Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

1. איסוף נתונים באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה
הערה: עיין ב- Rodrigues et al.16 עם השינויים הבאים, וציין כי ייתכן שיהיה צורך לשנות את אזורי הרכישה המשתמשים ב- IFC ללכידת תמונה מיטבית:
<ol><li>בשיטה שאינה Cyt-B, בצע ספירת תאים באמצעות מונה תאים זמין מסחרית בהתאם להוראות...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

העבודה המוצגת כאן מתארת את השימוש באלגוריתמים של למידה עמוקה כדי להפוך את הניקוד של מבחן MN לאוטומטי. מספר פרסומים אחרונים הראו כי כלים אינטואיטיביים ואינטראקטיביים מאפשרים יצירת מודלים של למידה עמוקה לניתוח נתוני תמונה ללא צורך בידע חישובי מעמיק18,19. הפרוט...

בדיקת מיקרוגרעין (MN) היא בסיסית בטוקסיקולוגיה גנטית כדי להעריך נזק לדנ"א בפיתוח קוסמטיקה, תרופות וכימיקלים לשימוש אנושי 1,2,3,4. מיקרו-גרעינים נוצרים מכרומוזומים שלמים או מקטעי כרומוזומים שאינם משתלבים בגרעין לאחר החלוקה ומתעבים לגופים קטנים ועגולים נפרדים מהגרעין. לפיכך, MN יכול לשמש כנקודת קצה לכימות נזק לדנ"א בבדיקת גנוטוקסיות1.
השיטה המועדפת לכימות MN היא בתוך תאים בינוקלים שחולקו פעם אחת (BNCs) על ידי חסימת חלוקה באמצעות Cytochalasin-B (Cyt-B). בגרסה זו של הבדיקה, ציטוטוקסיות מוערכת גם על ידי ניקוד תאים מונונוקלציה (MONO) ו polynucleated (POLY). הבדיקה יכולה להתבצע גם על ידי ניקוד MN בתאי MONO לא חסומים, שהוא מהיר וקל יותר להבקיע, כאשר ציטוטוקסיות מוערכת באמצעות ספירת תאים לפני ואחרי חשיפה כדי להעריך התפשטות 5,6.
ניקוד פיזי של הבדיקה בוצע באופן היסטורי באמצעות מיקרוסקופיה ידנית, שכן זה מאפשר אישור חזותי של כל אירועי המפתח. עם זאת, מיקרוסקופ ידני הוא מאתגר וסובייקטיבי1. כך פותחו טכניקות אוטומטיות, כולל סריקת שקופיות במיקרוסקופ וציטומטריית זרימה, כל אחת עם היתרונות והמגבלות שלה. בעוד ששיטות סריקת שקופיות מאפשרות להציג באופן חזותי אירועי מפתח, יש ליצור שקופיות בצפיפות תאים אופטימלית, דבר שעשוי להיות קשה להשגה. בנוסף, טכניקה זו לעתים קרובות חסר ויזואליזציה ציטופלזמית, אשר יכול לסכן את הניקוד של MONO ו POLY תאים 7,8. בעוד ציטומטריית זרימה מציעה לכידת נתונים בתפוקה גבוהה, התאים חייבים להיות lysed, ובכך לא לאפשר את השימוש בצורת Cyt-B של הבדיקה. בנוסף, כטכניקה שאינה הדמיה, ציטומטריית זרימה קונבנציונלית אינה מספקת אימות חזותי של אירועי מפתח 9,10.
לכן, ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) נחקרה לביצוע בדיקת MN. ImageStreamX Mk II משלב את המהירות והחוסן הסטטיסטי של ציטומטריית זרימה קונבנציונלית עם יכולות הדמיה ברזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה במערכת אחת11. הוכח כי באמצעות IFC, ניתן לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה של כל אירועי המפתח ולהבקיע באופן אוטומטי באמצעות טכניקות מבוססות תכונות 12,13 או בינה מלאכותית (AI) 14,15. על ידי שימוש ב- IFC לביצוע בדיקת MN, הניקוד האוטומטי של תאים רבים יותר בהשוואה למיקרוסקופ בפרק זמן קצר יותר הוא בר השגה.
עבודה זו חורגת מתהליך עבודה של ניתוח תמונה16 שתואר קודם לכן ודנה בכל השלבים הנדרשים לפיתוח ואימון מודל של Random Forest (RF) ו/או רשת עצבית קונבולוציונית (CNN) באמצעות תוכנת Amnis AI (להלן "תוכנת AI"). כל השלבים הדרושים מתוארים, כולל אכלוס נתוני אמת קרקעית באמצעות כלי תיוג בסיוע AI, פרשנות של תוצאות אימון המודל, ויישום המודל לסיווג נתונים נוספים, המאפשר חישוב של גנוטוקסיות וציטוטוקסיות15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

