Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

1. Datainnsamling ved hjelp av avbildningsflowcytometri
MERK: Se Rodrigues et al.16 med følgende modifikasjoner, og merk at oppkjøpsregionene som bruker IFC kanskje må endres for optimal bildeopptak:
<ol><li>For ikke-Cyt-B-metoden, utfør en celletelling ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig celleteller i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse) på hver kultur umiddelbart før dyrkning og umiddelbart ette...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

Arbeidet som presenteres her beskriver bruken av dype læringsalgoritmer for å automatisere scoringen av MN-analysen. Flere nyere publikasjoner har vist at intuitive, interaktive verktøy gjør det mulig å lage dype læringsmodeller for å analysere bildedata uten behov for dyptgående beregningskunnskap18,19. Protokollen beskrevet i dette arbeidet ved hjelp av en brukergrensesnittdrevet programvarepakke er designet for å fungere godt med svært store datafile...

Mikronukleusanalysen (MN) er grunnleggende i genetisk toksikologi for å evaluere DNA-skade i utviklingen av kosmetikk, legemidler og kjemikalier til menneskelig bruk 1,2,3,4. Mikrokjerner er dannet av hele kromosomer eller kromosomfragmenter som ikke innlemmes i kjernen etter deling og kondenserer til små, sirkulære legemer atskilt fra kjernen. Dermed kan MN brukes som et endepunkt for å kvantifisere DNA-skade i gentoksisitetstesting1.
Den foretrukne metoden for å kvantifisere MN er innenfor en gang delte binucleated celler (BNCs) ved å blokkere deling ved hjelp av Cytochalasin-B (Cyt-B). I denne versjonen av analysen vurderes cytotoksisitet også ved å skåre mononukleerte (MONO) og polynukleerte (POLY) celler. Analysen kan også utføres ved å score MN i ikke-blokkerte MONO-celler, som er raskere og lettere å score, med cytotoksisitet som vurderes ved bruk av celletall før og etter eksponering for å vurdere spredning 5,6.
Fysisk skåring av analysen har historisk blitt utført ved manuell mikroskopi, da dette muliggjør visuell bekreftelse av alle viktige hendelser. Manuell mikroskopi er imidlertid utfordrende og subjektivt1. Dermed har automatiserte teknikker blitt utviklet, inkludert mikroskoplysbildeskanning og flowcytometri, hver med sine egne fordeler og begrensninger. Mens lysbildeskanningsmetoder gjør det mulig å visualisere viktige hendelser, må lysbilder opprettes med optimal celletetthet, noe som kan være vanskelig å oppnå. I tillegg mangler denne teknikken ofte cytoplasmatisk visualisering, noe som kan kompromittere poengsummen til MONO- og POLY-celler 7,8. Mens flowcytometri gir høy gjennomstrømningsdatafangst, må cellene lyseres, og dermed ikke tillate bruk av Cyt-B-formen av analysen. I tillegg, som en ikke-avbildningsteknikk, gir konvensjonell flowcytometri ikke visuell validering av viktige hendelser 9,10.
Derfor har bildeblødningscytometri (IFC) blitt undersøkt for å utføre MN-analysen. ImageStreamX Mk II kombinerer hastigheten og den statistiske robustheten til konvensjonell flowcytometri med de høyoppløselige bildeegenskapene til mikroskopi i ett enkelt system11. Det har vist seg at ved å bruke IFC kan høyoppløselige bilder av alle viktige hendelser tas og automatisk scores ved hjelp av funksjonsbaserte12,13 eller kunstig intelligens (AI) teknikker14,15. Ved å bruke IFC til å utføre MN-analysen, er automatisk scoring av mange flere celler sammenlignet med mikroskopi på kortere tid oppnåelig.
Dette arbeidet avviker fra en tidligere beskrevet arbeidsflyt for bildeanalyse16 og diskuterer alle trinnene som kreves for å utvikle og trene en Random Forest (RF) og/eller konvolusjonell nevral nettverksmodell (CNN) ved hjelp av Amnis AI-programvaren (heretter referert til som "AI-programvare"). Alle nødvendige trinn er beskrevet, inkludert utfylling av sannhetsdata ved hjelp av AI-assisterte merkingsverktøy, tolkning av modellopplæringsresultater og anvendelse av modellen for å klassifisere tilleggsdata, som tillater beregning av gentoksisitet og cytotoksisitet15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

