Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

1. Dataindsamling ved hjælp af billeddannelsesflowcytometri
BEMÆRK: Se Rodrigues et al.16 med følgende ændringer, idet det bemærkes, at anskaffelsesregionerne, der bruger IFC, muligvis skal ændres for optimal billedoptagelse:
<ol><li>For non-Cyt-B-metoden udføres en celletælling ved hjælp af en kommercielt tilgængelig celletæller efter producentens anvisninger (se materialetabellen) på hver kultur umiddelbart før dyrkning...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

Arbejdet, der præsenteres her, beskriver brugen af deep learning-algoritmer til at automatisere scoringen af MN-analysen. Flere nylige publikationer har vist, at intuitive, interaktive værktøjer gør det muligt at oprette deep learning-modeller til at analysere billeddata uden behov for dybdegående beregningsviden18,19. Protokollen beskrevet i dette arbejde ved hjælp af en brugergrænsefladedrevet softwarepakke er designet til at fungere godt med meget store...

Mikrokerneanalysen (MN) er grundlæggende i genetisk toksikologi til evaluering af DNA-skader i udviklingen af kosmetik, lægemidler og kemikalier til human brug 1,2,3,4. Mikrokerner dannes af hele kromosomer eller kromosomfragmenter, der ikke inkorporeres i kernen efter opdeling og kondenseres til små, cirkulære legemer adskilt fra kernen. MN kan således anvendes som endepunkt til at kvantificere DNA-skader i genotoksicitetstest1.
Den foretrukne metode til kvantificering af MN er inden for en gang delte binucleated celler (BNC'er) ved at blokere division ved hjælp af cytochalasin-B (Cyt-B). I denne version af analysen vurderes cytotoksicitet også ved at score mononukleerede (MONO) og polynukleerede (POLY) celler. Analysen kan også udføres ved at score MN i ikke-blokerede MONO-celler, hvilket er hurtigere og lettere at score, idet cytotoksicitet vurderes ved hjælp af celletal før og efter eksponering for at vurdere proliferation 5,6.
Fysisk scoring af analysen er historisk set blevet udført gennem manuel mikroskopi, da dette muliggør visuel bekræftelse af alle nøglehændelser. Imidlertid er manuel mikroskopi udfordrende og subjektiv1. Således er automatiserede teknikker blevet udviklet, herunder mikroskopdiasscanning og flowcytometri, hver med deres egne fordele og begrænsninger. Mens diasscanningsmetoder gør det muligt at visualisere nøglehændelser, skal dias oprettes med optimal celletæthed, hvilket kan være vanskeligt at opnå. Derudover mangler denne teknik ofte cytoplasmatisk visualisering, hvilket kan kompromittere scoringen af MONO- og POLY-celler 7,8. Mens flowcytometri tilbyder datafangst med høj kapacitet, skal cellerne lyseres, hvilket ikke tillader anvendelse af Cyt-B-formen af assayet. Derudover giver konventionel flowcytometri som en ikke-billeddannelsesteknik ikke visuel validering af nøglehændelser 9,10.
Derfor er billeddannelsesflowcytometri (IFC) blevet undersøgt for at udføre MN-assayet. ImageStreamX Mk II kombinerer hastigheden og den statistiske robusthed af konventionel flowcytometri med mikroskopiens billeddannelsesfunktioner i høj opløsning i et enkelt system11. Det har vist sig, at ved hjælp af IFC kan billeder i høj opløsning af alle nøglebegivenheder optages og automatisk scores ved hjælp af funktionsbaserede 12,13 eller kunstig intelligens (AI) teknikker14,15. Ved at bruge IFC til at udføre MN-analysen kan den automatiske scoring af mange flere celler sammenlignet med mikroskopi på kortere tid opnås.
Dette arbejde afviger fra en tidligere beskrevet billedanalysearbejdsgang16 og diskuterer alle trin, der kræves for at udvikle og træne en Random Forest (RF) og / eller convolutional neural network (CNN) model ved hjælp af Amnis AI-softwaren (fremover benævnt "AI-software"). Alle nødvendige trin er beskrevet, herunder udfyldning af grundlæggende sandhedsdata ved hjælp af AI-assisterede mærkningsværktøjer, fortolkning af modeltræningsresultater og anvendelse af modellen til at klassificere yderligere data, hvilket muliggør beregning af genotoksicitet og cytotoksicitet15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

