi) olarak gerçekleştirilebilir. Böylece, en az iki tür molekül biyolojik bir kablolama kurar: transkripsiyon faktörü proteinleri ve kodlamayan, antisens RNA'lar1.
Bir gen dijital devresi, iki veya üç kapı katmanı halinde düzenlenir, yani: 1) EVET (tampon) ve NOT kapılarından oluşan ve giriş kimyasallarını kablolama moleküllerine dönüştüren giriş katmanı; 2) karşılık gelen Boole formülünde yan tümceler olduğu kadar TU'dan oluşan iç katman. Devre SÇP formülüne göre tasarlanmışsa, iç katmandaki her cümle, dağıtılmış çıkış mimarisi olarak adlandırılan bir devrede devre çıkışını (örneğin, floresan) üretecektir. Toplam (POS) formülünün ürünü kullanılırsa, kablolama moleküllerini iç katmandan toplayan tek bir çarpma kapısı içerecek olan 3) son katman gereklidir.
Genel olarak, sentetik biyolojide, aynı devre için birçok farklı şema tasarlanabilir. Hem TU'ların hem de kablolama moleküllerinin sayısı ve türü bakımından farklılık gösterirler. Maya hücrelerinde uygulanacak en kolay çözümü seçmek için, her devre tasarımı, şu şekilde tanımlanan bir karmaşıklık skoru S ile ilişkilendirilir:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64539/64539eq01.jpg" style="margin: auto;">
burada A, aktivatörlerin sayısını, R, baskılayıcıların sayısını ve A, antisens RNA moleküllerinin miktarını temsil eder. Aktivatörler veya baskılayıcılar devrede yoksa, S'ye katkıları sıfırdır. Bu nedenle, çok sayıda ortogonal transkripsiyon faktörü gerektirdiğinde laboratuarda bir devre şeması (yüksek S) gerçekleştirmek daha zordur. Bu, dijital devrelerin içindeki tüm kablolamayı gerçekleştirmek için yeni aktivatörlerin ve baskılayıcıların de novo olarak tasarlanacağı anlamına gelir. Prensip olarak, yeni DNA bağlayıcı proteinler, şablon olarak Çinko Parmak proteinleri3 ve TAL efektörleri4 kullanılarak birleştirilebilir. Ancak, bu seçenek çok zorlu ve zaman alıcı görünüyor; bu nedenle, karmaşık gen devrelerini sonlandırmak için çoğunlukla küçük RNA'lara ve çeviri düzenlemesine güvenilmelidir.
Başlangıçta, bu yöntem bakterilerde dijital devreler üretmek için geliştirilmiştir. Gerçekten de, ökaryotik hücrelerde, antisens RNA'lar yerine, mikroRNA'lardan (miRNA'lar) veya küçük müdahale eden RNA'lardan (siRNA'lar)5 bahsetmek daha uygundur. Bununla birlikte, RNAi yolu maya S. cerevisiae'de mevcut değildir. Bu nedenle, kişi tamamen transkripsiyonel ağları tercih etmelidir. Bir devrenin beş aktivatöre ve beş baskıcıya ihtiyacı olduğunu varsayalım; karmaşıklık puanı S = 32 olacaktır. Devre karmaşıklığı, 10 transkripsiyon faktörünün bir aktivasyon alanına (AD) kaynaşmış tek bir dCas96 (nükleaz eksikliği Cas9) ile değiştirilmesiyle azaltılabilir. 7'de gösterildiği gibi, dCas9-AD, TATA kutusu ile TSS (transkripsiyon başlangıç bölgesi) arasında bir promotör bağlarken mayada bir baskılayıcı olarak ve TATA kutusunun yukarı akışını iyi bağlarken bir aktivatör olarak çalışır. Böylece, 10 transkripsiyon faktörünü, tek bir dCas9-AD füzyon proteini ve 10 sgRNA (tek kılavuz RNA'lar) ile S = 11'lik toplam karmaşıklık skoru için değiştirebiliriz. On sgRNA'yı sentezlemek hızlı ve kolaydır, oysa daha önce yorumlandığı gibi, 10 proteinin montajı çok daha uzun ve daha karmaşık bir çalışma gerektirecektir.
Alternatif olarak, biri iki ortogonal dCas proteini (örneğin, dCas9 ve dCas12a) kullanabilir: biri bir AD ile kaynaşmak için, diğeri çıplak veya bir baskı alanı ile kombinasyon halinde. Karmaşıklık puanı yalnızca bir birim artacaktır (S = 12). Bu nedenle, CRISPR-dCas sistemleri, S. cerevisiae'de çok karmaşık gen dijital devrelerinin inşasının anahtarıdır.
Bu makale, mayadaki hem dCas9- hem de dCas12a bazlı baskılayıcıların ve aktivatörlerin verimliliğini derinden karakterize etmektedir. Sonuçlar, aktivitelerini optimize etmek için yüksek miktarda sgRNA talep etmediklerini göstermektedir, bu nedenle epizomal plazmidlerden tercihen kaçınılmaktadır. Dahası, dCas9 tabanlı aktivatörler, VP64 AD'nin kopyalarını toplayan bir iskele RNA'sı (scRNA) kullanıldığında çok daha etkilidir. Buna karşılık, dCas12a doğrudan güçlü VPR AD ile kaynaştırıldığında iyi çalışır. Ayrıca, sentetik olarak aktive edilmiş bir promotör, aktivatörün konfigürasyonuna bağlı olarak değişken sayıda hedef bölge gerektirir (örneğin, dCas12a-VPR kullanırken üç, dCas9-VP64 için altı ve dCas9 ve scRNA ile sadece bir tane). Bir baskılayıcı olarak, dCas12a, promotörden ziyade kodlama bölgesini bağlarken daha keskin görünür.
Bununla birlikte, bir dezavantaj olarak, CRISPR-dCas9 / dCas12a kimyasallarla doğrudan etkileşime girmez. Bu nedenle, giriş katmanında hiçbir işe yaramayabilirler. Bu nedenle, anti-CRISPR proteinleri (Acrs) içeren alternatif Boole kapısı tasarımları araştırılmıştır. Akr'ler (d)Cas proteinleri üzerinde etkili olur ve çalışmalarını engeller8. Bu nedenle, CRISPR-(d)Cas sistemlerinin aktivitesini modüle etmenin bir yoludur. Bu yazıda S. cerevisiae'de tip II Acrs ve (d)Cas9 ile tip V Acrs ve (d)Cas12a arasındaki etkileşimler kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir. Acrs, Cas proteinlerinden çok daha küçük olduğundan, östrojen β-östradiol'e yanıt veren bir NOT kapısı, insan östrojen reseptörü 9-HBD'nin (hER) hormon bağlama alanını AcrIIA4'e kaynaştırarak inşa edilmiştir. Ayrıca, dCas12a(-AD)'yi yapısal olarak ifade eden bir avuç EVET ve DEĞİL kapısı ve galaktoz ile indüksiyon üzerine AcrVA'lar gerçekleştirildi. Şu anda, bu kapılar sadece bir kavram kanıtı olarak hizmet vermektedir. Bununla birlikte, aynı zamanda, maya hücrelerindeki sentetik gen dijital devrelerinin hesaplamalı otomatik tasarımını gerçekleştirmek için algoritmanın derinlemesine yeniden düşünülmesine yönelik ilk adımı temsil ederler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mL PCR 8-strip tubes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>403112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>CFT011500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose-molecular biology grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>75510-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyPrep DNA gel extraction kit</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-GX-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSuite CS&#38;T research beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>650621</td>
			<td>Fluorescent beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSVerse flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Sorvall ST 16R</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli competent cells (Strain DH5&#945;)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18263-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL select Western Blotting detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis apparatus</td>
			<td>Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd</td>
			<td>JY300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat 8-strip caps</td>
			<td>NEST</td>
			<td>406012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene synthesis company</td>
			<td>Azenta Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiFiScript cDNA synthesis kit</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2569M</td>
			<td>Kit used in step 6.2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysate solution (Zymolyase)</td>
			<td>zymoresearch</td>
			<td>E1004-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;10 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;1000 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips&#8212;200 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII403</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII404</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII405</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII406</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSII424</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>35466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTPGI_dSpCas9_VP64&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>49013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-fidelity DNApolymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-Acc65I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-SacI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzyme-XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche LightCycler 96&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td>Real-Time PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae CEN.PK2-1C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; 
			MAL2-8c; SUC2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem-Loop Kit</td>
			<td>SparkJade</td>
			<td>AG0502</td>
			<td>Kit used in step 6.2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>186-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T5 Exonuclease</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR820Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YeaStar RNA kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8875</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene digital circuits based on crispr-cas systems and anti-crispr proteins

