Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
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1. Datenerfassung mittels bildgebender Durchflusszytometrie
HINWEIS: Beziehen Sie sich auf Rodrigues et al.16 mit den folgenden Modifikationen, wobei darauf hingewiesen wird, dass die Erfassungsbereiche mit IFC möglicherweise für eine optimale Bildaufnahme geändert werden müssen:
<ol><li>Führen Sie bei der Nicht-Cyt-B-Methode eine Zellzählung mit einem handelsüblichen Zellzähler gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialta...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt den Einsatz von Deep-Learning-Algorithmen zur Automatisierung des Scorings des MN-Assays. Mehrere neuere Veröffentlichungen haben gezeigt, dass intuitive, interaktive Werkzeuge die Erstellung von Deep-Learning-Modellen zur Analyse von Bilddaten ermöglichen, ohne dass tiefgreifende Rechenkenntnisse erforderlich sind18,19. Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll, das ein benutzeroberflächengesteuertes Softwarepaket ver...

Der Mikronukleus-Assay (MN) ist in der genetischen Toxikologie von grundlegender Bedeutung, um DNA-Schäden bei der Entwicklung von Kosmetika, Pharmazeutika und Chemikalien für den menschlichen Gebrauch zu bewerten 1,2,3,4. Mikrokerne werden aus ganzen Chromosomen oder Chromosomenfragmenten gebildet, die sich nach der Teilung nicht in den Zellkern eingliedern und zu kleinen, kreisförmigen Körpern verdichten, die vom Zellkern getrennt sind. Somit kann MN als Endpunkt zur Quantifizierung von DNA-Schäden in Genotoxizitätstestsverwendet werden 1.
Die bevorzugte Methode zur Quantifizierung von MN ist in einmal geteilten zweikernigen Zellen (BNCs) durch Blockierung der Teilung mit Cytochalasin-B (Cyt-B). In dieser Version des Assays wird die Zytotoxizität auch durch das Scoring von einkernigen (MONO) und mehrkernigen (POLY) Zellen beurteilt. Der Assay kann auch durch Scoring von MN in nicht blockierten MONO-Zellen durchgeführt werden, was schneller und einfacher zu bewerten ist, wobei die Zytotoxizität anhand der Zellzählung vor und nach der Exposition bewertet wird, um die Proliferation zu beurteilen 5,6.
Die physikalische Bewertung des Assays wurde in der Vergangenheit durch manuelle Mikroskopie durchgeführt, da dies eine visuelle Bestätigung aller Schlüsselereignisse ermöglicht. Die manuelle Mikroskopie ist jedoch anspruchsvoll und subjektiv1. Daher wurden automatisierte Techniken entwickelt, darunter das Scannen von Objektträgern und die Durchflusszytometrie, die jeweils ihre eigenen Vor- und Nachteile haben. Während Objektträger-Scanning-Methoden die Visualisierung von Schlüsselereignissen ermöglichen, müssen Objektträger mit optimaler Zelldichte erstellt werden, was schwierig zu erreichen sein kann. Darüber hinaus fehlt dieser Technik oft die zytoplasmatische Visualisierung, was das Scoring von MONO- und POLY-Zellen beeinträchtigen kann 7,8. Während die Durchflusszytometrie eine Hochdurchsatz-Datenerfassung ermöglicht, müssen die Zellen lysiert werden, so dass die Verwendung der Cyt-B-Form des Assays nicht möglich ist. Darüber hinaus bietet die konventionelle Durchflusszytometrie als nicht-bildgebendes Verfahren keine visuelle Validierung von Schlüsselereignissen 9,10.
Daher wurde die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) untersucht, um den MN-Assay durchzuführen. Der ImageStreamX Mk II kombiniert die Geschwindigkeit und statistische Robustheit der konventionellen Durchflusszytometrie mit den hochauflösenden Bildgebungsmöglichkeiten der Mikroskopie in einem einzigen System11. Es hat sich gezeigt, dass durch den Einsatz von IFC hochauflösende Bilder aller Schlüsselereignisse erfasst und automatisch mit Hilfe von merkmalsbasierten12,13 oder Techniken der künstlichen Intelligenz (KI)14,15 bewertet werden können. Durch die Verwendung von IFC zur Durchführung des MN-Assays ist die automatische Bewertung von viel mehr Zellen im Vergleich zur Mikroskopie in kürzerer Zeit möglich.
Diese Arbeit weicht von einem zuvor beschriebenen Bildanalyse-Workflow16 ab und diskutiert alle Schritte, die erforderlich sind, um ein Random Forest (RF)- und/oder Convolutional Neural Network (CNN)-Modell unter Verwendung der Amnis AI-Software (im Folgenden als "KI-Software" bezeichnet) zu entwickeln und zu trainieren. Es werden alle notwendigen Schritte beschrieben, einschließlich der Befüllung von Ground-Truth-Daten mit KI-gestützten Tagging-Tools, der Interpretation der Ergebnisse des Modelltrainings und der Anwendung des Modells zur Klassifizierung zusätzlicher Daten, die die Berechnung der Genotoxizität und Zytotoxizität ermöglichen15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

