Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

1. Data-acquisitie met behulp van imaging flow cytometrie
OPMERKING: Raadpleeg Rodrigues et al.16 met de volgende wijzigingen, waarbij wordt opgemerkt dat de acquisitieregio's die IFC gebruiken mogelijk moeten worden gewijzigd voor optimale beeldvastlegging:
<ol><li>Voor de niet-Cyt-B-methode voert u een celtelling uit met behulp van een in de handel verkrijgbare cellenteller volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

Het hier gepresenteerde werk beschrijft het gebruik van deep learning-algoritmen om de scoring van de MN-test te automatiseren. Verschillende recente publicaties hebben aangetoond dat intuïtieve, interactieve tools het mogelijk maken om deep learning-modellen te maken om beeldgegevens te analyseren zonder de noodzaak van diepgaande computationele kennis18,19. Het protocol dat in dit werk wordt beschreven met behulp van een softwarepakket met gebruikersinterface,...

De micronucleus (MN) assay is fundamenteel in de genetische toxicologie om DNA-schade te evalueren bij de ontwikkeling van cosmetica, farmaceutische producten en chemicaliën voor menselijk gebruik 1,2,3,4. Micronuclei worden gevormd uit hele chromosomen of chromosoomfragmenten die na deling niet in de kern worden opgenomen en condenseren in kleine, cirkelvormige lichamen die gescheiden zijn van de kern. MN kan dus worden gebruikt als een eindpunt om DNA-schade te kwantificeren in genotoxiciteitstests1.
De voorkeursmethode voor het kwantificeren van MN is binnen eenmaal verdeelde binucleated cellen (BNC's) door de deling te blokkeren met behulp van Cytochalasine-B (Cyt-B). In deze versie van de test wordt de cytotoxiciteit ook beoordeeld door mononucleated (MONO) en polynucleated (POLY) cellen te scoren. De test kan ook worden uitgevoerd door MN te scoren in niet-geblokkeerde MONO-cellen, wat sneller en gemakkelijker te scoren is, waarbij cytotoxiciteit wordt beoordeeld met behulp van celtellingen vóór en na blootstelling om proliferatie 5,6 te beoordelen.
Fysieke scoring van de test is historisch uitgevoerd door middel van handmatige microscopie, omdat dit visuele bevestiging van alle belangrijke gebeurtenissen mogelijk maakt. Handmatige microscopie is echter uitdagend en subjectief1. Zo zijn geautomatiseerde technieken ontwikkeld, waaronder microscoopglaasscanning en flowcytometrie, elk met hun eigen voordelen en beperkingen. Terwijl diascanmethoden het mogelijk maken om belangrijke gebeurtenissen te visualiseren, moeten dia's worden gemaakt met een optimale celdichtheid, wat moeilijk te bereiken kan zijn. Bovendien ontbreekt het deze techniek vaak aan cytoplasmatische visualisatie, wat de score van MONO- en POLO-cellen 7,8 in gevaar kan brengen. Hoewel flowcytometrie gegevensverzameling met een hoge doorvoer biedt, moeten de cellen worden gelyseerd, waardoor het gebruik van de Cyt-B-vorm van de test niet mogelijk is. Bovendien biedt conventionele flowcytometrie, als een niet-beeldvormende techniek, geen visuele validatie van belangrijke gebeurtenissen 9,10.
Daarom is imaging flow cytometrie (IFC) onderzocht om de MN-test uit te voeren. De ImageStreamX Mk II combineert de snelheid en statistische robuustheid van conventionele flowcytometrie met de hoge resolutie beeldvormingsmogelijkheden van microscopie in één systeem11. Het is aangetoond dat door gebruik te maken van IFC, beelden met hoge resolutie van alle belangrijke gebeurtenissen kunnen worden vastgelegd en automatisch kunnen worden gescoord met behulp van feature-based 12,13 of kunstmatige intelligentie (AI) technieken 14,15. Door IFC te gebruiken om de MN-test uit te voeren, is het automatisch scoren van veel meer cellen in vergelijking met microscopie in een kortere tijd haalbaar.
Dit werk wijkt af van een eerder beschreven beeldanalyseworkflow16 en bespreekt alle stappen die nodig zijn om een Random Forest (RF) en/of convolutioneel neuraal netwerk (CNN) model te ontwikkelen en te trainen met behulp van de Amnis AI-software (hierna "AI-software" genoemd). Alle noodzakelijke stappen worden beschreven, inclusief het invullen van ground truth-gegevens met behulp van AI-ondersteunde tagging-tools, interpretatie van modeltrainingsresultaten en toepassing van het model om aanvullende gegevens te classificeren, waardoor berekening van genotoxiciteit en cytotoxiciteit15 mogelijk is.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

