Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
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1. イメージングフローサイトメトリーを用いたデータ取得
注:Rodrigues et al.16 を参照し、次の変更を加えて、IFCを使用する取得領域を最適な画像キャプチャのために変更する必要があるかもしれないことに注意してください。
<ol><li>Non-Cyt-B法の場合は、培養直前および回収期間直後の各培養液について、製造元の説明書( 材料表?...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

ここで紹介する研究では、MNアッセイのスコアリングを自動化するためのディープラーニングアルゴリズムの使用について説明しています。最近のいくつかの出版物は、直感的でインタラクティブなツールが、深い計算知識を必要とせずに画像データを分析するための深層学習モデルの作成を可能にすることを示しています18,19。ユーザーインター?...

小核(MN)アッセイは、ヒト用の化粧品、医薬品、および化学物質の開発におけるDNA損傷を評価するための遺伝毒物学の基本です1,2,3,4。小核は、分裂後に核に取り込まれず、核とは別の小さな円形体に凝縮する染色体全体または染色体断片から形成されます。したがって、MNは、遺伝毒性試験1におけるDNA損傷を定量するためのエンドポイントとして使用できます。
MNを定量するための好ましい方法は、サイトカラシン-B(Cyt-B)を用いて分裂をブロックすることによって一回分裂した二核細胞(BNC)内である。このバージョンのアッセイでは、細胞毒性は、単核(MONO)および多核(POLY)細胞のスコアリングによっても評価されます。このアッセイは、ブロックされていないMONO細胞におけるMNをスコアリングすることによっても実行することができ、これはより速く、より簡単にスコアリングすることができ、増殖を評価するために曝露前および曝露後の細胞カウントを使用して細胞毒性を評価する5,6。
アッセイの物理的スコアリングは、すべての重要なイベントを視覚的に確認できるため、歴史的に手動顕微鏡によって行われてきました。しかし、手動顕微鏡は困難で主観的です1。そのため、顕微鏡スライドスキャンやフローサイトメトリーなどの自動化技術が開発されていますが、それぞれに独自の利点と制限があります。スライドスキャン法では重要なイベントを視覚化できますが、スライドは最適なセル密度で作成する必要があり、達成が困難な場合があります。さらに、この手法は細胞質の可視化を欠いていることが多く、MONO細胞とPOLY細胞のスコアリングを損なう可能性があります7,8。フローサイトメトリーはハイスループットなデータキャプチャを提供しますが、細胞を溶解する必要があるため、Cyt-B型のアッセイを使用することはできません。さらに、非イメージング技術として、従来のフローサイトメトリーは重要な事象の視覚的検証を提供しない9、10。
そのため、MNアッセイを行うためにイメージングフローサイトメトリー(IFC)が検討されている。ImageStreamX Mk IIは、従来のフローサイトメトリーの速度と統計的堅牢性を、顕微鏡の高解像度イメージング機能を単一のシステムで組み合わせた11。IFCを使用することにより、すべての主要なイベントの高解像度画像をキャプチャし、特徴ベースの12,13または人工知能(AI)技術14,15を使用して自動的にスコアリングできることが示されています。IFCを使用してMNアッセイを行うことにより、顕微鏡検査と比較して、より短時間でより多くの細胞を自動的にスコアリングすることができます。
この作業は、前述の画像分析ワークフロー16 から逸脱し、Amnis AIソフトウェア(以下「AIソフトウェア」と呼ぶ)を使用してランダムフォレスト(RF)および/または畳み込みニューラルネットワーク(CNN)モデルを開発およびトレーニングするために必要なすべてのステップについて説明します。AI支援タグ付けツールを使用したグラウンドトゥルースデータの入力、モデルトレーニング結果の解釈、追加データを分類するためのモデルの適用など、必要なすべてのステップが説明されており、遺伝毒性と細胞毒性の計算が可能になります15。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

小核(MN)アッセイは、化学物質の遺伝毒性を評価するために世界中の規制機関によって使用されています。アッセイは2つの方法で実施することができる:一度分裂した、細胞質分裂がブロックされた二核細胞または完全に分裂した単核細胞におけるMNをスコアリングすることによって。歴史的に、光学顕微鏡はアッセイをスコアリングするためのゴールドスタンダードの方法でしたが、それは面倒で主観的です。フローサイトメトリーは、近年、アッセイのスコアリングに使用されていますが、細胞画像の重要な側面を視覚的に確認できないため、制限されています。イメージングフローサイトメトリー(IFC)は、ハイスループット画像キャプチャと自動画像解析を組み合わせたもので、MNアッセイのすべての重要なイベントの画像を迅速に取得し、スコアリングするために成功裏に適用されています。最近、畳み込みニューラルネットワークに基づく人工知能(AI)手法を使用して、IFCが取得したMNアッセイデータをスコアリングできることが実証されました。このホワイトペーパーでは、AIソフトウェアを使用してディープラーニングモデルを作成し、すべての主要なイベントをスコアリングし、このモデルを適用して追加データを自動的にスコアリングするためのすべての手順について説明します。AIディープラーニングモデルの結果は、手動顕微鏡と比較して優れているため、IFCとAIを組み合わせることでMNアッセイの完全に自動化されたスコアリングが可能になります。