Mikrokerneanalysen (MN) anvendes over hele verden af regulerende organer til at evaluere kemikalier for genetisk toksicitet. Analysen kan udføres på to måder: ved at score MN i en gang opdelte, cytokinesisblokerede binucleerede celler eller fuldt opdelte mononukleerede celler. Historisk set har lysmikroskopi været guldstandardmetoden til at score analysen, men det er besværligt og subjektivt. Flowcytometri er blevet brugt i de senere år til at score analysen, men er begrænset af manglende evne til visuelt at bekræfte nøgleaspekter af cellulære billeder. Imaging flow cytometri (IFC) kombinerer high-throughput billedoptagelse og automatiseret billedanalyse, og er blevet anvendt med succes til hurtigt at erhverve billeder af og score alle vigtige begivenheder i MN assay. For nylig er det blevet demonstreret, at kunstig intelligens (AI) metoder baseret på convolutional neurale netværk kan bruges til at score MN assay data erhvervet af IFC. Dette dokument beskriver alle trin til at bruge AI-software til at oprette en dyb læringsmodel til at score alle vigtige hændelser og til at anvende denne model til automatisk at score yderligere data. Resultaterne fra AI deep learning-modellen kan sammenlignes godt med manuel mikroskopi, hvilket muliggør fuldautomatisk scoring af MN-analysen ved at kombinere IFC og AI.

Figur 1 viser arbejdsprocessen for brug af AI-softwaren til at oprette en model til MN-analysen. Brugeren indlæser de ønskede .daf-filer i AI-softwaren og tildeler derefter objekter til jordsandhedsmodelklasserne ved hjælp af AI-assisterede klyngealgoritmer (figur 2) og forudsige (figur 3). Når alle grundlæggende sandhedsmodelklasser er blevet befolket med tilstrækkelige objekter, kan modellen trænes ved hjælp af RF- eller C...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

Mikronukleusanalysen (MN) er en veletableret test til kvantificering af DNA-skader. Imidlertid er det besværligt og udfordrende at score analysen ved hjælp af konventionelle teknikker såsom manuel mikroskopi eller funktionsbaseret billedanalyse. Dette papir beskriver metoden til at udvikle en kunstig intelligensmodel til at score MN-analysen ved hjælp af billeddannelsesflowcytometridata.

Automatisering af mikronukleusanalysen ved hjælp af billeddannelsesflowcytometri og kunstig intelligens

