Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

1. الحصول على البيانات باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى Rodrigues et al.16 مع التعديلات التالية، مع ملاحظة أن مناطق الاقتناء التي تستخدم مؤسسة التمويل الدولية قد تحتاج إلى تعديل من أجل التقاط الصور على النحو الأمثل:
<ol><li>بالنسبة للط...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

يصف العمل المقدم هنا استخدام خوارزميات التعلم العميق لأتمتة تسجيل مقايسة MN. أظهرت العديد من المنشورات الحديثة أن الأدوات البديهية والتفاعلية تسمح بإنشاء نماذج التعلم العميق لتحليل بيانات الصور دون الحاجة إلى معرفة حسابية متعمقة18,19. تم تصميم البروتوكول ال...

يعد فحص النواة الدقيقة (MN) أمرا أساسيا في علم السموم الوراثية لتقييم تلف الحمض النووي في تطوير مستحضرات التجميل والمستحضرات الصيدلانية والمواد الكيميائية للاستخدام البشري1،2،3،4. تتكون النوى الدقيقة من كروموسومات كاملة أو شظايا كروموسوم لا تندمج في النواة بعد الانقسام وتتكثف في أجسام دائرية صغيرة منفصلة عن النواة. وبالتالي ، يمكن استخدام MN كنقطة نهاية لتحديد تلف الحمض النووي في اختبار السمية الجينية1.
الطريقة المفضلة لقياس MN هي داخل الخلايا ثنائية النواة المقسمة مرة واحدة (BNCs) عن طريق منع الانقسام باستخدام Cytochalasin-B (Cyt-B). في هذا الإصدار من الفحص ، يتم تقييم السمية الخلوية أيضا عن طريق تسجيل الخلايا أحادية النواة (MONO) ومتعددة النوى (POLY). يمكن أيضا إجراء الفحص عن طريق تسجيل MN في خلايا أحادية اللون غير محظورة ، وهو أسرع وأسهل في التسجيل ، مع تقييم السمية الخلوية باستخدام عدد الخلايا قبل وبعد التعرض لتقييم الانتشار 5,6.
تم إجراء التسجيل المادي للفحص تاريخيا من خلال الفحص المجهري اليدوي ، لأن هذا يسمح بتأكيد مرئي لجميع الأحداث الرئيسية. ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري اليدوي يمثل تحديا وشخصيا1. وهكذا ، تم تطوير تقنيات آلية ، بما في ذلك مسح الشرائح المجهرية وقياس التدفق الخلوي ، ولكل منها مزاياها وقيودها. بينما تسمح طرق مسح الشرائح بتصور الأحداث الرئيسية ، يجب إنشاء الشرائح بكثافة الخلية المثلى ، والتي قد يكون من الصعب تحقيقها. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تفتقر هذه التقنية إلى التصور السيتوبلازمي ، والذي يمكن أن يضر بتسجيل الخلايا أحادية اللونو POLY 7,8. بينما يوفر قياس التدفق الخلوي التقاط بيانات عالية الإنتاجية ، يجب تحليل الخلايا ، وبالتالي عدم السماح باستخدام شكل Cyt-B للفحص. بالإضافة إلى ذلك ، كتقنية غير تصويرية ، لا يوفر قياس التدفق الخلوي التقليدي التحقق البصري من الأحداث الرئيسية 9,10.
لذلك ، تم التحقيق في قياس التدفق الخلوي التصويري (IFC) لإجراء فحص MN. تجمع ImageStreamX Mk II بين السرعة والمتانة الإحصائية لقياس التدفق الخلوي التقليدي مع إمكانات التصوير عالية الدقة للفحص المجهري في نظام واحد11. لقد ثبت أنه باستخدام مؤسسة التمويل الدولية ، يمكن التقاط صور عالية الدقة لجميع الأحداث الرئيسية وتسجيلها تلقائيا باستخدام تقنيات 12,13 أو الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي)القائمة على الميزات 14,15. باستخدام IFC لإجراء مقايسة MN ، يمكن تحقيق التسجيل التلقائي للعديد من الخلايا مقارنة بالفحص المجهري في فترة زمنية أقصر.
ينحرف هذا العمل عن سير عمل تحليل الصور الموصوف سابقا16 ويناقش جميع الخطوات المطلوبة لتطوير وتدريب نموذج غابة عشوائية (RF) و / أو شبكة عصبية تلافيفية (CNN) باستخدام برنامج Amnis الذكاء الاصطناعي (يشار إليه من الآن فصاعدا باسم "برنامج الذكاء الاصطناعي"). يتم وصف جميع الخطوات اللازمة ، بما في ذلك ملء بيانات الحقيقة الأرضية باستخدام أدوات وضع العلامات بمساعدة الذكاء الاصطناعي ، وتفسير نتائج تدريب النموذج ، وتطبيق النموذج لتصنيف البيانات الإضافية ، مما يسمح بحساب السمية الجينية والسمية الخلوية15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