図1は、AIソフトウェアを使用してMNアッセイのモデルを作成するためのワークフローを示しています。ユーザーは、目的の.dafファイルをAIソフトウェアにロードし、AI支援クラスター(図2)と予測(図3)タグ付けアルゴリズムを使用して、オブジェクトをグラウンドトゥルースモデルクラスに割り当てます。すべてのグラウンドト...

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Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

小核(MN)アッセイは、DNA損傷を定量化するための確立されたテストです。ただし、手動顕微鏡や特徴ベースの画像分析などの従来の手法を使用してアッセイをスコアリングすることは、面倒で困難です。この論文では、イメージングフローサイトメトリーデータを使用してMNアッセイをスコアリングするための人工知能モデルを開発する方法論について説明します。

イメージングフローサイトメトリーと人工知能を用いた小核アッセイの自動化

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

イメージングフローサイトメトリーを使用して小核アッセイを実行すると、スループットの低さ、スコアのばらつき、イベントの目視による確認の欠如など、従来の方法の多くの制限を克服できます。この手法の主な利点は、すべての重要なイベントをイメージングフローサイトメトリーを使用して取得し、人工知能を使用して分析できることです。この方法は、化学物質やその他の化合物の大規模なスクリーニングに使用され、現在利用可能なよりも高いスループットで毒性を試験できる可能性があります。新しいAIモデルを構築する場合、小核を持つ細胞の十分な画像を取得することが主な課題であるため、画像タグ付けアルゴリズムを使用することが重要です。まず、人工知能またはAIソフトウェアを起動します。[実験の種類] で、[トレーニング] の横にあるラジオ ボタンをクリックして、畳み込みニューラル ネットワークまたは CNN モデルを構築するためのトレーニング実験を開始し、[次へ] をクリックします。[クラス名] で、[追加] をクリックします。ポップアップウィンドウで、単核クラスと入力し、[OK]をクリックして単核クラスをクラス名のリストに追加します。このプロセスを繰り返して、MNで単核、二核、MNで二核、多核、不規則な形態などの他のクラス名を追加します。[ファイルの選択]で、[ファイルの追加]をクリックし、AIソフトウェアに追加する目的のファイルを参照して、グラウンドトゥルースデータを構築します。次に、[ベースポピュレーションの選択] 画面で、ポピュレーション階層から非アポトーシスポピュレーションを見つけます。次に、非アポトーシス集団を右クリックし、[一致するすべての集団を選択]を選択して、[次へ]をクリックします。小核を持つ単核細胞のタグ付き真理値集団を割り当てるには、左側のモデルクラスで単核細胞とMNクラスをクリックし、右側で適切なタグ付けされた真理値母集団をクリックします。すべての適切な真理値母集団が割り当てられたら、次へをクリックします。[チャネルの選択] 画面で、実験に適したチャネルが選択されていることを確認します。ここでは、チャネル1として明視野またはBFを選択し、チャネル7としてDNAの群れを選択し、[次へ]をクリックします。最後に、[確認] 画面で [実験の作成] をクリックします。[タグ付け]をクリックして、タグ付けツールのインターフェイスを起動します。次に、ズームツールをクリックして、見やすくするために画像をトリミングします。そして、スライダーバーをクリックして画像サイズを調整し、ギャラリーに表示する画像の数を決定します。[表示設定]オプションをクリックし、すべての主要なイベントを識別するのに最適なコントラスト画像を提供するmin-maxを選択します。次に、[ギャラリーディスプレイのセットアップ]をクリックして、DNA画像の色を黄色または白に変更し、小さなオブジェクトの視覚化を改善します。[クラスター] をクリックしてアルゴリズムを実行し、類似した形態を持つ画像をグループ化します。クラスタリングが完了したら、個々のクラスタをクリックして、適切なモデルクラスへの画像の割り当てを開始します。各モデル クラスに少なくとも 25 個のオブジェクトが割り当てられると、予測アルゴリズムが使用可能になります。[予測] をクリックします。予測アルゴリズムの実行が完了したら、予測クラスから適切なモデル クラスにオブジェクトを追加します。各モデル クラスに最低 100 個のオブジェクトが割り当てられたら、画面上部の [トレーニング] タブをクリックし、[トレーニング] ボタンをクリックします。モデルのトレーニングが完了したら、[結果の表示] をクリックしてモデルの精度を評価します。