Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
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1. Aquisição de dados por citometria de fluxo por imagem
NOTA: Consulte Rodrigues et al.16 com as seguintes modificações, observando que as regiões de aquisição usando IFC podem precisar ser modificadas para a captura ideal da imagem:
<ol><li>Para o método não-Cyt-B, realizar uma contagem de células usando um contador de células disponível comercialmente seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais) em c...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

O trabalho aqui apresentado descreve o uso de algoritmos de aprendizagem profunda para automatizar a pontuação do ensaio MN. Diversas publicações recentes têm demonstrado que ferramentas intuitivas e interativas permitem a criação de modelos de deep learning para analisar dados de imagens sem a necessidade de conhecimento computacional aprofundado18,19. O protocolo descrito neste trabalho usando um pacote de software orientado por interface de usuário foi...

O ensaio de micronúcleos (NM) é fundamental na toxicologia genética para avaliar danos ao DNA no desenvolvimento de cosméticos, fármacos e produtos químicos para uso humano 1,2,3,4. Os micronúcleos são formados a partir de cromossomos inteiros ou fragmentos cromossômicos que não se incorporam ao núcleo após a divisão e se condensam em pequenos corpos circulares separados do núcleo. Assim, o NM pode ser usado como um desfecho para quantificar danos ao DNA em testes de genotoxicidade1.
O método preferido para quantificar MN é dentro de células binucleadas (BNCs) divididas uma vez por bloqueio de divisão usando Citocalasina-B (Cyt-B). Nesta versão do ensaio, a citotoxicidade também é avaliada por meio da pontuação de células mononucleadas (MONO) e polinucleadas (POLY). O ensaio também pode ser realizado por meio da pontuação de MN em células MONO desbloqueadas, o que é mais rápido e fácil de pontuar, com a citotoxicidade sendo avaliada usando contagens de células pré e pós-exposição para avaliar a proliferação 5,6.
A pontuação física do ensaio tem sido historicamente realizada por microscopia manual, uma vez que permite a confirmação visual de todos os eventos-chave. Entretanto, a microscopia manual é desafiadora esubjetiva1. Assim, técnicas automatizadas têm sido desenvolvidas, incluindo varredura de lâminas ao microscópio e citometria de fluxo, cada uma com suas vantagens e limitações. Embora os métodos de varredura de slides permitam que eventos-chave sejam visualizados, os slides devem ser criados na densidade de célula ideal, o que pode ser difícil de alcançar. Além disso, essa técnica muitas vezes não tem visualização citoplasmática, o que pode comprometer a pontuação das células MONO e POLY 7,8. Embora a citometria de fluxo ofereça captura de dados de alto rendimento, as células devem ser lisadas, não permitindo o uso da forma Cyt-B do ensaio. Além disso, por ser uma técnica não imaginológica, a citometria de fluxo convencional não fornece validação visual de eventos-chave 9,10.
Portanto, a citometria de fluxo por imagem (CIF) tem sido investigada para realizar o ensaio de NM. O ImageStreamX Mk II combina a velocidade e a robustez estatística da citometria de fluxo convencional com os recursos de imagem de alta resolução da microscopia em um único sistema11. Foi demonstrado que, usando IFC, imagens de alta resolução de todos os eventos-chave podem ser capturadas e pontuadas automaticamente usando técnicas baseadas em recursos 12,13 ou inteligência artificial (IA) 14,15. Usando IFC para realizar o ensaio de MN, a pontuação automática de muito mais células em comparação com a microscopia em um período mais curto de tempo é alcançável.
Este trabalho se desvia de um fluxo de trabalho de análise de imagens descrito anteriormente16 e discute todas as etapas necessárias para desenvolver e treinar um modelo de Floresta Aleatória (RF) e/ou rede neural convolucional (CNN) usando o software Amnis AI (doravante referido como "software de IA"). Todas as etapas necessárias são descritas, incluindo o preenchimento de dados de verdade terrestres usando ferramentas de marcação assistidas por IA, interpretação dos resultados do treinamento do modelo e aplicação do modelo para classificar dados adicionais, permitindo o cálculo de genotoxicidade e citotoxicidade15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

O ensaio de micronúcleo (MN) é usado mundialmente por órgãos reguladores para avaliar produtos químicos quanto à toxicidade genética. O ensaio pode ser realizado de duas maneiras: pontuando MN em células binucleadas bloqueadas por citocinese ou células mononucleadas totalmente divididas. Historicamente, a microscopia óptica tem sido o método padrão-ouro para pontuar o ensaio, mas é trabalhosa e subjetiva. A citometria de fluxo tem sido usada nos últimos anos para pontuar o ensaio, mas é limitada pela incapacidade de confirmar visualmente aspectos-chave da imagética celular. A citometria de fluxo por imagem (IFC) combina captura de imagem de alto rendimento e análise automatizada de imagens, e tem sido aplicada com sucesso para adquirir rapidamente imagens e pontuar todos os eventos-chave no ensaio de MN. Recentemente, foi demonstrado que métodos de inteligência artificial (IA) baseados em redes neurais convolucionais podem ser usados para pontuar dados de ensaios de MN adquiridos por IFC. Este documento descreve todas as etapas para usar o software de IA para criar um modelo de aprendizado profundo para pontuar todos os eventos-chave e aplicar esse modelo para pontuar automaticamente dados adicionais. Os resultados do modelo de aprendizagem profunda de IA se comparam bem à microscopia manual, permitindo assim a pontuação totalmente automatizada do ensaio MN combinando IFC e IA.