Sentetik gen Boole kapıları ve dijital devreler, tıbbi teşhisten çevresel bakıma kadar geniş bir uygulama alanına sahiptir. CRISPR-Cas sistemlerinin ve doğal inhibitörlerinin (anti-CRISPR proteinleri (Acrs)) keşfi, in vivo gen dijital devrelerini tasarlamak ve uygulamak için yeni bir araç sağlar. Burada, "Tasarla-İnşa Et-Test Et-Öğren" biyolojik mühendislik döngüsü fikrini takip eden ve Saccharomyces cerevisiae'de bazıları Boole kapıları gibi davranan küçük transkripsiyonel ağlar oluşturmak için dCas9 / dCas12a'yı karşılık gelen Acrs ile birlikte kullanan bir protokolü açıklıyoruz. Bu sonuçlar, transkripsiyon faktörleri olarak dCas9 / dCas12a'nın özelliklerine işaret etmektedir. Özellikle, gen ekspresyonunun maksimum aktivasyonunu elde etmek için, dSpCas9'un VP64 aktivasyon alanının (AD) çoklu kopyalarını toplayan tasarlanmış bir iskele RNA'sı ile etkileşime girmesi gerekir. Buna karşılık, dCas12a, C terminusta, güçlü VP64-p65-Rta (VPR) AD ile kaynaştırılmalıdır. Ayrıca, her iki Cas proteininin aktivitesi, hücredeki sgRNA / crRNA miktarını artırarak arttırılmaz. Bu makalede ayrıca CRISPR-dCas-Acr etkileşimine dayalı Boole kapılarının nasıl oluşturulacağı açıklanmaktadır. İnsan östrojen reseptörünün AcrIIA4 kaynaşmış hormon bağlama alanı, β-östradiol'e yanıt veren bir NOT kapısının çekirdeğidir, oysa indüklenebilir GAL1 promotörü tarafından sentezlenen AcrVA'lar, hem EVET hem de NOT kapılarını bir girdi olarak galaktoz ile taklit etmeye izin verir. İkinci devrelerde, AcrVA5, dLbCas12a ile birlikte en iyi mantık davranışını gösterdi.