يتم استخدام اختبار النواة الدقيقة (MN) في جميع أنحاء العالم من قبل الهيئات التنظيمية لتقييم المواد الكيميائية للسمية الجينية. يمكن إجراء الفحص بطريقتين: عن طريق تسجيل MN في الخلايا ثنائية النواة المقسمة مرة واحدة أو المسدودة بالسيتوكينات أو الخلايا أحادية النوى المقسمة بالكامل. تاريخيا ، كان الفحص المجهري الضوئي هو الطريقة القياسية الذهبية لتسجيل الفحص ، لكنه شاق وغير موضوعي. تم استخدام قياس التدفق الخلوي في السنوات الأخيرة لتسجيل الفحص ، ولكنه محدود بسبب عدم القدرة على تأكيد الجوانب الرئيسية للصور الخلوية بصريا. يجمع قياس التدفق الخلوي التصويري (IFC) بين التقاط الصور عالية الإنتاجية وتحليل الصور الآلي ، وقد تم تطبيقه بنجاح للحصول بسرعة على صور لجميع الأحداث الرئيسية وتسجيلها في اختبار MN. في الآونة الأخيرة ، ثبت أنه يمكن استخدام طرق الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) القائمة على الشبكات العصبية التلافيفية لتسجيل بيانات مقايسة MN التي حصلت عليها مؤسسة التمويل الدولية. تصف هذه الورقة جميع خطوات استخدام الذكاء الاصطناعي البرنامج لإنشاء نموذج تعلم عميق لتسجيل جميع الأحداث الرئيسية وتطبيق هذا النموذج لتسجيل بيانات إضافية تلقائيا. تقارن نتائج نموذج التعلم العميق الذكاء الاصطناعي بشكل جيد بالفحص المجهري اليدوي ، وبالتالي تمكين التسجيل الآلي بالكامل لمقايسة MN من خلال الجمع بين مؤسسة التمويل الدولية و الذكاء الاصطناعي.

يوضح الشكل 1 سير العمل لاستخدام برنامج الذكاء الاصطناعي لإنشاء نموذج لمقايسة MN. يقوم المستخدم بتحميل ملفات .daf المطلوبة في برنامج الذكاء الاصطناعي ، ثم يعين الكائنات إلى فئات نموذج الحقيقة الأرضية باستخدام المجموعة بمساعدة الذكاء الاصطناعي (الشكل 2) والتنب...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

اختبار النواة الدقيقة (MN) هو اختبار راسخ لقياس تلف الحمض النووي. ومع ذلك ، فإن تسجيل الفحص باستخدام التقنيات التقليدية مثل الفحص المجهري اليدوي أو تحليل الصور المستند إلى الميزات أمر شاق وصعب. تصف هذه الورقة منهجية تطوير نموذج ذكاء اصطناعي لتسجيل مقايسة MN باستخدام بيانات قياس التدفق الخلوي للتصوير.

أتمتة مقايسة النواة الدقيقة باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير والذكاء الاصطناعي