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para usar o software de IA para criar um modelo para o ensaio MN. O usuário carrega os arquivos .daf desejados no software de IA e, em seguida, atribui objetos às classes de modelo verdade terrestre usando os algoritmos de marcação de cluster assistido por IA (Figura 2) e de previsão (Figura 3). Uma vez que todas as classes de modelo verdade terrestre tenham sido preenchidas com objetos suf...

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Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

O ensaio de micronúcleo (MN) é um teste bem estabelecido para quantificar danos ao DNA. No entanto, pontuar o ensaio usando técnicas convencionais, como microscopia manual ou análise de imagem baseada em recursos, é trabalhoso e desafiador. Este artigo descreve a metodologia para desenvolver um modelo de inteligência artificial para pontuar o ensaio de MN usando dados de citometria de fluxo de imagem.

Automação do Ensaio de Micronúcleos Utilizando Imagem por Citometria de Fluxo e Inteligência Artificial

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

A realização do ensaio de micronúcleos usando citometria de fluxo de imagem supera muitas limitações dos métodos tradicionais, incluindo baixo rendimento, variabilidade do escore e falta de confirmação visual dos eventos. A principal vantagem dessa técnica é que todos os eventos-chave podem ser adquiridos por citometria de fluxo por imagem e analisados por inteligência artificial. Este método tem um potencial para ser usado na triagem em larga escala de produtos químicos e outros compostos para testar a toxicidade a um rendimento mais alto do que o atualmente disponível.Ao construir um novo modelo de IA, o principal desafio é obter imagens suficientes de células com micronúcleos, por isso é importante usar os algoritmos de marcação de imagem. Para começar, lance o software de Inteligência Artificial ou IA. Em Tipo de Experimento, clique no botão de opção ao lado de Treinar para iniciar um experimento de treinamento para construir o modelo de Rede Neural Convolucional ou CNN e clique em Avançar.Em Nomes de classe, clique em Adicionar. Na janela pop-up, digite Mononucleado e clique em OK para adicionar a classe mononucleada à lista de nomes de classe. Repita esse processo para adicionar os outros nomes de classe, como Mononucleado com MN, Binucleado, Binucleado com MN, Polinucleado e Morfologia irregular.Em Selecionar arquivos, clique em Adicionar arquivos e procure os arquivos desejados a serem adicionados ao software de IA, para criar os dados de verdade de base. Em seguida, na tela Selecionar População Base, localize a população não apoptótica da hierarquia populacional. Em seguida, clique com o botão direito do mouse na população não apoptótica, escolha Selecionar todas as populações correspondentes e clique em Avançar.Para atribuir uma população verdade marcada de células mononucleadas com micronúcleo, clique na classe Mononucleada com MN em Classes Modelo à esquerda e, em seguida, clique na população verdade marcada apropriada à direita. Depois que todas as populações de verdade apropriadas forem atribuídas, clique em Avançar. Na tela Selecionar canais, verifique se os canais apropriados para o experimento foram escolhidos.Aqui, escolha Campo brilhante ou BF como canal um, rebanhos para DNA como canal sete e clique em Avançar. Por fim, na tela de confirmação, clique em Criar experimento. Clique em Marcação para iniciar a interface da ferramenta de marcação.Em seguida, clique nas ferramentas de zoom para cortar as imagens para facilitar a visualização. E clique na barra deslizante para ajustar o tamanho da imagem e decidir o número de imagens a serem mostradas na galeria. Clique na opção Display Setting e escolha min-max, que fornece a melhor imagem de contraste para identificar todos os principais eventos.Em seguida, clique em Setup Gallery Display para alterar a cor da imagem de DNA para amarelo ou branco, o que melhorará a visualização de pequenos objetos. Clique em Cluster para executar o algoritmo para agrupar imagens com morfologia semelhante. Quando o clustering estiver concluído, clique nos clusters individuais e comece a atribuir imagens às classes de modelo apropriadas.Depois que um mínimo de 25 objetos são atribuídos a cada classe de modelo, o algoritmo de previsão fica disponível. Clique em Prever. Depois que o algoritmo de previsão tiver concluído a execução, adicione objetos das classes previstas às classes de modelo apropriadas.Uma vez que um mínimo de 100 objetos são atribuídos a cada classe de modelo, clique na guia Treinamento na parte superior da tela e, em seguida, clique no botão Treinar. Quando o treinamento do modelo estiver concluído, clique em Exibir resultados para avaliar a precisão do modelo. Quando o treinamento do modelo estiver concluído, clique no botão de