Mikronukleusanalysen (MN) brukes over hele verden av reguleringsorganer for å evaluere kjemikalier for genetisk toksisitet. Analysen kan utføres på to måter: ved å score MN i en gang delt, cytokinesisblokkerte binukleerte celler eller fullt delte mononukleerte celler. Historisk sett har lysmikroskopi vært gullstandardmetoden for å score analysen, men den er arbeidskrevende og subjektiv. Flowcytometri har blitt brukt de siste årene for å skåre analysen, men er begrenset av manglende evne til visuelt å bekrefte viktige aspekter ved cellulære bilder. Imaging flow cytometry (IFC) kombinerer bildeopptak med høy gjennomstrømning og automatisert bildeanalyse, og har blitt brukt til raskt å skaffe bilder av og score alle viktige hendelser i MN-analysen. Nylig har det blitt demonstrert at kunstig intelligens (AI) metoder basert på konvolusjonelle nevrale nettverk kan brukes til å score MN-analysedata innhentet av IFC. Denne rapporten beskriver alle trinnene for å bruke AI-programvare til å opprette en dyplæringsmodell for å score alle viktige hendelser og bruke denne modellen til å automatisk score tilleggsdata. Resultatene fra AI-dyplæringsmodellen kan sammenlignes godt med manuell mikroskopi, og muliggjør derfor helautomatisk skåring av MN-analysen ved å kombinere IFC og AI.

Figur 1 viser arbeidsflyten for bruk av AI-programvaren til å lage en modell for MN-analysen. Brukeren laster de ønskede .daf-filene inn i AI-programvaren, og tilordner deretter objekter til enhetssannhetsmodellklassene ved hjelp av AI-assistert klynge (figur 2) og forutsi (figur 3) merkingsalgoritmer. Når alle bakkesannhetsmodellklasser er fylt med tilstrekkelige objekter, kan modellen trenes ved hjelp av RF- eller CNN-algoritme...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

Mikronukleusanalysen (MN) er en veletablert test for å kvantifisere DNA-skade. Å score analysen ved hjelp av konvensjonelle teknikker som manuell mikroskopi eller funksjonsbasert bildeanalyse er imidlertid arbeidskrevende og utfordrende. Denne artikkelen beskriver metodikken for å utvikle en kunstig intelligensmodell for å skåre MN-analysen ved hjelp av avbildningsflowcytometridata.

Automatisering av mikronukleusanalysen ved hjelp av bildestrømningscytometri og kunstig intelligens