בדיקת המיקרוגרעין (MN) משמשת ברחבי העולם גופים רגולטוריים להערכת רעילות גנטית של כימיקלים. הבדיקה יכולה להתבצע בשתי דרכים: על ידי ניקוד MN בתאים בינוקליים חד-פעמיים מחולקים, חסומים ציטוקינזיס או תאים חד-גרעיניים מחולקים במלואם. מבחינה היסטורית, מיקרוסקופ אור היה שיטת תקן הזהב כדי להבקיע את המבחן, אבל זה מייגע וסובייקטיבי. ציטומטריית זרימה שימשה בשנים האחרונות כדי לדרג את הבדיקה, אך היא מוגבלת על ידי חוסר היכולת לאשר חזותית היבטים מרכזיים של תמונות תאיות. ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) משלבת לכידת תמונה בתפוקה גבוהה וניתוח תמונה אוטומטי, ויושמה בהצלחה כדי לרכוש במהירות תמונות של כל אירועי המפתח במבחן MN ולניקוד שלהם. לאחרונה, הוכח כי שיטות בינה מלאכותית (AI) המבוססות על רשתות עצביות קונבולוציוניות יכולות לשמש כדי לדרג נתוני בדיקת MN שנרכשו על ידי IFC. מאמר זה מתאר את כל השלבים לשימוש בתוכנת AI כדי ליצור מודל למידה עמוקה כדי לדרג את כל אירועי המפתח וליישם מודל זה כדי להבקיע נתונים נוספים באופן אוטומטי. תוצאות מודל הלמידה העמוקה של AI משתוות היטב למיקרוסקופיה ידנית, ולכן מאפשרות ניקוד אוטומטי לחלוטין של בדיקת MN על ידי שילוב IFC ו- AI.

איור 1 מציג את זרימת העבודה לשימוש בתוכנת AI ליצירת מודל עבור מבחן MN. המשתמש טוען את קבצי ה- .daf הרצויים לתוכנת ה- AI, ולאחר מכן מקצה אובייקטים למחלקות מודל האמת הקרקעית באמצעות אשכול בסיוע AI (איור 2) ואלגוריתמי תיוג חיזוי (איור 3). לאחר שכל מחלקות מ...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

בדיקת מיקרוגרעין (MN) היא בדיקה מבוססת היטב לכימות נזק לדנ"א. עם זאת, ניקוד הבדיקה באמצעות טכניקות קונבנציונליות כגון מיקרוסקופיה ידנית או ניתוח תמונה מבוסס תכונות הוא מייגע ומאתגר. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לפיתוח מודל בינה מלאכותית כדי להבקיע את מבחן MN באמצעות נתוני ציטומטריה של זרימת הדמיה.

אוטומציה של בדיקת מיקרוגרעין באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה ובינה מלאכותית