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

Udførelse af mikronukleusanalysen ved hjælp af billeddannelsesflowcytometri overvinder mange begrænsninger ved traditionelle metoder, herunder lav gennemstrømning, scorevariabilitet og mangel på visuel bekræftelse af begivenheder. Den største fordel ved denne teknik er, at alle nøglehændelser kan erhverves ved hjælp af billeddannelsesflowcytometri og analyseres ved hjælp af kunstig intelligens. Denne metode har potentiale til at blive anvendt i storskala screening af kemikalier og andre forbindelser for at teste for toksicitet ved højere gennemstrømning end den, der i øjeblikket er tilgængelig.Når man bygger en ny AI-model, er den største udfordring at få tilstrækkelige billeder af celler med mikrokerner, så det er vigtigt at bruge billedmærkningsalgoritmerne. For at begynde skal du starte kunstig intelligens eller AI-software. Under Eksperimenttype skal du klikke på alternativknappen ved siden af Træning for at starte et træningseksperiment til opbygning af Convolutional Neural Network eller CNN-modellen og klikke på Næste.På klassenavnene skal du klikke på Tilføj. Skriv mononukleeret i pop op-vinduet, og klik på OK for at tilføje den mononucleated klasse til listen over klassenavne. Gentag denne proces for at tilføje de andre klassenavne, f.eks. mononukleeret med MN, binucleated, binucleated med MN, polynucleated og uregelmæssig morfologi.Under Vælg filer skal du klikke på Tilføj filer og søge efter de ønskede filer, der skal føjes til AI-softwaren, for at opbygge de grundlæggende sandhedsdata. Find derefter den ikke-apoptotiske population fra befolkningshierarkiet på skærmbilledet Vælg basispopulation. Højreklik derefter på den ikke-apoptotiske befolkning, vælg Vælg alle matchende populationer, og klik på Næste.For at tildele en mærket sandhedspopulation af mononukleerede celler med mikrokerne skal du klikke på klassen Mononucleated with MN under Model Classes til venstre og derefter klikke på den relevante taggede sandhedspopulation til højre. Når alle relevante sandhedspopulationer er tildelt, skal du klikke på Næste. På skærmbilledet Vælg kanaler skal du sikre dig, at de relevante kanaler til eksperimentet er valgt.Vælg her Bright Field eller BF som kanal et, besætninger for DNA som kanal syv, og klik derefter på Næste. Til sidst skal du klikke på Opret eksperiment på bekræftelsesskærmen. Klik på Tagging for at starte taggingværktøjets grænseflade.Klik derefter på zoomværktøjerne for at beskære billederne for lettere visning. Og klik på skyderen for at justere billedstørrelsen og bestemme antallet af billeder, der skal vises i galleriet. Klik på indstillingen Skærmindstilling, og vælg min-max, som giver det bedste kontrastbillede til identifikation af alle vigtige hændelser.Klik derefter på Setup Gallery Display for at ændre farven på DNA-billedet til gul eller hvid, hvilket vil forbedre visualiseringen af små objekter. Klik på Klynge for at køre algoritmen for at gruppere billeder med lignende morfologi sammen. Når klyngerne er fuldført, skal du klikke på de enkelte klynger og begynde at tildele billeder til relevante modelklasser.Når der er tildelt mindst 25 objekter til hver modelklasse, bliver forudsigelsesalgoritmen tilgængelig. Klik på Forudsig. Når forudsigelsesalgoritmen er færdig med at køre, skal du føje objekter fra de forudsagte klasser til de relevante modelklasser.Når mindst 100 objekter er tildelt hver modelklasse, skal du klikke på fanen Træning øverst på skærmen og derefter klikke på knappen Oplær. Når modeltræningen er fuldført, skal du klikke på Vis resultater for at vurdere modellens nøjagtighed. Når modeltræningen er fuldført, skal du klikke på menuknappen for at definere et nyt eksperiment.Klik på alternativknappen ud for Klassificer under Eksperimenttype for at starte et klassificeringseksperiment, og klik på Næste. Klik på den model, der skal bruges til klassificering, og klik derefter på Næste. På skærmen Vælg filer skal du klikke på Tilføj filer.Søg efter de filer, der skal klassificeres efter CNN-modellen, og klik derefter på Næste. Klik derefter på afkrydsningsfeltet ud for den ikke-apoptotiske population i en af de indlæste filer på skærmbilledet Vælg basispopulation. Højreklik på den ikke-apoptotiske population, klik på Vælg alle matchende populationer for at vælge denne population blandt alle indlæste filer, og klik derefter på Næste.På skærmen Vælg kanaler skal du kontrollere, at kanal et er valgt for det lyse felt, og kanal syv er