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

Utførelse av mikronukleusanalysen ved hjelp av bildestrømningscytometri overvinner mange begrensninger i tradisjonelle metoder, inkludert lav gjennomstrømning, poengvariabilitet og mangel på visuell bekreftelse av hendelser. Den største fordelen med denne teknikken er at alle viktige hendelser kan anskaffes ved hjelp av bildestrømningscytometri og analyseres ved hjelp av kunstig intelligens. Denne metoden har potensial til å bli brukt i storskala screening av kjemikalier og andre forbindelser for å teste for toksisitet ved høyere gjennomstrømning enn det som er tilgjengelig for øyeblikket.Når du bygger en ny AI-modell, er hovedutfordringen å skaffe tilstrekkelige bilder av celler med mikrokjerner, så det er viktig å bruke bildemerkingsalgoritmene. For å begynne, start programvaren for kunstig intelligens eller AI. Under Eksperimenttype klikker du på alternativknappen ved siden av Train for å starte et treningseksperiment for å bygge Convolutional Neural Network eller CNN-modellen, og klikker på Neste.På klassenavnene klikker du på Legg til. I popup-vinduet skriver du inn Mononucleated, og klikker på OK for å legge til den mononukleerte klassen i listen over klassenavn. Gjenta denne prosessen for å legge til de andre klassenavnene, for eksempel Mononucleated med MN, Binucleated, Binucleated med MN, Polynucleated og Irregular morphology.Under Velg filer klikker du på Legg til filer og blar etter de ønskede filene som skal legges til AI-programvaren, for å bygge sannhetsdataene for bakken. Neste på skjermbildet Velg basispopulasjon finner du den ikke-apoptotiske populasjonen fra populasjonshierarkiet. Høyreklikk deretter på den ikke-apoptotiske populasjonen, velg Velg alle samsvarende populasjoner, og klikk på Neste.For å tilordne en merket sannhetspopulasjon av mononukleerte celler med mikrokjerne, klikk på Mononucleated with MN-klassen under Modellklasser til venstre, og klikk deretter på den aktuelle merkede sannhetspopulasjonen til høyre. Når alle passende sannhetspopulasjoner er tildelt, klikker du på Neste. På Velg kanaler-skjermen kontrollerer du at de riktige kanalene for eksperimentet er valgt.Her velger du Bright Field eller BF som kanal én, flokker for DNA som kanal syv, og klikker deretter Neste. Til slutt, på bekreftelsesskjermen, klikker du på Opprett eksperiment. Klikk på Tagging for å starte grensesnittet for merkingsverktøyet.Klikk deretter på zoomverktøyene for å beskjære bildene for enklere visning. Og klikk på glidebryteren for å justere bildestørrelsen og bestemme antall bilder som skal vises i galleriet. Klikk på alternativet Skjerminnstilling og velg min-max, som gir det beste kontrastbildet for å identifisere alle viktige hendelser.Deretter klikker du på Setup Gallery Display for å endre fargen på DNA-bildet til gult eller hvitt, noe som vil forbedre visualiseringen av små gjenstander. Klikk på Cluster for å kjøre algoritmen for å gruppere bilder med lignende morfologi sammen. Når klyngen er fullført, klikker du på de enkelte klyngene og begynner å tilordne bilder til passende modellklasser.Når minst 25 objekter er tilordnet hver modellklasse, blir forutsigelsesalgoritmen tilgjengelig. Klikk på Forutsi. Når forutsigelsesalgoritmen er ferdig kjørt, legger du til objekter fra de forutsagte klassene i de aktuelle modellklassene.Når minst 100 objekter er tilordnet hver modellklasse, klikker du på kategorien Trening øverst på skjermen, og deretter klikker du på Tog-knappen. Når modellopplæringen er fullført, klikker du på Vis resultater for å vurdere modellens nøyaktighet. Når modellopplæringen er fullført, klikker du på menyknappen for å definere et nytt eksperiment.Under Eksperimenttype klikker du alternativknappen ved siden av Klassifiser for å starte et klassifiseringseksperiment, og deretter klikker du Neste. Klikk på modellen som skal brukes til klassifisering, og klikk deretter på Neste. På skjermbildet Velg filer klikker du på Legg til filer.Bla etter filene som skal klassifiseres av CNN-modellen, og klikk deretter på Neste. Deretter, på skjermbildet Velg basispopulasjon, klikker du på avkrysningsruten ved siden av den ikke-apoptotiske populasjonen i en av de lastede filene. Høyreklikk på den ikke-apoptotiske populasjonen, klikk på Velg alle samsvarende populasjoner for å velge denne populasjonen fra alle lastede filer, og klikk deretter Neste.I skjermbildet Select Channels (Velg kanaler) kontrollerer du at kanal én er valgt for