Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
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1. Acquisizione dati mediante citometria a flusso di imaging
NOTA: Fare riferimento a Rodrigues et al.16 con le seguenti modifiche, notando che le regioni di acquisizione utilizzando IFC potrebbero dover essere modificate per un'acquisizione ottimale dell'immagine:
<ol><li>Per il metodo non-Cyt-B, eseguire un conteggio delle cellule utilizzando un contatore di cellule disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedere la ta...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

Il lavoro qui presentato descrive l'uso di algoritmi di deep learning per automatizzare il punteggio del test MN. Diverse pubblicazioni recenti hanno dimostrato che strumenti intuitivi e interattivi consentono la creazione di modelli di deep learning per analizzare i dati delle immagini senza la necessità di conoscenze computazionali approfondite18,19. Il protocollo descritto in questo lavoro utilizzando un pacchetto software basato sull'interfaccia utente è st...

Il test del micronucleo (MN) è fondamentale nella tossicologia genetica per valutare il danno al DNA nello sviluppo di cosmetici, prodotti farmaceutici e chimici per uso umano 1,2,3,4. I micronuclei sono formati da interi cromosomi o frammenti cromosomici che non si incorporano nel nucleo dopo la divisione e si condensano in piccoli corpi circolari separati dal nucleo. Pertanto, il MN può essere utilizzato come endpoint per quantificare il danno al DNA nei test di genotossicità1.
Il metodo preferito per quantificare la MN è all'interno di cellule binucleate (BNC) una volta divise bloccando la divisione utilizzando la citocalasina-B (Cyt-B). In questa versione del test, la citotossicità viene valutata anche segnando cellule mononucleate (MONO) e polinucleate (POLY). Il test può anche essere eseguito assegnando un punteggio MN in cellule MONO non bloccate, che è più veloce e più facile da valutare, con la citotossicità valutata utilizzando la conta cellulare pre e post-esposizione per valutare la proliferazione 5,6.
Il punteggio fisico del test è stato storicamente eseguito attraverso la microscopia manuale, poiché ciò consente la conferma visiva di tutti gli eventi chiave. Tuttavia, la microscopia manuale è impegnativa e soggettiva1. Pertanto, sono state sviluppate tecniche automatizzate, tra cui la scansione del vetrino da microscopio e la citometria a flusso, ognuna con i propri vantaggi e limiti. Mentre i metodi di scansione dei vetrini consentono di visualizzare gli eventi chiave, i vetrini devono essere creati con una densità di cella ottimale, che può essere difficile da raggiungere. Inoltre, questa tecnica spesso manca di visualizzazione citoplasmatica, che può compromettere il punteggio delle cellule MONO e POLY 7,8. Mentre la citometria a flusso offre un'acquisizione di dati ad alto rendimento, le cellule devono essere lisate, quindi non consentendo l'uso della forma Cyt-B del test. Inoltre, come tecnica non-imaging, la citometria a flusso convenzionale non fornisce la convalida visiva degli eventi chiave 9,10.
Pertanto, la citometria a flusso di imaging (IFC) è stata studiata per eseguire il test MN. ImageStreamX Mk II combina la velocità e la robustezza statistica della citometria a flusso convenzionale con le capacità di imaging ad alta risoluzione della microscopia in un unico sistema11. È stato dimostrato che utilizzando IFC, le immagini ad alta risoluzione di tutti gli eventi chiave possono essere catturate e valutate automaticamente utilizzando tecniche basate su funzionalità 12,13 o intelligenza artificiale (AI) 14,15. Utilizzando IFC per eseguire il test MN, è possibile ottenere il punteggio automatico di molte più cellule rispetto alla microscopia in un lasso di tempo più breve.
Questo lavoro si discosta da un flusso di lavoro di analisi delle immagini precedentemente descritto16 e discute tutti i passaggi necessari per sviluppare e addestrare un modello di foresta casuale (RF) e / o rete neurale convoluzionale (CNN) utilizzando il software Amnis AI (d'ora in poi denominato "software AI"). Vengono descritti tutti i passaggi necessari, tra cui il popolamento dei dati di verità sul terreno utilizzando strumenti di tagging assistiti dall'IA, l'interpretazione dei risultati dell'addestramento del modello e l'applicazione del modello per classificare dati aggiuntivi, consentendo il calcolo della genotossicità e della citotossicità15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