valgt for DNA-pletten, og klikke på Næste. Til sidst skal du klikke på Opret eksperiment på bekræftelsesskærmen. AI-softwaren indlæser den valgte model og alle billeder fra de valgte datafiler.Efter indlæsning skal du klikke på Udfør. Klik derefter på Klassificer for at starte klassificeringsskærmen. Og brug afkrydsningsfelterne til at vælge at bruge Random Forest eller RF og CNN.Klik derefter på knappen Klassificer. Dette starter processen med at bruge RF- og CNN-modellerne til at klassificere yderligere data og identificere alle objekter, der hører til i de angivne modelklasser. Når klassificeringen er fuldført, skal du klikke på Vis resultater.Klik på knappen Opdater DAF'er for at åbne vinduet opdater DAF'er med klassificeringsresultater, og klik derefter på OK for at opdatere DAF-filerne. For at generere rapporten skal du klikke på Generer rapport på resultatskærmen. Hvis der kræves en individuel rapport for hver input DAF, skal du markere afkrydsningsfeltet ud for Opret rapport for hver input DAF.Ellers skal du bare klikke på OK for at få rapporterne. Den AI-assisterede klyngealgoritme grupperer lignende objekter inden for et segment sammen i henhold til morfologien for både uklassificerede objekter og de objekter, der er tildelt jordsandhedsmodelklasserne. Klynger indeholdende mononukleerede celler falder på den ene side af objektkortet, mens de multinucleerede celler er på den modsatte side.Binucleated celleklynger falder mellem mono og multinucleated celleklynger. Endelig falder klynger med uregelmæssig morfologi i forskellige områder af objektkortet. Forudsigelsesalgoritmen er mere robust end klyngealgoritmen til at identificere subtile morfologier i billeder.For eksempel mononukleerede celler med MN versus mononukleerede celler uden MN. Modellens ydeevne kan vurderes ved hjælp af værktøjer, herunder klassefordelingshistogrammer, nøjagtighedsstatistikker og en interaktiv forvirringsmatrix. I klassefordelingshistogrammer, jo tættere procentværdierne mellem sandheden og forudsagte populationer, jo mere præcis er modellen. I nøjagtighedsstatistikken, Jo tættere disse metrics er på 100%, jo mere nøjagtig er modellen til at identificere hændelser i modelklasserne.Endelig angiver den interaktive forvirringsmatrix, hvor modellen fejlklassificerer hændelser. Genotoksicitet blev målt ved procentdelen af mikrokerner ved mikroskopi, angivet med klare søjler, og AI angivet med stiplede søjler efter en 3 timers eksponering og 24 timers genopretning for Mannitol, Etoposid og Mitomycin C ved anvendelse af både cytochalasin B og ikke-cytochalasin B-metoderne. Når du opretter et træningseksperiment, skal du sikre dig, at de indlæste data indeholder billeder fra positive og negative kontrolprøver.Mikrokerner er sjældne, og der kræves tilstrækkelige billeder til at opbygge en nøjagtig AI-model. Denne procedure tillader oprettelse af AI-modeller til analyse af billeddannelsesflowmikronukleusdata inden for ethvert fagområde, såsom strålingsbiodosimetri. En hurtig og robust AI-baseret metode til at identificere mikrokerner kan udvides til andre anvendelser, såsom kvantificering af mikrokerner, der kan forudsige risikoen for kræftudvikling.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering af Polymeric Gene Delivery nanopartikler ved Nanopartikel Tracking Analyse og Højkapacitetsforskning Flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-field Fluorescent Microscopy og Fluorescerende Imaging Flowcytometri på en Cell-telefon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Lokalisering og relativ kvantificering af kulstof nanorør i celler med Multispektralbilledteknik Flowcytometri

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Følsomme Påvisning af Proteopathic Seeding Aktivitet med FRET flowcytometri

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolering af primære murin retinalganglionceller (RGC&#39;er) ved flowcytometri

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

En automatiseret metode til udførelse af in vitro-Mikronukleusanalysen ved hjælp af multispektral billedbehandlings flow cytometri

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Påvisning af kræft i æggestokkene ved hjælp af foto akustisk flow cytometri

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Højdimensionalitetsflowcytometri til immunfunktionsanalyse af dissekeret implantatvæv

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Blodgennemstrømning Imaging med Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...