menu para definir um novo experimento.Em Tipo de Experimento, clique no botão de opção ao lado de Classificar para iniciar um experimento de classificação e clique em Avançar. Clique no modelo a ser usado para a classificação e, em seguida, clique em Avançar. Na tela Selecionar arquivos, clique em Adicionar arquivos.Procure os arquivos a serem classificados pelo modelo CNN e clique em Avançar. Em seguida, na tela Selecionar População Base, clique na caixa de seleção ao lado da população Não apoptótica em um dos arquivos carregados. Clique com o botão direito do mouse na população não apoptótica, clique em Selecionar todas as populações correspondentes para selecionar essa população de todos os arquivos carregados e, em seguida, clique em Avançar.Na tela Selecionar Canais, verifique se o canal um está selecionado para o Campo Brilhante e se o canal sete está selecionado para a coloração de DNA e clique em Avançar. Por fim, na tela de confirmação, clique em Criar Experimento. O software de IA carrega o modelo selecionado e todas as imagens dos arquivos de dados escolhidos.Após o carregamento, clique em Concluir. Em seguida, clique em Classificar para iniciar a tela de classificação. E use as caixas de seleção para escolher usar Random Forest ou RF e CNN.Em seguida, clique no botão Classificar. Isso inicia o processo de uso dos modelos RF e CNN para classificar dados adicionais e identificar todos os objetos que pertencem às classes de modelo especificadas. Quando a classificação estiver concluída, clique em Exibir Resultados.Clique no botão Atualizar DAFs para abrir a janela Atualizar DAFs com resultados de classificação e clique em OK para atualizar os arquivos DAF. Para gerar o relatório, na tela de resultados, clique em Gerar Relatório. Se um relatório individual para cada DAF de entrada for necessário, marque a caixa de seleção ao lado de Criar relatório para cada DAF de entrada.Caso contrário, basta clicar em OK para obter os relatórios. O algoritmo de cluster assistido por IA agrupa objetos semelhantes dentro de um segmento, de acordo com a morfologia de objetos não classificados e dos objetos que foram atribuídos às classes de modelo verdade terrestres. Aglomerados contendo células mononucleadas caem em um lado do mapa de objetos, enquanto as células multinucleadas estão no lado oposto.Aglomerados de células binucleadas situam-se entre aglomerados celulares mono e multinucleados. Finalmente, aglomerados com morfologia irregular, caem em diferentes áreas do mapa de objetos. O algoritmo de predição é mais robusto que o algoritmo de cluster na identificação de morfologias sutis em imagens.Por exemplo, Células Mononucleadas com MN versus Células Mononucleadas sem MN. O desempenho do modelo pode ser avaliado usando ferramentas, incluindo histogramas de distribuição de classes, estatísticas de acurácia e uma matriz de confusão interativa. Nos histogramas de distribuição de classes, quanto mais próximos os valores percentuais entre as populações verdade e prevista, mais preciso é o modelo. Nas estatísticas de precisão, quanto mais próximas essas métricas estiverem de 100%, mais preciso o modelo é na identificação de eventos nas classes de modelo.Finalmente, a matriz de confusão interativa indica onde o modelo erra os eventos. A genotoxicidade foi medida pela porcentagem de micronúcleos por microscopia, indicada por barras transparentes, e IA indicada por barras pontilhadas após 3 horas de exposição e 24 horas de recuperação, para Manitol, Etoposídeo e Mitomicina C, utilizando-se os métodos Citocalasina B e Não-Citocalasina B. Ao criar um experimento de treinamento, verifique se os dados carregados contêm imagens de amostras de controle positivas e negativas.Micronúcleos são raros, e imagens suficientes são necessárias para construir um modelo de IA preciso. Esse procedimento permite a criação de modelos de IA para analisar dados de micronúcleos de fluxo de imagem em qualquer campo de estudo, como a biodosimetria de radiação. Um método rápido e robusto baseado em IA para identificar micronúcleos pode se estender a outras aplicações, como a quantificação de micronúcleos que podem ser preditivos para o risco de desenvolvimento de câncer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Bioengenharia

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Largo-campo microscopia de fluorescência e citometria de fluxo fluorescente de imagens em um telefone celular

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Um método automatizado para realizar o ensaio de micronúcleos in vitro usando citometria de fluxo de imagem multiespectral

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Detecção de câncer de ovário usando citometria de fluxo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Imagem de fluxo sanguíneo com Doppler Ultrarrápido

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...