De micronucleus (MN) assay wordt wereldwijd gebruikt door regelgevende instanties om chemicaliën te evalueren op genetische toxiciteit. De test kan op twee manieren worden uitgevoerd: door MN te scoren in eenmaal verdeelde, cytokinese-geblokkeerde binucleated cellen of volledig gedeelde mononucleated cellen. Historisch gezien is lichtmicroscopie de gouden standaardmethode geweest om de test te scoren, maar het is bewerkelijk en subjectief. Flowcytometrie is de afgelopen jaren gebruikt om de test te scoren, maar wordt beperkt door het onvermogen om belangrijke aspecten van cellulaire beelden visueel te bevestigen. Imaging flow cytometry (IFC) combineert high-throughput beeldopname en geautomatiseerde beeldanalyse en is met succes toegepast om snel beelden te verzamelen van en alle belangrijke gebeurtenissen in de MN-test te scoren. Onlangs is aangetoond dat kunstmatige intelligentie (AI) -methoden op basis van convolutionele neurale netwerken kunnen worden gebruikt om MN-testgegevens te scoren die door IFC zijn verkregen. Dit artikel beschrijft alle stappen om AI-software te gebruiken om een deep learning-model te maken om alle belangrijke gebeurtenissen te scoren en om dit model toe te passen om automatisch aanvullende gegevens te scoren. De resultaten van het AI deep learning-model zijn goed te vergelijken met handmatige microscopie, waardoor een volledig geautomatiseerde score van de MN-test mogelijk is door IFC en AI te combineren.

Figuur 1 toont de workflow voor het gebruik van de AI-software om een model te maken voor de MN-test. De gebruiker laadt de gewenste .daf-bestanden in de AI-software en wijst vervolgens objecten toe aan de ground truth-modelklassen met behulp van de AI-ondersteunde cluster (figuur 2) en predict (figuur 3) tagging-algoritmen. Zodra alle ground truth-modelklassen zijn gevuld met voldoende objecten, kan het model worden getraind met be...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

De micronucleus (MN) assay is een gevestigde test voor het kwantificeren van DNA-schade. Het scoren van de test met behulp van conventionele technieken zoals handmatige microscopie of op functies gebaseerde beeldanalyse is echter bewerkelijk en uitdagend. Dit artikel beschrijft de methodologie om een kunstmatig intelligentiemodel te ontwikkelen om de MN-test te scoren met behulp van imaging flow cytometriegegevens.

Automatisering van de micronucleustest met behulp van beeldvorming, flowcytometrie en kunstmatige intelligentie