モデルのトレーニングが完了したら、メニュー ボタンをクリックして新しい実験を定義します。[実験の種類] で、[分類] の横にあるラジオ ボタンをクリックして分類実験を開始し、[次へ] をクリックします。分類に使用するモデルをクリックし、[次へ] をクリックします。[ファイルの選択]画面で、[ファイルの追加]をクリックします。CNN モデルで分類するファイルを参照し、[次へ] をクリックします。次に、[ベースポピュレーションの選択]画面で、ロードされたファイルの1つで[非アポトーシスポピュレーション]の横にあるチェックボックスをクリックします。非アポトーシス集団を右クリックし、[一致するすべての集団を選択]をクリックして、ロードされたすべてのファイルからこの母集団を選択し、[次へ]をクリックします。チャンネルの選択画面で、明視野にチャンネル1が選択され、DNA染色にチャンネル7が選択されていることを確認し、次へをクリックします。最後に、確認画面で [実験の作成] をクリックします。AIソフトウェアは、選択したデータファイルから選択したモデルとすべての画像をロードします。ロード後、[完了]をクリックします。次に、[分類]をクリックして分類画面を起動します。また、チェックボックスを使用して、ランダムフォレストまたはRF、およびCNNの使用を選択します。次に、[分類]ボタンをクリックします。これにより、RF モデルと CNN モデルを使用して追加データを分類し、指定したモデル クラスに属するすべてのオブジェクトを識別するプロセスが開始されます。分類が完了したら、[結果の表示] をクリックします。[DAFの更新]ボタンをクリックして[分類結果を含むDAFの更新]ウィンドウを表示し、[OK]をクリックしてDAFファイルを更新します。レポートを生成するには、結果画面で [レポートの生成] をクリックします。入力 DAF ごとに個別のレポートが必要な場合は、[入力 DAF ごとにレポートを作成] の横にあるチェックボックスをオンにします。それ以外の場合は、[OK]をクリックしてレポートを取得します。AI支援クラスターアルゴリズムは、未分類のオブジェクトとグラウンドトゥルースモデルクラスに割り当てられたオブジェクトの両方の形態に従って、セグメント内の類似したオブジェクトをグループ化します。単核細胞を含むクラスターはオブジェクト マップの片側にあり、多核細胞は反対側にあります。二核細胞クラスターは、単核細胞クラスターと多核細胞クラスターの間にあります。最後に、不規則な形態を持つクラスターは、オブジェクトマップのさまざまな領域に分類されます。予測アルゴリズムは、画像内の微妙な形態を識別する上で、クラスターアルゴリズムよりも堅牢です。例えば、MNを含む単核細胞とMNを含まない単核細胞。モデルのパフォーマンスは、クラス分布ヒストグラム、精度統計、対話型混同行列などのツールを使用して評価できます。クラス分布ヒストグラムでは、真理値と予測母集団の間のパーセンテージ値に近いほど、モデルの精度が高くなります。精度統計では、これらのメトリックが 100% に近いほど、モデルはモデル クラス内のイベントをより正確に識別できます。最後に、対話型の混同行列は、モデルがイベントを誤って分類する場所を示します。遺伝毒性は、サイトカラシンB法と非サイトカラシンB法の両方を使用して、マンニトール、エトポシド、マイトマイシンCについて、顕微鏡による小核の割合(明確なバーで示され、AIは点線のバーで示され、3時間の曝露と24時間の回復後)で測定されました。トレーニング実験を作成するときは、読み込んだデータにポジティブ コントロール サンプルとネガティブ コントロール サンプルの画像が含まれていることを確認します。小核はまれであり、正確なAIモデルを構築するには十分な画像が必要です。この手順により、放射線生物線量測定などのあらゆる研究分野でイメージングフロー小核データを分析するためのAIモデルを作成できます。小核を特定するための迅速かつ堅牢なAIベースの方法は、癌発生のリスクを予測する可能性のある小核の定量化など、他のアプリケーションに拡張される可能性があります。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

携帯電話上の広視野蛍光顕微鏡と蛍光イメージングフローサイトメトリー

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

光音響フローサイトメトリーを用いた卵巣癌検出

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

超高速ドップラーによる血流イメージング

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...