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

يتغلب إجراء مقايسة النواة الدقيقة باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير على العديد من قيود الطرق التقليدية ، بما في ذلك الإنتاجية المنخفضة ، وتقلب النتيجة ، وعدم التأكيد البصري للأحداث. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الحصول على جميع الأحداث الرئيسية باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير وتحليلها باستخدام الذكاء الاصطناعي. ويمكن استخدام هذه الطريقة في فحص المواد الكيميائية والمركبات الأخرى على نطاق واسع لاختبار السمية بإنتاجية أعلى مما هو متاح حاليا.عند بناء نموذج الذكاء الاصطناعي جديد ، يتمثل التحدي الرئيسي في الحصول على صور كافية للخلايا ذات النوى الدقيقة ، لذلك من المهم استخدام خوارزميات وضع علامات على الصور. للبدء ، قم بتشغيل برنامج الذكاء الاصطناعي أو الذكاء الاصطناعي. ضمن نوع التجربة ، انقر فوق زر الاختيار الموجود بجانب Train لبدء تجربة تدريبية لبناء الشبكة العصبية التلافيفية أو نموذج CNN ، وانقر فوق التالي.في أسماء الفئات ، انقر فوق إضافة. في النافذة المنبثقة ، اكتب أحادي النواة ، وانقر فوق "موافق" لإضافة الفئة أحادية النواة إلى قائمة أسماء الفئات. كرر هذه العملية لإضافة أسماء الفئات الأخرى ، مثل أحادي النواة مع MN ، ثنائي النواة ، ثنائي النواة مع MN ، متعدد النوى ، ومورفولوجيا غير منتظمة.ضمن تحديد الملفات ، انقر فوق إضافة ملفات ، واستعرض بحثا عن الملفات المطلوبة لإضافتها إلى برنامج الذكاء الاصطناعي ، لبناء بيانات الحقيقة الأساسية. بعد ذلك في شاشة تحديد قاعدة السكان، حدد موقع المحتوى غير المبرمج من التسلسل الهرمي للسكان. ثم انقر بزر الماوس الأيمن على السكان غير المبرمجين ، واختر تحديد جميع المجموعات السكانية المطابقة ، وانقر فوق التالي.لتعيين مجموعة حقيقة موسومة للخلايا أحادية النوى ذات النواة الدقيقة ، انقر فوق فئة أحادية النوى مع MN ضمن فئات النموذج على اليسار ، ثم انقر فوق مجموعة الحقيقة الموسومة المناسبة على اليمين. بمجرد تعيين جميع مجموعات الحقيقة المناسبة ، انقر فوق التالي. في شاشة تحديد القنوات، تأكد من اختيار القنوات المناسبة للتجربة.هنا ، اختر Bright Field أو BF كقناة واحدة ، قطعان للحمض النووي كقناة سابعة ، ثم انقر فوق التالي. أخيرا ، في شاشة التأكيد ، انقر فوق إنشاء تجربة. انقر فوق وضع العلامات لتشغيل واجهة أداة وضع العلامات.ثم انقر فوق أدوات التكبير / التصغير لاقتصاص الصور لتسهيل المشاهدة. وانقر على شريط التمرير لضبط حجم الصورة وتحديد عدد الصور التي سيتم عرضها في المعرض. انقر فوق خيار إعداد العرض واختر min-max ، والذي يوفر أفضل صورة تباين لتحديد جميع الأحداث الرئيسية.بعد ذلك ، انقر فوق إعداد معرض العرض لتغيير لون صورة الحمض النووي إلى الأصفر أو الأبيض ، مما سيؤدي إلى تحسين تصور الأشياء الصغيرة. انقر فوق Cluster لتشغيل الخوارزمية لتجميع الصور ذات التشكل المماثل معا. بمجرد اكتمال التجميع ، انقر فوق المجموعات الفردية وابدأ في تعيين الصور لفئات النموذج المناسبة.بعد تعيين ما لا يقل عن 25 كائنا لكل فئة نموذج ، تصبح خوارزمية التنبؤ متاحة. انقر فوق توقع. بمجرد اكتمال تشغيل خوارزمية التنبؤ ، أضف كائنات من الفئات المتوقعة إلى فئات النموذج المناسبة.بمجرد تعيين ما لا يقل عن 100 كائن لكل فئة طراز ، انقر فوق علامة التبويب التدريب في الجزء العلوي من الشاشة ، ثم انقر فوق الزر "قطار". بمجرد اكتمال تدريب النموذج ، انقر فوق عرض النتائج لتقييم دقة النموذج. بمجرد اكتمال تدريب النموذج ، انقر فوق زر القائمة لتحديد تجربة جديدة.ضمن نوع التجربة، انقر فوق زر الاختيار الموجود بجانب تصنيف لبدء تجربة تصنيف، ثم انقر فوق التالي. انقر فوق النموذج المراد استخدامه للتصنيف ، ثم انقر فوق التالي. في شاشة تحديد الملفات ، انقر فوق إضافة ملفات.استعرض بحثا عن الملفات المراد تصنيفها حسب نموذج CNN ، ثم انقر فوق التالي. بعد ذلك ، في شاشة تحديد السكان الأساسيين ، انقر فوق مربع الاختيار بجوار السكان غير المبرمجين في أحد الملفات المحملة. انقر بزر الماوس الأيمن فوق السكان غير المبرمجين ، وانقر فوق تحديد كافة المجموعات المطابقة لتحديد هذه المجموعة من جميع الملفات المحملة ، ثم انقر فوق التالي.في شاشة تحديد القنوات، تحقق من تحديد القناة الأولى للحقل الساطع، وتحديد القناة السابعة لصبغة الحمض النووي، وانقر فوق التالي. أخيرا ، في شاشة التأكيد ، انقر فوق إنشاء تجربة. يقوم برنامج الذكاء الاصطناعي بتحميل النموذج المحدد وجميع الصور من ملفات البيانات المختارة.