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

Het uitvoeren van de micronucleustest met behulp van beeldvormende flowcytometrie overwint veel beperkingen van traditionele methoden, waaronder lage doorvoer, scorevariabiliteit en gebrek aan visuele bevestiging van gebeurtenissen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat alle belangrijke gebeurtenissen kunnen worden verkregen met behulp van imaging flow cytometrie en geanalyseerd met behulp van kunstmatige intelligentie. Deze methode kan worden gebruikt bij grootschalige screening van chemicaliën en andere verbindingen om te testen op toxiciteit bij een hogere doorvoer dan momenteel beschikbaar is.Bij het bouwen van een nieuw AI-model is de grootste uitdaging het verkrijgen van voldoende afbeeldingen van cellen met micronuclei, dus het is belangrijk om de beeldtagging-algoritmen te gebruiken. Start om te beginnen de kunstmatige intelligentie- of AI-software. Klik onder Experimenttype op het keuzerondje naast Trein om een trainingsexperiment te starten voor het bouwen van het Convolutional Neural Network- of CNN-model en klik op Volgende.Klik in de klassenamen op Toevoegen. Typ mononucleated in het pop-upvenster en klik op OK om de klasse mononucleated toe te voegen aan de lijst met klassenamen. Herhaal dit proces om de andere klassenamen toe te voegen, zoals Mononucleated met MN, Binucleated, Binucleated met MN, Polynucleated en Irregular morphology.Klik onder Bestanden selecteren op Bestanden toevoegen en blader naar de gewenste bestanden die aan de AI-software moeten worden toegevoegd om de grondwaarheidsgegevens te bouwen. Zoek vervolgens op het scherm Basispopulatie selecteren de niet-apoptotische populatie in de populatiehiërarchie. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de niet-apoptotische populatie, kies Selecteer alle overeenkomende populaties en klik op Volgende.Om een gelabelde waarheidspopulatie van mononucleated cellen met micronucleus toe te wijzen, klikt u op de klasse Mononucleated with MN onder Model Classes aan de linkerkant en klikt u vervolgens op de juiste getagde waarheidspopulatie aan de rechterkant. Zodra alle geschikte waarheidspopulaties zijn toegewezen, klikt u op Volgende. Controleer op het scherm Kanalen selecteren of de juiste kanalen voor het experiment zijn gekozen.Kies hier Bright Field of BF als kanaal één, kuddes voor DNA als kanaal zeven en klik vervolgens op Volgende. Klik ten slotte in het bevestigingsscherm op Experiment maken. Klik op Tagging om de interface van de tagging-tool te starten.Klik vervolgens op de zoomgereedschappen om de afbeeldingen bij te snijden voor een eenvoudigere weergave. En klik op de schuifbalk om de afbeeldingsgrootte aan te passen en het aantal afbeeldingen te bepalen dat in de galerij moet worden weergegeven. Klik op de optie Weergave-instelling en kies min-max, wat het beste contrastbeeld biedt voor het identificeren van alle belangrijke gebeurtenissen.Klik vervolgens op Setup Gallery Display om de kleur van de DNA-afbeelding te wijzigen in geel of wit, wat de visualisatie van kleine objecten zal verbeteren. Klik op Cluster om het algoritme uit te voeren om afbeeldingen met vergelijkbare morfologie samen te groeperen. Zodra het clusteren is voltooid, klikt u op de afzonderlijke clusters en begint u met het toewijzen van afbeeldingen aan de juiste modelklassen.Nadat aan elke modelklasse minimaal 25 objecten zijn toegewezen, komt het voorspellingsalgoritme beschikbaar. Klik op Voorspellen. Zodra het voorspellingsalgoritme is uitgevoerd, voegt u objecten uit de voorspelde klassen toe aan de juiste modelklassen.Zodra er minimaal 100 objecten aan elke modelklasse zijn toegewezen, klikt u op het tabblad Training bovenaan het scherm en klikt u vervolgens op de knop Trainen. Zodra de modeltraining is voltooid, klikt u op Resultaten weergeven om de nauwkeurigheid van het model te beoordelen. Zodra de modeltraining is voltooid, klikt u op de menuknop om een nieuw experiment te definiëren.Klik onder Experimenttype op het keuzerondje naast Classificeren om een classificatie-experiment te starten en klik op Volgende. Klik op het model dat u wilt gebruiken voor classificatie en klik vervolgens op Volgende. Klik in het scherm Bestanden selecteren op Bestanden toevoegen.Blader naar de bestanden die moeten worden geclassificeerd volgens het CNN-model en klik vervolgens op Volgende. Klik vervolgens in het scherm Basispopulatie selecteren op het selectievakje naast