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

ביצוע בדיקת מיקרוגרעין באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה מתגבר על מגבלות רבות של שיטות מסורתיות, כולל תפוקה נמוכה, שונות ניקוד וחוסר אישור חזותי של אירועים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי כל אירועי המפתח ניתן לרכוש באמצעות ציטומטריה זרימת הדמיה ולנתח באמצעות בינה מלאכותית. לשיטה זו יש פוטנציאל לשמש בסינון בקנה מידה גדול של כימיקלים ותרכובות אחרות כדי לבדוק רעילות בתפוקה גבוהה יותר מזו הקיימת כיום.כאשר בונים מודל AI חדש, האתגר העיקרי הוא להשיג מספיק תמונות של תאים עם מיקרו-גרעינים, ולכן חשוב להשתמש באלגוריתמים לתיוג תמונות. כדי להתחיל, הפעל את תוכנת הבינה המלאכותית או הבינה המלאכותית. תחת סוג ניסוי, לחץ על לחצן האפשרויות לצד רכבת כדי להתחיל ניסוי אימון לבניית רשת עצבית קונבולוציונית או מודל CNN, ולחץ על הבא.על שמות המחלקות, לחץ על הוסף. בחלון המוקפץ, הקלד Mononucleated, ולחץ על אישור כדי להוסיף את המחלקה mononucleated לרשימת שמות המחלקות. חזור על תהליך זה כדי להוסיף את שמות המחלקות האחרים, כגון Mononucleated עם MN, Binucleated, Binucleated עם MN, Polynucleated ומורפולוגיה לא סדירה.תחת Select Files, לחץ על Add Files, ואתר את הקבצים הרצויים שיתווספו לתוכנת AI, כדי לבנות את נתוני האמת הבסיסיים. לאחר מכן, במסך בחירת אוכלוסיית בסיס, אתר את האוכלוסייה הלא-אפופטוטית מהיררכיית האוכלוסין. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על האוכלוסייה הלא אפופטוטית, בחר בחר את כל האוכלוסיות התואמות, ולחץ על הבא.כדי להקצות אוכלוסיית אמת מתויגת של תאים חד-גרעיניים עם מיקרו-גרעין, לחץ על המחלקה Mononucleated with MN תחת Model Classes משמאל, ולאחר מכן לחץ על אוכלוסיית האמת המתויגת המתאימה מימין. לאחר הקצאת כל אוכלוסיות האמת המתאימות, לחץ על הבא. במסך Select Channels, ודא שנבחרו הערוצים המתאימים לניסוי.כאן, בחר שדה בהיר או BF כערוץ הראשון, עדרי DNA כערוץ שבע ולאחר מכן לחץ על הבא. לבסוף, במסך האישור, לחץ על צור ניסוי. לחץ על תיוג כדי להפעיל את ממשק כלי התיוג.לאחר מכן לחץ על כלי הזום כדי לחתוך את התמונות לצפייה קלה יותר. ולחץ על פס המחוון כדי להתאים את גודל התמונה ולהחליט על מספר התמונות שיוצגו בגלריה. לחץ על הגדרת התצוגה אפשרות ובחר min-max, המספקת את תמונת הניגודיות הטובה ביותר לזיהוי כל אירועי המפתח.לאחר מכן, לחץ על תצוגת גלריית הגדרות כדי לשנות את צבע תמונת ה- DNA לצהוב או לבן, מה שישפר את ההדמיה של אובייקטים קטנים. לחץ על אשכול כדי להפעיל את האלגוריתם כדי לקבץ תמונות עם מורפולוגיה דומה יחד. לאחר השלמת קיבוץ האשכולות, לחץ על האשכולות הבודדים והתחל להקצות תמונות למחלקות מודל מתאימות.לאחר הקצאת לפחות 25 אובייקטים לכל מחלקת מודל, אלגוריתם החיזוי הופך לזמין. לחץ על Predict. לאחר שאלגוריתם החיזוי סיים לפעול, הוסף אובייקטים מהמחלקות החזויות למחלקות המודל המתאימות.לאחר הקצאת לפחות 100 אובייקטים לכל מחלקת דגם, לחץ על הכרטיסייה אימון בחלק העליון של המסך ולאחר מכן לחץ על כפתור הרכבת. לאחר השלמת אימון המודל, לחץ על הצג תוצאות כדי להעריך את דיוק המודל. לאחר השלמת אימון המודל, לחץ על לחצן התפריט כדי להגדיר ניסוי חדש.תחת סוג ניסוי, לחץ על לחצן האפשרויות לצד סיווג כדי להתחיל ניסוי סיווג ולחץ על הבא. לחץ על המודל שישמש לסיווג, ולאחר מכן לחץ על הבא. במסך Select Files, לחץ על Add Files.אתר את הקבצים שיש לסווג לפי מודל CNN ולאחר מכן לחץ על הבא. לאחר מכן, במסך בחירת אוכלוסיית בסיס, לחץ על תיבת הסימון לצד האוכלוסייה הלא-אפופטוטית באחד הקבצים שנטענו. לחץ לחיצה ימנית על האוכלוסייה הלא אפופטוטית, לחץ על בחר את כל האוכלוסיות התואמות כדי לבחור אוכלוסייה זו מכל הקבצים הטעונים, ולאחר מכן לחץ על הבא.