RNA polimeraz III-tipi promotör tarafından sgRNA/crRNA ekspresyonu İlk olarak, bu çalışma Şekil 1A'da gösterilen transkripsiyonel aktivasyon devresinin (devre 1) mühendisliğini ele almıştır. Üç temel bileşen içeriyordu: 1) dCas9 / dCas12a-AD için hedef bölgeler sağlayan bir dizi farklı sentetik promotörden önce gelen yEGFP (raporlayıcı) için kodlayan gen; 2) dCas9 veya dCas12a'nın maya kodonu için optimize edilmiş bir versiyonu, bir aktivasyon...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins at JoVE.com

Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

CRISPR-Cas sistemleri ve anti-CRISPR proteinleri, Saccharomyces cerevisiae'deki Boole kapılarının şemasına entegre edildi. Yeni küçük mantık devreleri iyi performans gösterdi ve hem dCas9 / dCas12a tabanlı transkripsiyon faktörlerinin hem de anti-CRISPR proteinlerinin özelliklerinin anlaşılmasını derinleştirdi.

CRISPR-Cas Sistemlerine ve Anti-CRISPR Proteinlerine Dayalı Gen Dijital Devreleri

Synthetic gene Boolean gates and digital circuits have a broad range of applications, from medical diagnostics to environmental care. The discovery of the ...