de niet-apoptotische populatie in een van de geladen bestanden. Klik met de rechtermuisknop op de niet-apoptotische populatie, klik op Alle overeenkomende populaties selecteren om deze populatie uit alle geladen bestanden te selecteren en klik vervolgens op Volgende.Controleer in het scherm Kanalen selecteren of kanaal één is geselecteerd voor het heldere veld en kanaal zeven is geselecteerd voor de DNA-kleuring en klik op Volgende. Klik ten slotte op het bevestigingsscherm op Experiment maken. De AI-software laadt het geselecteerde model en alle afbeeldingen uit de gekozen gegevensbestanden.Klik na het laden op Voltooien. Klik vervolgens op Classificeren om het classificatiescherm te starten. En gebruik de selectievakjes om Random Forest of RF en CNN te gebruiken.Klik vervolgens op de knop Classificeren. Dit begint het proces van het gebruik van de RF- en CNN-modellen om aanvullende gegevens te classificeren en alle objecten te identificeren die in de opgegeven modelklassen thuishoren. Zodra de classificatie is voltooid, klikt u op Resultaten bekijken.Klik op de knop DAF's bijwerken om het venster DAF's bijwerken met classificatieresultaten weer te geven en klik vervolgens op OK om de DAF-bestanden bij te werken. Om het rapport te genereren, klikt u in het resultatenscherm op Rapport genereren. Als voor elke invoer-DAF een afzonderlijk rapport vereist is, schakelt u het selectievakje naast Rapport maken voor elke invoer-DAF in.Anders klikt u gewoon op OK om de rapporten te verkrijgen. Het AI-ondersteunde clusteralgoritme groepeert vergelijkbare objecten binnen een segment samen, volgens de morfologie van zowel niet-geclassificeerde objecten als de objecten die zijn toegewezen aan de grondwaarheidsmodelklassen. Clusters met mononucleated cellen vallen aan de ene kant van de objectkaart, terwijl de multinucleated cellen zich aan de andere kant bevinden.Binucleated celclusters vallen tussen mono- en multinucleated celclusters. Ten slotte vallen clusters met onregelmatige morfologie in verschillende gebieden van de objectkaart. Het voorspellingsalgoritme is robuuster dan het clusteralgoritme bij het identificeren van subtiele morfologieën in afbeeldingen.Bijvoorbeeld mononucleated cellen met MN versus mononucleated cellen zonder MN. De prestaties van het model kunnen worden beoordeeld met behulp van hulpmiddelen, waaronder histogrammen voor klassenverdeling, nauwkeurigheidsstatistieken en een interactieve verwarringsmatrix. In klassenverdelingshistogrammen geldt dat hoe dichter de percentagewaarden tussen de waarheid en voorspelde populaties liggen, hoe nauwkeuriger het model. In de nauwkeurigheidsstatistieken, hoe dichter deze statistieken bij 100% liggen, hoe nauwkeuriger het model is bij het identificeren van gebeurtenissen in de modelklassen.Ten slotte geeft de interactieve verwarringsmatrix aan waar het model gebeurtenissen mist. Genotoxiciteit werd gemeten door het percentage micronuclei door microscopie, aangegeven door duidelijke staven, en AI aangegeven door gestippelde staven na een blootstelling van 3 uur en 24 uur herstel, voor Mannitol, Etoposide en Mitomycine C, met behulp van zowel de Cytochalasin B- als de Non-Cytochalasin B-methoden. Wanneer u een trainingsexperiment maakt, moet u ervoor zorgen dat de geladen gegevens afbeeldingen bevatten van positieve en negatieve controlemonsters.Micronuclei zijn zeldzaam en er is voldoende beeldmateriaal nodig om een nauwkeurig AI-model te bouwen. Deze procedure maakt het mogelijk om AI-modellen te maken voor het analyseren van micronucleusgegevens over beeldvormingsstromen in elk studiegebied, zoals stralingsbiodosimetrie. Een snelle en robuuste op AI gebaseerde methode om micronuclei te identificeren, kan zich uitstrekken tot andere toepassingen, zoals het kwantificeren van micronuclei die voorspellend kunnen zijn voor het risico op de ontwikkeling van kanker.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-field fluorescentie microscopie en fluorescentie imaging Flowcytometrie op een mobiele telefoon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Een geautomatiseerde methode voor het uitvoeren van de in-vitro micronucleus assay met behulp van multispectrale beeldvormings stroom Cytometrie

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Ovariële kanker detectie met Photoacoustic flow Cytometrie

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Blood Flow Imaging met Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...