Il test del micronucleo (MN) viene utilizzato in tutto il mondo dagli organismi di regolamentazione per valutare le sostanze chimiche per la tossicità genetica. Il test può essere eseguito in due modi: segnando MN in cellule binucleate una volta divise, bloccate dalla citochinesi o cellule mononucleate completamente divise. Storicamente, la microscopia ottica è stata il metodo gold standard per valutare il test, ma è laboriosa e soggettiva. La citometria a flusso è stata utilizzata negli ultimi anni per valutare il test, ma è limitata dall'incapacità di confermare visivamente aspetti chiave delle immagini cellulari. La citometria a flusso di imaging (IFC) combina l'acquisizione di immagini ad alta produttività e l'analisi automatizzata delle immagini ed è stata applicata con successo per acquisire rapidamente immagini e valutare tutti gli eventi chiave nel test MN. Recentemente, è stato dimostrato che i metodi di intelligenza artificiale (AI) basati su reti neurali convoluzionali possono essere utilizzati per valutare i dati del saggio MN acquisiti da IFC. Questo documento descrive tutti i passaggi per utilizzare il software di intelligenza artificiale per creare un modello di deep learning per valutare tutti gli eventi chiave e applicare questo modello per assegnare automaticamente un punteggio a dati aggiuntivi. I risultati del modello di deep learning AI si confrontano bene con la microscopia manuale, consentendo quindi un punteggio completamente automatizzato del test MN combinando IFC e AI.

La Figura 1 mostra il flusso di lavoro per l'utilizzo del software AI per creare un modello per il test MN. L'utente carica i file .daf desiderati nel software AI, quindi assegna gli oggetti alle classi del modello di verità di terra utilizzando gli algoritmi di tagging cluster assistito da AI (Figura 2) e predict (Figura 3). Una volta che tutte le classi del modello di verità di base sono state popolate con oggetti sufficienti, i...

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Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

Il test del micronucleo (MN) è un test ben consolidato per quantificare il danno al DNA. Tuttavia, la valutazione del test utilizzando tecniche convenzionali come la microscopia manuale o l'analisi delle immagini basata sulle caratteristiche è laboriosa e impegnativa. Questo articolo descrive la metodologia per sviluppare un modello di intelligenza artificiale per valutare il test MN utilizzando i dati di citometria a flusso di imaging.

Automazione del test del micronucleo mediante citometria a flusso di imaging e intelligenza artificiale

