Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
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1. 이미징 유세포 분석을 이용한 데이터 수집
참고: 최적의 이미지 캡처를 위해 IFC를 사용하는 획득 영역을 수정해야 할 수도 있다는 점에 유의하여 다음과 같이 수정한 Rodrigues et al.16 을 참조하십시오.
<ol><li>non-Cyt-B 방법의 경우, 배양 직전 및 회수 기간 직후의 각 배양물에 대해 제조업체의 지침( 재료 표 참조)에 따라 시판되는 세?...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

여기에 제시된 작업은 딥 러닝 알고리즘을 사용하여 MN 분석의 스코어링을 자동화하는 방법을 설명합니다. 몇몇 최근의 간행물들은 직관적이고, 상호작용적인 도구들이 심층적인 계산 지식(18,19)에 대한 필요 없이 이미지 데이터를 분석하기 위한 딥 러닝 모델들의 생성들을 허용한다는 것을 보여주었다. 사용자 인터페이스 기반 소프트웨어 패키지를 사...

소핵(micronucleus, MN) 분석은 인체용 화장품, 의약품 및 화학물질 개발에서 DNA 손상을 평가하기 위한 유전독성학의 기본이다 1,2,3,4. 소핵은 분열 후 핵에 통합되지 않고 핵과 분리된 작은 원형체로 응축되는 전체 염색체 또는 염색체 조각으로 형성됩니다. 따라서, MN은 유전독성 시험1에서 DNA 손상을 정량화하기 위한 종말점으로 사용될 수 있다.
MN을 정량화하는 데 선호되는 방법은 Cyt-B(Cyt-B)를 사용하여 분열을 차단하여 일회성 분열 이핵 세포(BNC) 내에서 하는 것입니다. 이 버전의 분석에서 세포 독성은 단핵구(MONO) 및 다핵구(POLY) 세포의 점수를 매겨 평가됩니다. 이 분석은 또한 증식을 평가하기 위해 노출 전 및 노출 후 세포 수를 사용하여 세포 독성을 평가하여 더 빠르고 쉽게 점수를 매길 수 있는 차단되지 않은 MONO 세포에서 MN을 채점하여 수행할 수 있습니다 5,6.
분석의 물리적 채점은 역사적으로 수동 현미경을 통해 수행되어 왔으며, 이를 통해 모든 주요 이벤트를 시각적으로 확인할 수 있습니다. 그러나 수동 현미경 검사는 어렵고 주관적입니다1. 따라서 현미경 슬라이드 스캐닝 및 유세포 분석을 포함한 자동화 기술이 개발되었으며 각각 고유한 장점과 한계가 있습니다. 슬라이드 스캐닝 방법을 사용하면 주요 이벤트를 시각화할 수 있지만 슬라이드는 최적의 세포 밀도로 생성되어야 하므로 달성하기 어려울 수 있습니다. 또한, 이 기술은 종종 세포질 시각화가 부족하여 MONO 및 POLY 세포의 스코어링을 손상시킬 수 있습니다 7,8. 유세포 분석은 고처리량 데이터 캡처를 제공하지만 세포를 용해해야 하므로 Cyt-B 형태의 분석을 사용할 수 없습니다. 추가적으로, 비이미징 기술로서, 종래의 유세포 분석은 주요 이벤트(9,10)의 시각적 검증을 제공하지 않는다.
따라서, MN 분석을 수행하기 위해 이미징 유세포 분석법(IFC)이 조사되었다. ImageStreamX Mk II는 기존 유세포 분석의 속도 및 통계적 견고성과 현미경의 고분해능 이미징 기능을 단일 시스템11에 결합합니다. IFC를 사용함으로써, 모든 주요 이벤트들의 고해상도 이미지가 캡처될 수 있고, 특징-기반(12,13) 또는 인공지능(AI) 기술들(14,15)을 사용하여 자동으로 스코어링될 수 있다는 것이 보여졌다. IFC를 사용하여 MN 분석을 수행함으로써 더 짧은 시간 내에 현미경에 비해 더 많은 세포의 자동 스코어링을 달성할 수 있습니다.
이 작업은 이전에 설명된 이미지 분석 워크플로우(16 )에서 벗어나 Amnis AI 소프트웨어(이하 "AI 소프트웨어"로 지칭됨)를 사용하여 랜덤 포레스트(RF) 및/또는 컨볼루션 신경망(CNN) 모델을 개발하고 훈련하는 데 필요한 모든 단계를 논의합니다. AI 지원 태깅 도구를 사용하여 실측 데이터를 채우고, 모델 학습 결과를 해석하고, 추가 데이터를 분류하기 위한 모델 적용, 유전독성 및 세포독성계산 허용 등 필요한 모든 단계를 설명합니다 15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