بعد التحميل ، انقر فوق "إنهاء". بعد ذلك ، انقر فوق تصنيف لتشغيل شاشة التصنيف. واستخدم خانات الاختيار لاختيار استخدام Random Forest أو RF وCNN.ثم انقر فوق الزر تصنيف. يبدأ هذا عملية استخدام نماذج RF و CNN لتصنيف البيانات الإضافية وتحديد جميع الكائنات التي تنتمي إلى فئات النماذج المحددة. بمجرد اكتمال التصنيف ، انقر فوق عرض النتائج.انقر على تحديث DAFs زر لإظهار تحديث DAFs مع نافذة نتائج التصنيف ، ثم انقر فوق "موافق" لتحديث ملفات DAF. لإنشاء التقرير ، في شاشة النتائج ، انقر فوق إنشاء تقرير. إذا كان هناك حاجة إلى تقرير فردي لكل إدخال DAF، فحدد خانة الاختيار الموجودة بجانب إنشاء تقرير لكل إدخال DAF.خلاف ذلك ، ما عليك سوى النقر فوق "موافق" للحصول على التقارير. تقوم خوارزمية الكتلة بمساعدة الذكاء الاصطناعي بتجميع الكائنات المتشابهة داخل مقطع معا ، وفقا لمورفولوجيا كل من الكائنات غير المصنفة والكائنات التي تم تعيينها لفئات نموذج الحقيقة الأرضية. تقع المجموعات التي تحتوي على خلايا أحادية النوى على جانب واحد من خريطة الكائن ، بينما تقع الخلايا متعددة النوى على الجانب الآخر.تقع مجموعات الخلايا ثنائية النواة بين مجموعات الخلايا أحادية ومتعددة النوى. أخيرا ، تقع المجموعات ذات التشكل غير المنتظم في مناطق مختلفة من خريطة الكائن. خوارزمية التنبؤ أكثر قوة من خوارزمية الكتلة في تحديد الأشكال الدقيقة في الصور.على سبيل المثال ، الخلايا أحادية النوى مع MN مقابل الخلايا أحادية النوى بدون MN. يمكن تقييم أداء النموذج باستخدام الأدوات ، بما في ذلك الرسوم البيانية لتوزيع الفئة ، وإحصاءات الدقة ، ومصفوفة الارتباك التفاعلية. في الرسوم البيانية لتوزيع الطبقة ، كلما اقتربت قيم النسبة المئوية بين الحقيقة والسكان المتوقعين ، كان النموذج أكثر دقة. في إحصائيات الدقة ، كلما اقتربت هذه المقاييس من 100٪ ، كان النموذج أكثر دقة في تحديد الأحداث في فئات النموذج.أخيرا ، تشير مصفوفة الارتباك التفاعلية إلى المكان الذي يخطئ فيه النموذج في تصنيف الأحداث. تم قياس السمية الجينية من خلال النسبة المئوية للنوى الدقيقة عن طريق الفحص المجهري ، المشار إليها بواسطة قضبان شفافة ، ويشار إليها الذكاء الاصطناعي بواسطة القضبان المنقطة بعد التعرض لمدة 3 ساعات والتعافي لمدة 24 ساعة ، لمانيتول وإيتوبوسيد وميتوميسين ج ، باستخدام كل من طرق السيتوكلاسين ب وغير السيتوكلاسين ب. عند إنشاء تجربة تدريبية، تأكد من أن البيانات المحملة تحتوي على صور من عينات تحكم موجبة وسالبة.النوى الدقيقة نادرة ، وهناك حاجة إلى صور كافية لبناء نموذج الذكاء الاصطناعي دقيق. يسمح هذا الإجراء بإنشاء نماذج الذكاء الاصطناعي لتحليل بيانات النواة الدقيقة لتدفق التصوير في أي مجال من مجالات الدراسة ، مثل قياس الجرعات الحيوية الإشعاعية. قد تمتد الطريقة السريعة والقوية القائمة على الذكاء الاصطناعي لتحديد النوى الدقيقة إلى تطبيقات أخرى ، مثل تحديد النوى الدقيقة التي قد تكون تنبؤية لخطر الإصابة بالسرطان.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

تقييم توصيل الجينات البوليمرية الجسيمات النانوية من تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر وعالية الإنتاجية قياس التدفق الخلوي

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

واسعة المجال المجهري نيون نيون قياس التدفق الخلوي والتصوير على الهاتف الخلوي

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

توطين والكمي النسبية من أنابيب الكربون النانوية في الخلايا مع متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

كشف حساسية Proteopathic البذر آخر مع الحنق التدفق الخلوي

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

عزل الخلايا العقدة الشبكية الفئران الأولية (رغس) عن طريق التدفق الخلوي

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

طريقة آلية لإجراء فحص النواة الدقيقة في المختبر باستخدام قياس تدفق تدفق التصوير متعدد الأطياف

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

الكشف عن سرطان المبيض باستخدام الضوئية تدفق الصوتية الخلوية

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد لتحليل الوظيفة المناعية لأنسجة الزرع المشرحة

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

تصوير تدفق الدم مع دوبلر فائق السرعة

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...