Bright Field, og at kanal sju er valgt for DNA-flekken, og klikker på Neste. Til slutt, på bekreftelsesskjermen, klikker du på Opprett eksperiment. AI-programvaren laster den valgte modellen og alle bilder fra de valgte datafilene.Etter lasting, klikk på Fullfør. Klikk deretter på Klassifiser for å starte klassifiseringsskjermen. Og bruk avmerkingsboksene til å velge å bruke Random Forest eller RF og CNN.Klikk deretter på Klassifisere-knappen. Dette begynner prosessen med å bruke RF- og CNN-modellene til å klassifisere tilleggsdata og identifisere alle objekter som hører til i de angitte modellklassene. Når klassifiseringen er fullført, klikker du på Vis resultater.Klikk på Oppdater DAF-er for å hente oppdaterings-DAF-ene med klassifiseringsresultatvinduet, og klikk deretter på OK for å oppdatere DAF-filene. For å generere rapporten, klikk på Generer rapport på resultatskjermen. Hvis det kreves en individuell rapport for hver DAF for inndata, merker du av i avmerkingsboksen ved siden av Opprett rapport for hver inndata-DAF.Ellers klikker du bare på OK for å hente rapportene. Den AI-assisterte klyngealgoritmen grupperer lignende objekter i et segment sammen, i henhold til morfologien til både uklassifiserte objekter og objektene som er tildelt grunnsannhetsmodellklassene. Klynger som inneholder mononukleerte celler faller på den ene siden av objektkartet, mens de flerkjernede cellene er på motsatt side.Binucleated celleklynger faller mellom mono og multinucleated celleklynger. Til slutt faller klynger med uregelmessig morfologi i forskjellige områder av objektkartet. Prediksjonsalgoritmen er mer robust enn klyngealgoritmen når det gjelder å identifisere subtile morfologier i bilder.For eksempel mononukleerte celler med MN versus mononukleerte celler uten MN. Modellens ytelse kan vurderes ved hjelp av verktøy, inkludert klassefordelingshistogrammer, nøyaktighetsstatistikk og en interaktiv forvirringsmatrise. I klassefordelingshistogrammer, jo nærmere prosentverdiene mellom sannheten og predikerte populasjoner, desto mer nøyaktig er modellen. I nøyaktighetsstatistikken, jo nærmere disse beregningene er 100 %jo mer nøyaktig er modellen til å identifisere hendelser i modellklassene.Til slutt indikerer den interaktive forvirringsmatrisen hvor modellen bommer. Gentoksisitet ble målt ved prosentandel mikrokjerner ved mikroskopi, indikert med klare søyler, og AI indikert med stiplede søyler etter 3 timers eksponering og 24 timers restitusjon, for mannitol, etoposid og mitomycin C, ved bruk av både cytochalasin B og ikke-cytochalasin B-metodene. Når du oppretter et treningseksperiment, må du sørge for at de innlastede dataene inneholder bilder fra positive og negative kontrollprøver.Mikrokjerner er sjeldne, og tilstrekkelig bilder er nødvendig for å bygge en nøyaktig AI-modell. Denne prosedyren tillater opprettelse av AI-modeller for å analysere mikronukleusdata for bildestrøm i et hvilket som helst fagområde, for eksempel strålingsbiodosimetri. En rask og robust AI-basert metode for å identifisere mikrokjerner, kan strekke seg til andre applikasjoner, for eksempel kvantifisering av mikrokjerner som kan være prediktive for risikoen for kreftutvikling.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering av polymere Gene levering Nanopartikler av nanopartikler Tracking Analysis og High-throughput flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-field fluoriserende mikroskopi og fluoriserende Imaging flowcytometri på en mobiltelefon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Lokalisering og Relativ Kvantifisering av karbonnanorør i Celler med Multispectral Imaging flowcytometrisystemer

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Sensitive Påvisning av Proteopathic Seeding aktivitet med FRET flowcytometrisystemer

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolering av primære murin retinale Ganglion-celler (RGCer) ved Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

En automatisert metode for å utføre in vitro Mikronukleus analysen bruker multispectral Imaging Flow flowcytometri

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Kreft deteksjon av eggstokkene bruke Photoacoustic Flow flowcytometri

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Flowcytometri med høy dimensjonalitet for immunfunksjonsanalyse av dissekert implantatvev

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Blodstrømavbildning med ultrarask Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...