소핵(MN) 분석은 유전 독성에 대한 화학 물질을 평가하기 위해 전 세계적으로 규제 기관에서 사용됩니다. 분석은 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다: 한 번 분할된 사이토카인시스 차단 이핵세포 또는 완전히 분할된 단핵구 세포에서 MN을 채점합니다. 역사적으로 광학 현미경은 분석에 점수를 매기는 황금 표준 방법이었지만 힘들고 주관적입니다. 유세포 분석은 최근 몇 년 동안 분석의 점수를 매기기 위해 사용되었지만 세포 이미지의 주요 측면을 시각적으로 확인할 수 없기 때문에 제한적입니다. 이미징 유세포 분석(IFC)은 고처리량 이미지 캡처와 자동화된 이미지 분석을 결합하며, MN 분석에서 모든 주요 이벤트의 이미지를 빠르게 획득하고 점수를 매기는 데 성공적으로 적용되었습니다. 최근에는 컨볼루션 신경망을 기반으로 하는 인공 지능(AI) 방법을 사용하여 IFC에서 획득한 MN 분석 데이터의 점수를 매길 수 있음이 입증되었습니다. 이 백서에서는 AI 소프트웨어를 사용하여 딥 러닝 모델을 만들어 모든 주요 이벤트에 점수를 매기고 이 모델을 적용하여 추가 데이터에 자동으로 점수를 매기는 모든 단계를 설명합니다. AI 딥 러닝 모델의 결과는 수동 현미경과 잘 비교되므로 IFC와 AI를 결합하여 MN 분석의 완전 자동 스코어링이 가능합니다.

그림 1은 AI 소프트웨어를 사용하여 MN 분석을 위한 모델을 생성하는 워크플로우를 보여줍니다. 사용자는 원하는 .daf 파일을 AI 소프트웨어에 로드한 다음 AI 지원 클러스터(그림 2) 및 예측(그림 3) 태깅 알고리즘을 사용하여 실측 자료 모델 클래스에 객체를 할당합니다. 모든 실측 모델 클래스가 충분한 객체로 채워지면 RF 또는 CNN ?...

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Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

소핵(MN) 분석은 DNA 손상을 정량화하기 위한 잘 확립된 검사입니다. 그러나 수동 현미경 또는 특징 기반 이미지 분석과 같은 기존 기술을 사용하여 분석에 점수를 매기는 것은 힘들고 어렵습니다. 이 논문은 이미징 유세포 분석 데이터를 사용하여 MN 분석의 점수를 매기는 인공 지능 모델을 개발하는 방법론을 설명합니다.