Protokolümüz, tip iki ve tip beş CRISPR dCas sistemlerini ve buna karşılık gelen anti-CRISPR proteinlerini kullanan maya geni dijital devrelerinin nasıl tasarlanacağını, oluşturulacağını ve analiz edileceğini açıklamaktadır. Hizmetlerdeki sentetik transkripsiyonel ağları bir araya getirmek ve test etmek için sıfır standart prosedür topladığı için montaj kalışıdır. Başlamak için, 20 ila 40 nanogram DNA şablonu, bir mikrolitre ileri astar, bir mikrolitre ters astar, beş mikrolitre DNTP karışımı, 0.5 mikrolitre DNA polimeraz, 10 mikrolitre 5x DNA polimeraz reaksiyon tamponu ve toplam 50 mikrolitre hacme kadar çift damıtılmış su içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayın.Makalede açıklandığı gibi bir termosikler üzerindeki touchdown PCR programını kullanarak DNA dizilerini güçlendirin. PCR ürünlerini jel elektroforezi yoluyla izole edin ve DNA dizilerini agaroz jelinden bir DNA jel ekstraksiyon kiti ile seyreltin. Gibson montaj yöntemini kullanarak, saflaştırılmış PCR ürünlerini, ekomolar DNA karışımını bir saat boyunca 50 santigrat derecede bırakarak kes-açık mekik vektörüne yerleştirin.Daha önce gösterildiği gibi touchdown PCR ve Gibson montaj yöntemi ile dCas12a alıcı vektörünü oluşturun. Maya kodonu optimize edilmiş dCas12a proteinlerini, BamH1 ve Xhol1 ile sindirim ve T4 DNA ligaz ile ligasyon yoluyla yeni inşa edilen iki alıcı vektöre yerleştirin. Benzer şekilde, anti-CRISPR proteinlerini touchdown PCR ve Gibson montaj yöntemi ile ifade etmek için pRS2403 mekik vektörüne dayanan plazmidleri oluşturun.Mikroskopi hücresi tespiti yapmak için, hücre çözeltisinin iki mikrolitresini bir cam slayt üzerine yerleştirin ve bir kapak kayması ile örtün. Floresan ışık kaynağını, mikroskobu ve bilgisayarı açarak floresan mikroskobu altındaki hücreleri gözlemleyin. Floresan ışık kaynağı numarasını yazdıktan sonra, bilgisayardaki mikroskop yazılımını açın.Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve yeşil ışık altındaki hücreleri gözlemlerken 40x objektif lensi seçin. Maya hücrelerinin konturu görünene kadar kurs odak düğmesini ve hücreleri odaklamak için ince odak düğmesini hareket ettirin. Hücreleri algılamak için, mikroskop görüş alanını kapattıktan sonra bilgisayar ekranına geçin ve canlıya tıklayın.Üç ila beş saniye bekleyin. Fotoğraf çekmek ve fotoğrafı kaydetmek için yakalamaya tıklayın. Ardından, bilgisayarı, mikroskobu ve floresan ışık kaynağını kapatın.Lazeri ısıtmak için ölçümlerden 20 dakika önce FACS makinesini açın ve hücre kültürünün 20 mikrolitresini 300 mikrolitre çift damıtılmış su ile karıştırın. FACS makinesine bağlı bilgisayarda FACS yazılımını çalıştırın ve yeni bir deneme oluşturun. Ardından ölçüm parametrelerini ayarlayın.Ardından, numunelerin uyarma ve emisyon dalga boylarına göre filtreyi seçin ve edinme hücresi numarasını 10.000 olarak ayarlayın. Floresan boncukların yoğunluğunu ölçerek FITC filtre voltajını ayarlayın, ardışık iki deney arasındaki boncukların yoğunluğundaki nispi farkın% 5'i geçmemesini sağlayınOlası fazla boncukları çıkarmak için makineyi birkaç saniye boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın. Numune floresan yoğunluğunu ölçün ve numune enjeksiyon stabilitesi için üç ila beş saniye beklerken önizlemeye tıklayın.Son olarak edin'e tıklayın. Deneyin sonunda boncukları tekrar ölçün. İki boncuk ölçümü arasındaki nispi farkın% 5'i aşıp aşmadığını kontrol ettikten sonraFACS verilerini FCS dosyaları olarak dışa aktarın.R Studio'yu açın ve BDverse_analysis komut dosyasını yükleyin. FCS dosyalarını analiz etmek için R. Deneme adını, FCS dosyalarının dir_d olarak depolandığı ve sonuç dosyalarının