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

L'esecuzione del test del micronucleo utilizzando la citometria a flusso di imaging supera molte limitazioni dei metodi tradizionali, tra cui bassa produttività, variabilità del punteggio e mancanza di conferma visiva degli eventi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che tutti gli eventi chiave possono essere acquisiti utilizzando la citometria a flusso di imaging e analizzati utilizzando l'intelligenza artificiale. Questo metodo ha il potenziale per essere utilizzato nello screening su larga scala di sostanze chimiche e altri composti per testare la tossicità a un rendimento superiore a quello attualmente disponibile.Quando si costruisce un nuovo modello di intelligenza artificiale, la sfida principale è ottenere immagini sufficienti di cellule con micronuclei, quindi è importante utilizzare gli algoritmi di tagging delle immagini. Per iniziare, avvia il software di intelligenza artificiale o AI. In Tipo esperimento, fare clic sul pulsante di opzione accanto a Treno per avviare un esperimento di addestramento per la creazione del modello di rete neurale convoluzionale o CNN e fare clic su Avanti.Nei nomi delle classi, fare clic su Aggiungi. Nella finestra pop-up, digitare Mononucleated e fare clic su OK per aggiungere la classe mononucleata all'elenco dei nomi delle classi. Ripetere questo processo per aggiungere gli altri nomi di classe, ad esempio Mononucleato con MN, Binucleato, Binucleato con MN, Polinucleato e Morfologia irregolare.In Seleziona file, fai clic su Aggiungi file e cerca i file desiderati da aggiungere al software AI, per creare i dati di verità di base. Quindi, nella schermata Seleziona popolazione di base, individuare la popolazione non apoptotica dalla gerarchia della popolazione. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sulla popolazione non apoptotica, scegliere Seleziona tutte le popolazioni corrispondenti e fare clic su Avanti.Per assegnare una popolazione di verità taggata di cellule mononucleate con micronucleo, fare clic sulla classe Mononucleata con MN in Classi modello a sinistra, quindi fare clic sulla popolazione di verità con tag appropriata a destra. Una volta assegnate tutte le popolazioni di verità appropriate, fare clic su Avanti. Nella schermata Seleziona canali, assicurati che siano stati scelti i canali appropriati per l'esperimento.Qui, scegliere Campo luminoso o BF come canale uno, mandrie per DNA come canale sette, quindi fare clic su Avanti. Infine, nella schermata di conferma, fai clic su Crea esperimento. Fare clic su Tagging per avviare l'interfaccia dello strumento di tagging.Quindi fare clic sugli strumenti di zoom per ritagliare le immagini per una visualizzazione più semplice. E fai clic sulla barra di scorrimento per regolare le dimensioni dell'immagine e decidere il numero di immagini da mostrare nella galleria. Fare clic sull'opzione Impostazioni schermo e scegliere min-max, che fornisce la migliore immagine di contrasto per identificare tutti gli eventi chiave.Quindi, fai clic su Imposta display galleria per cambiare il colore dell'immagine del DNA in giallo o bianco, che migliorerà la visualizzazione di piccoli oggetti. Fare clic su Cluster per eseguire l'algoritmo per raggruppare immagini con morfologia simile. Una volta completato il clustering, fare clic sui singoli cluster e iniziare ad assegnare le immagini alle classi di modello appropriate.Dopo l'assegnazione di un minimo di 25 oggetti a ciascuna classe del modello, l'algoritmo di previsione diventa disponibile. Fare clic su Prevedi. Una volta completata l'esecuzione dell'algoritmo di previsione, aggiungere oggetti dalle classi previste alle classi di modello appropriate.Una volta assegnato un minimo di 100 oggetti a ciascuna classe di modello, fare clic sulla scheda Formazione nella parte superiore dello schermo, quindi fare clic sul pulsante Treno. Una volta completato il training del modello, fare clic su Visualizza risultati per valutare l'accuratezza del modello. Una volta completato il training del modello, fare clic sul pulsante menu per definire un nuovo esperimento.In Tipo di esperimento fare clic sul pulsante di opzione accanto a Classifica per avviare un esperimento di classificazione e fare clic su Avanti. Fare clic sul modello da utilizzare per la classificazione, quindi fare clic su Avanti. Nella schermata Seleziona file, fare clic su Aggiungi file.Cercare i file da classificare in base al modello CNN, quindi fare clic su Avanti. Successivamente, nella schermata Seleziona popolazione di base, fare clic sulla casella di controllo accanto alla popolazione non apoptotica in uno dei file caricati. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla popolazione non apoptotica, fare clic su Seleziona tutte le popolazioni corrispondenti per selezionare questa popolazione da tutti i file caricati, quindi fare clic su Avanti.Nella schermata Seleziona canali, verificare che il canale uno sia selezionato per il campo luminoso e che il canale sette sia selezionato per la colorazione DNA, quindi fare clic su Avanti. Infine, nella schermata di conferma, fai clic su Crea esperimento. Il software AI carica il modello selezionato e tutte le immagini dai file di dati scelti.Dopo il caricamento, fare clic su Fine. Quindi, fare clic su Classifica per avviare la schermata di classificazione. E utilizzare le caselle di controllo per scegliere di utilizzare Foresta casuale o RF e CNN.Quindi fare clic sul pulsante Classifica. In questo modo viene avviato il processo di utilizzo dei modelli RF e CNN per classificare dati aggiuntivi e identificare tutti gli oggetti che appartengono alle classi di modello specificate. Una volta completata la classificazione, fare clic su Visualizza risultati.Fare clic sul pulsante Aggiorna DAF per visualizzare la finestra dei DAF di aggiornamento con i risultati della classificazione, quindi fare clic su OK per aggiornare i file DAF. Per generare il report, nella schermata dei risultati, fare clic su Genera report. Se è necessario un singolo report per ogni DAF di input, selezionare la casella di controllo accanto a Crea report per ogni DAF di input.Altrimenti, fai clic su OK per ottenere i rapporti. L'algoritmo di cluster assistito dall'IA raggruppa oggetti simili all'interno di un segmento, in base alla morfologia sia degli oggetti non classificati che degli oggetti che sono stati assegnati alle classi del modello di verità di base. I cluster contenenti cellule mononucleate cadono su un lato della mappa degli oggetti, mentre le cellule multinucleate sono sul lato opposto.I cluster di cellule binucleate cadono tra cluster di cellule mono e multinucleate. Infine, i cluster con morfologia irregolare, cadono in diverse aree della mappa degli oggetti. L'algoritmo di previsione è più robusto dell'algoritmo cluster nell'identificazione di morfologie sottili nelle immagini.Ad esempio, celle mononucleate con MN contro celle mononucleate senza MN. Le prestazioni del modello possono essere valutate utilizzando strumenti, tra cui istogrammi di distribuzione di classe, statistiche di accuratezza e una matrice di confusione interattiva. Negli istogrammi di distribuzione per classe, più vicini sono i valori percentuali tra la verità e le popolazioni previste, più accurato è il modello. Nelle statistiche di accuratezza, più queste metriche sono vicine al 100%, più accurato è il modello nell'identificare gli eventi nelle classi del modello.Infine, la matrice di confusione interattiva indica dove il modello non classifica gli eventi. La genotossicità è stata misurata dalla percentuale di micronuclei al microscopio, indicata da barre trasparenti, e AI indicata da barre punteggiate dopo un'esposizione di 3 ore e un recupero di 24 ore, per mannitolo, etoposide e mitomicina C, utilizzando entrambi i metodi della citocalasina B e della non citocalasina B. Quando crei un esperimento di addestramento, assicurati che i dati caricati contengano immagini provenienti da campioni di controllo positivi e negativi.I micronuclei sono rari e sono necessarie immagini sufficienti per costruire un modello di intelligenza artificiale accurato. Questa procedura consente la creazione di modelli AI per analizzare i dati del micronucleo del flusso di imaging in qualsiasi campo di studio, come la biodosimetria delle radiazioni. Un metodo rapido e robusto basato sull'intelligenza artificiale per identificare i micronuclei può estendersi ad altre applicazioni, come la quantificazione dei micronuclei che possono essere predittivi per il rischio di sviluppo del cancro.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Ricerca

Bioingegneria

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Ampio campo di microscopia a fluorescenza e citometria di flusso Imaging fluorescente su un telefono cellulare

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Rilevazione sensibile di Proteopathic Semina attività con FRET Citometria a flusso

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Un metodo automatizzato per eseguire l'analisi in vitro micronucleoutilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Citometria a flusso ad alta dimensionalità per l'analisi della funzione immunitaria di tessuti implantari sezionati

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Imaging del flusso sanguigno con Doppler ultraveloce

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...