이미징 유세포 분석 및 인공 지능을 사용한 소핵 분석의 자동화

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

이미징 유세포 분석을 사용하여 소핵 분석을 수행하면 낮은 처리량, 점수 변동성 및 이벤트의 시각적 확인 부족을 포함하여 기존 방법의 많은 한계를 극복할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 이미징 유세포 분석을 사용하여 모든 주요 이벤트를 획득하고 인공 지능을 사용하여 분석할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 현재 사용 가능한 것보다 더 높은 처리량으로 독성을 테스트하기 위해 화학 물질 및 기타 화합물의 대규모 스크리닝에 사용될 가능성이 있습니다.새로운 AI 모델을 구축할 때 주요 과제는 소핵이 있는 세포의 충분한 이미지를 얻는 것이므로 이미지 태깅 알고리즘을 사용하는 것이 중요합니다. 시작하려면 인공 지능 또는 AI 소프트웨어를 시작하십시오. 실험 유형에서 컨벌루션 신경망 또는 CNN 모델을 빌드하기 위한 학습 실험을 시작하려면 학습 옆에 있는 라디오 버튼을 클릭하고 다음을 클릭합니다.Class Names(클래스 이름)에서 Add(추가)를 클릭합니다. 팝업 창에서 Mononucleated를 입력하고 확인을 클릭하여 클래스 이름 목록에 단핵화된 클래스를 추가합니다. 이 프로세스를 반복하여 MN으로 단핵화, MN으로 축소, MN으로 축소, 다핵화 및 불규칙한 형태와 같은 다른 클래스 이름을 추가합니다.파일 선택에서 파일 추가를 클릭하고 AI 소프트웨어에 추가할 원하는 파일을 찾아 실측 데이터를 구축합니다. 그런 다음 Select Base Population 화면에서 인구 계층에서 Non-apoptotic population을 찾습니다. 그런 다음 Non-apoptotic 모집단을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Select All Matching Populations를 선택한 후 Next를 클릭합니다.소핵이 있는 단핵구 세포의 태그가 지정된 진리 집단을 할당하려면 왼쪽의 모델 클래스에서 MN으로 단핵된 클래스를 클릭한 다음 오른쪽에서 태그가 지정된 적절한 진리 집단을 클릭합니다. 적절한 진리 모집단이 모두 할당되면 다음을 클릭합니다. 채널 선택 화면에서 실험에 적합한 채널이 선택되었는지 확인합니다.여기에서 Bright Field 또는 BF를 채널 1로 선택하고 DNA 무리를 채널 7로 선택한 후 Next(다음)를 클릭합니다. 마지막으로 확인 화면에서 실험 만들기를 클릭합니다. Tagging (태깅)을 클릭하여 태깅 도구 인터페이스를 시작합니다.그런 다음 확대/축소 도구를 클릭하여 더 쉽게 볼 수 있도록 이미지를 자릅니다. 그리고 슬라이더 막대를 클릭하여 이미지 크기를 조정하고 갤러리에 표시할 이미지 수를 결정합니다. 디스플레이 설정 옵션을 클릭하고 모든 주요 이벤트를 식별하기 위한 최상의 대비 이미지를 제공하는 최소-최대를 선택합니다.그런 다음 갤러리 디스플레이 설정을 클릭하여 DNA 이미지의 색상을 노란색 또는 흰색으로 변경하면 작은 물체의 시각화가 향상됩니다. Cluster(클러스터)를 클릭하여 유사한 형태의 이미지를 함께 그룹화하는 알고리즘을 실행합니다. 클러스터링이 완료되면 개별 클러스터를 클릭하고 적절한 모델 클래스에 이미지 할당을 시작합니다.각 모델 클래스에 최소 25개의 개체가 할당되면 예측 알고리즘을 사용할 수 있게 됩니다. 예측을 클릭합니다. 예측 알고리즘 실행이 완료되면 예측된 클래스의 개체를 적절한 모델 클래스에 추가합니다.각 모델 클래스에 최소 100개의 개체가 할당되면 화면 맨 위에 있는 학습 탭을 클릭한 다음 학습 단추를 클릭합니다. 모델 학습이 완료되면 결과 보기를 클릭하여 모델 정확도를 평가합니다. 모델 학습이 완료되면 메뉴 단추를 클릭하여 새 실험을 정의합니다.실험 유형에서 분류 옆에 있는 라디오 버튼을 클릭하여 분류 실험을 시작하고 다음을 클릭합니다. 분류에 사용할 모델을 클릭한 후 Next(다음)를 클릭합니다. 파일 선택 화면에서 파일 추가를 클릭합니다.CNN 모델로 분류할 파일을 찾은 후 다음을 클릭합니다. 그런 다음 Select Base Population 화면에서 로드된 파일 중 하나에서 Non-apoptotic population 옆에 있는 확인란을 클릭합니다. Non-apoptotic 모집단을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, Select All Matching Populations를 클릭하여 로드된 모든 파일에서 이 채우기를 선택한 후 Next를 클릭합니다.