Der Mikronukleus-Assay (MN) wird weltweit von Aufsichtsbehörden verwendet, um Chemikalien auf genetische Toxizität zu bewerten. Der Assay kann auf zwei Arten durchgeführt werden: durch Bewertung von MN in einmal geteilten, durch Zytokinese blockierten zweikernigen Zellen oder vollständig geteilten einkernigen Zellen. In der Vergangenheit war die Lichtmikroskopie die Goldstandardmethode, um den Assay zu bewerten, aber sie ist mühsam und subjektiv. Die Durchflusszytometrie wurde in den letzten Jahren zur Bewertung des Assays eingesetzt, ist jedoch durch die Unfähigkeit, wichtige Aspekte der zellulären Bildgebung visuell zu bestätigen, eingeschränkt. Die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) kombiniert Hochdurchsatz-Bilderfassung und automatisierte Bildanalyse und wurde erfolgreich eingesetzt, um schnell Bilder von allen Schlüsselereignissen im MN-Assay zu erfassen und zu bewerten. Kürzlich wurde gezeigt, dass Methoden der künstlichen Intelligenz (KI), die auf Convolutional Neural Networks basieren, zur Bewertung von MN-Assay-Daten verwendet werden können, die von IFC erfasst wurden. In diesem Whitepaper werden alle Schritte beschrieben, um mithilfe von KI-Software ein Deep-Learning-Modell zu erstellen, um alle wichtigen Ereignisse zu bewerten, und um dieses Modell anzuwenden, um zusätzliche Daten automatisch zu bewerten. Die Ergebnisse des KI-Deep-Learning-Modells lassen sich gut mit der manuellen Mikroskopie vergleichen und ermöglichen so eine vollautomatische Bewertung des MN-Assays durch die Kombination von IFC und KI.

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf für die Verwendung der KI-Software zur Erstellung eines Modells für den MN-Assay. Der Benutzer lädt die gewünschten .daf-Dateien in die KI-Software und weist dann den Ground-Truth-Modellklassen mithilfe der KI-gestützten Cluster- (Abbildung 2) und Predict-Tagging-Algorithmen (Abbildung 3) Objekte zu. Sobald alle Ground-Truth-Modellklassen mit ausreichend Objekten gefüllt wurden, kann das Mod...

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Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

Der Mikronukleus-Assay (MN) ist ein etablierter Test zur Quantifizierung von DNA-Schäden. Die Bewertung des Assays mit herkömmlichen Techniken wie manueller Mikroskopie oder merkmalsbasierter Bildanalyse ist jedoch mühsam und herausfordernd. In diesem Artikel wird die Methodik zur Entwicklung eines Modells der künstlichen Intelligenz beschrieben, um den MN-Assay anhand von bildgebenden Durchflusszytometriedaten zu bewerten.

Automatisierung des Mikronukleus-Assays mittels bildgebender Durchflusszytometrie und künstlicher Intelligenz