במסך Select Channels, ודא שהערוץ הראשון נבחר עבור Bright Field, וערוץ 7 נבחר עבור כתם ה- DNA ולחץ על Next. לבסוף, במסך האישור, לחץ על צור ניסוי. תוכנת הבינה המלאכותית טוענת את המודל שנבחר ואת כל התמונות מקבצי הנתונים שנבחרו.לאחר הטעינה, לחץ על סיום. לאחר מכן, לחץ על סיווג כדי להפעיל את מסך הסיווג. והשתמש בתיבות הסימון כדי לבחור להשתמש ב- Random Forest או RF וב- CNN.לאחר מכן לחץ על כפתור סיווג. פעולה זו מתחילה את תהליך השימוש במודלים RF ו- CNN כדי לסווג נתונים נוספים ולזהות את כל האובייקטים השייכים למחלקות המודל שצוינו. לאחר השלמת הסיווג, לחץ על הצג תוצאות.לחץ על הלחצן עדכן DAFs כדי להציג את חלון עדכון DAFs עם תוצאות סיווג ולאחר מכן לחץ על אישור כדי לעדכן את קבצי DAF. כדי להפיק את הדוח, במסך התוצאות, לחץ על צור דוח. אם נדרש דוח נפרד עבור כל DAF קלט, בחר בתיבת הסימון לצד צור דוח עבור כל DAF קלט.אחרת, פשוט לחץ על אישור כדי לקבל את הדוחות. אלגוריתם הצביר בסיוע AI מקבץ אובייקטים דומים בתוך מקטע יחד, על פי המורפולוגיה של שני האובייקטים הלא מסווגים והאובייקטים שהוקצו למחלקות מודל האמת הקרקעית. אשכולות המכילים תאים חד-גרעיניים נמצאים בצד אחד של מפת האובייקטים, בעוד שהתאים מרובי הגרעינים נמצאים בצד הנגדי.אשכולות תאים בינוקלציה נופלים בין אשכולות תאים מונו ומרובי גרעינים. לבסוף, אשכולות עם מורפולוגיה לא סדירה, נופלים באזורים שונים של מפת האובייקט. אלגוריתם החיזוי חזק יותר מאלגוריתם הצביר בזיהוי מורפולוגיות עדינות בתמונות.לדוגמה, תאים מונוגרעיניים עם MN לעומת תאים מונו-גרעיניים ללא MN. ניתן להעריך את ביצועי המודל באמצעות כלים, כולל היסטוגרמות התפלגות מחלקות, סטטיסטיקות דיוק ומטריצת בלבול אינטראקטיבית. בהיסטוגרמות של התפלגות מעמדית, ככל שערכי האחוזים קרובים יותר בין האמת לאוכלוסיות החזויות, כך המודל מדויק יותר. בסטטיסטיקת הדיוק, ככל שמדדים אלה קרובים יותר ל-100%, כך המודל מדויק יותר בזיהוי אירועים במחלקות המודל.לבסוף, מטריצת הבלבול האינטראקטיבית מציינת היכן המודל מפספס אירועים. גנוטוקסיות נמדדה על ידי אחוז המיקרו-גרעינים במיקרוסקופיה, המסומנת על ידי עמודות שקופות, ובינה מלאכותית שצוינה על ידי עמודות מנוקדות לאחר חשיפה של 3 שעות והתאוששות של 24 שעות, עבור מניטול, אטופוסיד ומיטומיצין C, תוך שימוש הן בשיטות ציטוכלסין B והן בשיטות שאינן ציטוכלסין B. בעת יצירת ניסוי אימון, ודא שהנתונים הטעונים מכילים תמונות מדגימות בקרה חיוביות ושליליות.מיקרו-גרעינים הם נדירים, ונדרשות מספיק תמונות כדי לבנות מודל AI מדויק. הליך זה מאפשר יצירת מודלים של בינה מלאכותית לניתוח נתוני מיקרוגרעין זרימת הדמיה בכל תחום מחקר, כגון ביודוזימטריה של קרינה. שיטה מהירה וחזקה מבוססת בינה מלאכותית לזיהוי מיקרו-גרעינים, עשויה להתרחב ליישומים אחרים, כגון כימות מיקרו-גרעינים שעשויים לחזות את הסיכון להתפתחות סרטן.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

מיקרוסקופי שדה רחב פלורסנט וזרימת cytometry הדמית פלורסנט בטלפון סלולרי

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

לוקליזציה וכימות יחסית של פחמן בתאים עם Multispectral הדמיה תזרים cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

סרטן השחלות האיתור באמצעות פוטואקוסטי זרימה Cy, לנסות

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

הדמיית זרימת דם עם דופלר אולטרה מהיר

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...