채널 선택 화면에서 명시 필드에 대해 채널 1이 선택되고 DNA 염색에 대해 채널 7이 선택되었는지 확인하고 다음을 클릭합니다. 마지막으로 확인 화면에서 Create Experiment(실험 만들기)를 클릭합니다. AI 소프트웨어는 선택한 데이터 파일에서 선택한 모델과 모든 이미지를 로드합니다.로딩 후 Finish(마침)를 클릭합니다. 그런 다음 Classify를 클릭하여 분류 화면을 시작합니다. 그리고 확인란을 사용하여 Random Forest 또는 RF 및 CNN을 사용하도록 선택합니다.그런 다음 분류 버튼을 클릭합니다. 이렇게 하면 RF 및 CNN 모델을 사용하여 추가 데이터를 분류하고 지정된 모델 클래스에 속하는 모든 객체를 식별하는 프로세스가 시작됩니다. 분류가 완료되면 결과 보기를 클릭합니다.DAF 업데이트 버튼을 클릭하여 분류 결과가 있는 DAF 업데이트 창을 표시한 다음 확인을 클릭하여 DAF 파일을 업데이트합니다. 보고서를 생성하려면 결과 화면에서 보고서 생성을 클릭합니다. 각 입력 DAF에 대한 개별 보고서가 필요한 경우 각 입력 DAF에 대한 보고서 만들기 옆의 확인란을 선택합니다.그렇지 않으면 확인을 클릭하여 보고서를 얻으십시오. AI 지원 클러스터 알고리즘은 분류되지 않은 개체와 실측 모델 클래스에 할당된 개체의 형태에 따라 세그먼트 내의 유사한 개체를 함께 그룹화합니다. 단핵구를 포함하는 군집은 물체 지도의 한쪽에 속하고, 다핵세포는 반대쪽에 있습니다.Binucleated 세포 클러스터는 단일 및 다핵 세포 클러스터 사이에 속합니다. 마지막으로, 불규칙한 형태를 가진 클러스터는 객체 맵의 다른 영역에 속합니다. 예측 알고리즘은 이미지에서 미묘한 형태를 식별하는 데 클러스터 알고리즘보다 더 강력합니다.예를 들어, MN이 있는 단핵구 세포와 MN이 없는 단핵세포가 있습니다. 모델의 성능은 클래스 분포 히스토그램, 정확도 통계 및 대화형 혼동 행렬을 포함한 도구를 사용하여 평가할 수 있습니다. 클래스 분포 히스토그램에서는 실제 모집단과 예측 모집단 사이의 백분율 값이 가까울수록 모형이 더 정확합니다. 정확도 통계에서 이러한 메트릭이 100%에 가까울수록 모델이 모델 클래스에서 이벤트를 식별하는 데 더 정확합니다.마지막으로, 대화형 혼동 행렬은 모델이 이벤트를 잘못 분류하는 위치를 나타냅니다. 유전독성은 Cytochalasin B 및 Non-Cytochalasin B 방법을 모두 사용하여 Mannitol, Etoposide 및 Mitomycin C에 대해 3시간 노출 및 24시간 회복 후 점선 막대로 표시된 현미경 검사에 의한 소핵의 백분율로 측정되었으며, 투명한 막대로 표시되고 AI는 점선 막대로 표시되었습니다. 학습 실험을 만들 때 로드된 데이터에 양성 및 음성 대조군 샘플의 이미지가 포함되어 있는지 확인합니다.소핵은 드물며 정확한 AI 모델을 구축하려면 충분한 이미지가 필요합니다. 이 절차를 통해 AI 모델을 생성하여 방사선 생물선량 측정과 같은 모든 연구 분야에서 이미징 흐름 소핵 데이터를 분석할 수 있습니다. 소핵을 식별하는 빠르고 강력한 AI 기반 방법은 암 발병 위험을 예측할 수 있는 소핵을 정량화하는 것과 같은 다른 응용 분야로 확장될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

연구

생체공학

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

휴대 전화에 폭 넓은 분야 형광 현미경과 형광 이미징 유동 세포 계측법

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법과 세포의 현지화 및 탄소 나노 튜브의 상대 정량

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

FRET 유동 세포 계측법과 Proteopathic의 시드 활동의 민감한 검출

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

광음향 유동 세포측정을 이용한 난소암 검출

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

초고속 도플러를 가진 혈류 영상

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...