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

Die Durchführung des Mikrokernassays mit bildgebender Durchflusszytometrie überwindet viele Einschränkungen herkömmlicher Methoden, einschließlich niedrigem Durchsatz, Score-Variabilität und fehlender visueller Bestätigung von Ereignissen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass alle Schlüsselereignisse mittels bildgebender Durchflusszytometrie erfasst und mit künstlicher Intelligenz analysiert werden können. Diese Methode hat das Potenzial, im groß angelegten Screening von Chemikalien und anderen Verbindungen eingesetzt zu werden, um Toxizität bei höherem Durchsatz als derzeit verfügbar zu testen.Bei der Erstellung eines neuen KI-Modells besteht die größte Herausforderung darin, genügend Bilder von Zellen mit Mikrokernen zu erhalten, daher ist es wichtig, die Bild-Tagging-Algorithmen zu verwenden. Starten Sie zunächst die Software für künstliche Intelligenz oder KI. Klicken Sie unter Experimenttyp auf das Optionsfeld neben Trainieren, um ein Trainingsexperiment zum Erstellen des Convolutional Neural Network- oder CNN-Modells zu starten, und klicken Sie auf Weiter.Klicken Sie bei den Klassennamen auf Hinzufügen. Geben Sie im Popup-Fenster Mononucleated ein und klicken Sie auf OK, um die einkernige Klasse zur Liste der Klassennamen hinzuzufügen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die anderen Klassennamen hinzuzufügen, z. B. Mononukleiert mit MN, Zweikernig, Zweikernig mit MN, Mehrkernig und Unregelmäßige Morphologie.Klicken Sie unter "Dateien auswählen" auf "Dateien hinzufügen" und suchen Sie nach den gewünschten Dateien, die der KI-Software hinzugefügt werden sollen, um die Ground-Truth-Daten zu erstellen. Suchen Sie als Nächstes auf dem Bildschirm Basispopulation auswählen die nicht-apoptotische Population aus der Populationshierarchie. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die nicht-apoptotische Population, wählen Sie Alle übereinstimmenden Populationen auswählen und klicken Sie auf Weiter.Um eine markierte Wahrheitspopulation von einkernigen Zellen mit Mikrokern zuzuweisen, klicken Sie links unter Modellklassen auf die Klasse Mononukleiert mit MN, und klicken Sie dann rechts auf die entsprechende markierte Wahrheitspopulation. Sobald alle entsprechenden Wahrheitspopulationen zugewiesen sind, klicken Sie auf Weiter. Stellen Sie auf dem Bildschirm Kanäle auswählen sicher, dass die geeigneten Kanäle für das Experiment ausgewählt sind.Wählen Sie hier Hellfeld oder BF als Kanal eins, Herds für DNA als Kanal sieben und klicken Sie dann auf Weiter. Klicken Sie abschließend auf dem Bestätigungsbildschirm auf Experiment erstellen. Klicken Sie auf Tagging, um die Benutzeroberfläche des Tagging-Tools zu starten.Klicken Sie dann auf die Zoom-Werkzeuge, um die Bilder zur einfacheren Anzeige zuzuschneiden. Klicken Sie auf den Schieberegler, um die Bildgröße anzupassen und die Anzahl der Bilder zu bestimmen, die in der Galerie angezeigt werden sollen. Klicken Sie auf die Option Anzeigeeinstellung und wählen Sie min-max, was das beste Kontrastbild zur Identifizierung aller Schlüsselereignisse bietet.Klicken Sie anschließend auf Galerieanzeige einrichten, um die Farbe des DNA-Bildes in Gelb oder Weiß zu ändern, wodurch die Visualisierung kleiner Objekte verbessert wird. Klicken Sie auf Cluster, um den Algorithmus auszuführen und Bilder mit ähnlicher Morphologie zu gruppieren. Sobald das Clustering abgeschlossen ist, klicken Sie auf die einzelnen Cluster und beginnen Sie mit der Zuweisung von Bildern zu den entsprechenden Modellklassen.Nachdem jeder Modellklasse mindestens 25 Objekte zugewiesen wurden, wird der Vorhersagealgorithmus verfügbar. Klicken Sie auf Vorhersage. Nachdem die Ausführung des Vorhersagealgorithmus abgeschlossen ist, fügen Sie den entsprechenden Modellklassen Objekte aus den vorhergesagten Klassen hinzu.Sobald jeder Modellklasse mindestens 100 Objekte zugewiesen sind, klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf die Registerkarte Training und dann auf die Schaltfläche Trainieren. Sobald das Modelltraining abgeschlossen ist, klicken Sie auf Ergebnisse anzeigen, um die Modellgenauigkeit zu bewerten. Sobald das Modelltraining abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Menüschaltfläche, um ein neues Experiment zu definieren.Klicken Sie unter Experimenttyp auf das Optionsfeld neben Klassifizieren, um ein Klassifizierungsexperiment zu starten, und klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie auf das Modell, das für die Klassifizierung verwendet werden soll, und klicken Sie dann auf Weiter. Klicken Sie auf dem Bildschirm "Dateien auswählen" auf "Dateien hinzufügen".Suchen Sie nach den Dateien, die nach dem CNN-Modell klassifiziert werden sollen, und klicken Sie dann auf Weiter. Klicken Sie als Nächstes auf dem Bildschirm Basispopulation auswählen auf das Kontrollkästchen neben der nicht-apoptotischen Population in einer der geladenen Dateien. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die nicht-apoptotische Population, klicken Sie auf Select All Matching Populations, um diese Population aus allen geladenen Dateien auszuwählen, und klicken Sie dann auf Weiter.Vergewissern Sie sich auf dem Bildschirm "Kanäle auswählen", dass Kanal eins für das helle Feld und Kanal sieben für die DNA-Färbung ausgewählt ist, und klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie abschließend auf dem Bestätigungsbildschirm auf Experiment erstellen. Die KI-Software lädt das ausgewählte Modell und alle Bilder aus den ausgewählten Datendateien.Klicken Sie nach dem Laden auf Fertig stellen. Klicken Sie anschließend auf Klassifizieren, um den Klassifizierungsbildschirm zu öffnen. Und verwenden Sie die Kontrollkästchen, um auszuwählen, ob Random Forest oder RF und CNN verwendet werden sollen.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Klassifizieren. Dadurch wird der Prozess der Verwendung der RF- und CNN-Modelle gestartet, um zusätzliche Daten zu klassifizieren und alle Objekte zu identifizieren, die zu den angegebenen Modellklassen gehören. Sobald die Klassifizierung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Ergebnisse anzeigen.Klicken Sie auf die Schaltfläche DAFs aktualisieren, um das Fenster DAFs mit Klassifizierungsergebnissen aktualisieren aufzurufen, und klicken Sie dann auf OK, um die DAF-Dateien zu aktualisieren. Um den Bericht zu generieren, klicken Sie auf dem Ergebnisbildschirm auf Bericht generieren. Wenn ein individueller Bericht für jeden Eingangs-DAF erforderlich ist, aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Bericht für jeden Eingangs-DAF erstellen.Andernfalls klicken Sie einfach auf OK, um die Berichte zu erhalten. Der KI-gestützte Cluster-Algorithmus gruppiert ähnliche Objekte innerhalb eines Segments entsprechend der Morphologie sowohl der nicht klassifizierten Objekte als auch der Objekte, die den Ground-Truth-Modellklassen zugewiesen wurden. Cluster mit mononukleären Zellen befinden sich auf der einen Seite der Objektkarte, während sich die mehrkernigen Zellen auf der gegenüberliegenden Seite befinden.Zweikernige Zellcluster liegen zwischen ein- und mehrkernigen Zellclustern. Schließlich fallen Cluster mit unregelmäßiger Morphologie in verschiedene Bereiche der Objektkarte. Der Vorhersagealgorithmus ist robuster als der Clusteralgorithmus, wenn es darum geht, subtile Morphologien in Bildern zu identifizieren.Zum Beispiel einkernige Zellen mit MN im Vergleich zu einkernigen Zellen ohne MN. Die Leistung des Modells kann mithilfe von Werkzeugen bewertet werden, einschließlich Klassenverteilungshistogrammen, Genauigkeitsstatistiken und einer interaktiven Konfusionsmatrix. In Histogrammen der Klassenverteilung gilt: Je näher die Prozentwerte zwischen der Wahrheit und den vorhergesagten Grundgesamtheiten liegen, desto genauer ist das Modell. In der Genauigkeitsstatistik gilt: Je näher diese Metriken an 100 % liegen, desto genauer ist das Modell bei der Identifizierung von Ereignissen in den Modellklassen.Schließlich gibt die interaktive Konfusionsmatrix an, wo das Modell Ereignisse falsch klassifiziert. Die Genotoxizität wurde anhand des prozentualen Anteils der Mikrokerne durch Mikroskopie gemessen, der durch klare Balken angezeigt wurde, und die AI durch gestrichelte Balken nach einer 3-stündigen Exposition und einer 24-stündigen Erholung für Mannitol, Etoposid und Mitomycin C, wobei sowohl die Cytochalasin-B- als auch die Nicht-Cytochalasin-B-Methode verwendet wurden. Stellen Sie beim Erstellen eines Trainingsexperiments sicher, dass die geladenen Daten Bilddaten aus Positiv- und Negativkontrollproben enthalten.Mikrokerne sind selten, und es sind ausreichende Bilder erforderlich, um ein genaues KI-Modell zu erstellen. Dieses Verfahren ermöglicht die Erstellung von KI-Modellen zur Analyse von Bildfluss-Mikrokerndaten in jedem Studienbereich, wie z. B. der Strahlenbiodosimetrie. Eine schnelle und robuste KI-basierte Methode zur Identifizierung von Mikrokernen könnte sich auf andere Anwendungen ausdehnen, wie z. B. die Quantifizierung von Mikrokernen, die das Risiko der Krebsentwicklung vorhersagen können.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Forschung

Biotechnik

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und Fluoreszenz-Imaging Durchflusszytometrie auf einem Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Blutfluss-Bildgebung mit ultraschnellem Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...