dir_r olarak oluşturulacağı dizin yolu olan ename olarak ayarlayın.Ardından, floresan kanalını ayarlayın. Ölçülen numune sayısını ayarlayın. Çubuk grafikler ve kutu grafikler için nokta grafiklerinin boyutları ve x ve y ekseninin maksimum uzunluğu.Hashtag'i ilgili satırlardan kaldırarak not verme yöntemini seçin. Seçilen geçit yöntemine karşılık gelen geçitli flowSet nesnesini ve en az 256'ya eşit olması gereken nokta çizim çözünürlüğünü seçin. Floresanın negatif olduğu ölçümleri kaldırmak ve makalede açıklandığı gibi diğer deneyler nedeniyle aykırı değerleri kaldırmak için iki filtreleme talimatının açıklamasını kaldırın.Kaynak tuşuna basın ve komut dosyasını çalıştırın. Analiz sonuçlarını içeren tüm dosyalar dir_r oluşturulur. dSpCas9-VP64'ün en iyi aktivasyon verimliliği, sentetik promotörde altı lexOp hedef bölgesi olduğunda elde edildi.dCas12a-VPR için, sentetik promotöre üç lexOp kopyası yerleştirildiğinde en yüksek aktivasyon verimliliği. Bütünleştirici bir plazmid üzerinde bulunan CRISPR RNA ve tek kılavuz RNA tarafından aktivasyon, bir epizomal plazmid üzerine yerleştirildiğinden 1.4 ila 2.4 ve 1.1 ila 1.5 kat daha yüksekti. RT-qPCR sonuçları, epizomal bir vektörün, ekspresyon sisteminden bağımsız olarak, bütünleştirici vektörden çok daha yüksek bir tek kılavuzlu RNA CRISPR RNA ürettiğini göstermiştir.MCP-VP64'ü işe alan karmaşık dSpCas9 ve iskele RNA'sının aktivasyon etkinliği test edildi. Tek bir vahşi tip ve F6MS2 saç tokası içeren iskele RNA'sı sırasıyla 5.27 ve 4.3 kat aktivasyon verdi. Bununla birlikte, iki saç tokasının kombinasyonu, en yüksek aktivasyon verimliliği ile 7.54 kat ile sonuçlandı.Üç çeşit tip iki anti CRISPR'nin ekspresyonunu yönlendirmek için dört farklı promotör kullanıldı ve doza bağımlı bir şekilde çalıştıklarını gösterdi. Güçlü bir promotör, floresan seviyesini sırasıyla değerinin 0.21, 0.11 ve 0.13'üne düşürdü. Titrasyon eğrisi, devrenin 2,3'e yaklaşan bir açma-kapama oranıyla düğüm yürüyüşü gibi davrandığını gösterir.Tip beş anti-CRISPR A, hem denAS-Cas12a hem de dLB-Cas12a'nın floresan ekspresyonunu aktivatörler olarak% 19'dan% 71'e düşürürAktivatörler ve baskılayıcılar arasındaki ilişki, Acr-VA'nın pTEF1 altında pGAL1 tarafından üretildiğinde performansında büyük dalgalanmalar gösterdiği ve genetik CYC1t-pCYC1noTata tip beş anti-CRISPR-A1'in sadece çıplak dLB Cas12a üzerinde bir miktar baskı gösterdiği yerde incelenmiştir. FACS makinesi zayıftır, bu nedenle dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. Hücre çözeltisi asla çok yoğun olmamalı ve makine temiz tutulmalıdır.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Electrical Engineering

Bioengineering

Unit 1

DC Circuit Analysis

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tümör Hücre Invasion üzerine İnterstisyel Akışkan Etkilerinin Ölçülmesi için üç boyutlu Hücre Kültürü Modeli

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Biyomühendislik

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

Özel tabanlı doku optik hayaletler diffüz yansıma spektroskopisi için taklit

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a ...

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Bir damlacık dayalı mikrosıvısal yaklaşım ve Microsphere-PCR güçlendirme tek iplikçikli DNA'Amplicons için

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

Yenidoğan Domuzcuklarda Brakiyal Pleksus Üzerinde In Vivo Biyomekanik Test Yöntemleri

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Aktin bazlı hareketliliğin ticari olarak temin edilebilen proteinlerle yeniden yapılandırılması

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...