Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
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1. Adquisición de datos mediante citometría de flujo de imágenes
NOTA: Consulte Rodrigues et al.16 con las siguientes modificaciones, señalando que las regiones de adquisición que utilizan IFC pueden necesitar ser modificadas para una captura óptima de la imagen:
<ol><li>Para el método no Cyt-B, realice un recuento de células utilizando un contador de células disponible comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la <s...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

El trabajo presentado aquí describe el uso de algoritmos de aprendizaje profundo para automatizar la puntuación del ensayo MN. Varias publicaciones recientes han demostrado que las herramientas intuitivas e interactivas permiten la creación de modelos de aprendizaje profundo para analizar datos de imágenes sin necesidad de un conocimiento computacional profundo18,19. El protocolo descrito en este trabajo utilizando un paquete de software basado en interfaz de...

El ensayo de micronúcleos (MN) es fundamental en toxicología genética para evaluar el daño del ADN en el desarrollo de cosméticos, productos farmacéuticos y productos químicos para uso humano 1,2,3,4. Los micronúcleos se forman a partir de cromosomas enteros o fragmentos de cromosomas que no se incorporan al núcleo después de la división y se condensan en cuerpos pequeños y circulares separados del núcleo. Por lo tanto, MN puede ser utilizado como un punto final para cuantificar el daño del ADN en las pruebas de genotoxicidad1.
El método preferido para cuantificar MN es dentro de células binucleadas una vez divididas (BNC) mediante el bloqueo de la división utilizando citochalasina-B (Cyt-B). En esta versión del ensayo, la citotoxicidad también se evalúa mediante la puntuación de células mononucleadas (MONO) y polinucleadas (POLY). El ensayo también se puede realizar marcando MN en células MONO desbloqueadas, que es más rápido y fácil de puntuar, y la citotoxicidad se evalúa utilizando recuentos celulares previos y posteriores a la exposición para evaluar la proliferación 5,6.
La puntuación física del ensayo se ha realizado históricamente a través de microscopía manual, ya que esto permite la confirmación visual de todos los eventos clave. Sin embargo, la microscopía manual es desafiante y subjetiva1. Por lo tanto, se han desarrollado técnicas automatizadas, incluido el escaneo de portaobjetos de microscopio y la citometría de flujo, cada uno con sus propias ventajas y limitaciones. Mientras que los métodos de escaneo de diapositivas permiten visualizar eventos clave, las diapositivas deben crearse con una densidad celular óptima, lo que puede ser difícil de lograr. Además, esta técnica a menudo carece de visualización citoplasmática, lo que puede comprometer la puntuación de las células MONO y POLY 7,8. Si bien la citometría de flujo ofrece una captura de datos de alto rendimiento, las células deben ser lisadas, lo que no permite el uso de la forma Cyt-B del ensayo. Además, como técnica no imagenológica, la citometría de flujo convencional no proporciona validación visual de eventos clave 9,10.
Por lo tanto, se ha investigado la citometría de flujo por imágenes (IFC) para realizar el ensayo MN. La ImageStreamX Mk II combina la velocidad y la robustez estadística de la citometría de flujo convencional con las capacidades de imagen de alta resolución de la microscopía en un solo sistema11. Se ha demostrado que mediante el uso de IFC, las imágenes de alta resolución de todos los eventos clave se pueden capturar y calificar automáticamente utilizando técnicas basadas en características 12,13 o inteligencia artificial (IA) 14,15. Mediante el uso de IFC para realizar el ensayo MN, se puede lograr la puntuación automática de muchas más células en comparación con la microscopía en un período de tiempo más corto.
Este trabajo se desvía de un flujo de trabajo de análisis de imágenes descrito anteriormente16 y discute todos los pasos necesarios para desarrollar y entrenar un modelo de bosque aleatorio (RF) y / o red neuronal convolucional (CNN) utilizando el software Amnis AI (en adelante, "software de IA"). Se describen todos los pasos necesarios, incluido el llenado de datos reales sobre el terreno utilizando herramientas de etiquetado asistidas por IA, la interpretación de los resultados del entrenamiento del modelo y la aplicación del modelo para clasificar datos adicionales, lo que permite el cálculo de la genotoxicidad y la citotoxicidad15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

El ensayo de micronúcleos (MN) es utilizado en todo el mundo por los organismos reguladores para evaluar los productos químicos en busca de toxicidad genética. El ensayo se puede realizar de dos maneras: marcando MN en células binucleadas bloqueadas por citocinesis una vez divididas o células mononucleadas completamente divididas. Históricamente, la microscopía óptica ha sido el método estándar de oro para calificar el ensayo, pero es laborioso y subjetivo. La citometría de flujo se ha utilizado en los últimos años para calificar el ensayo, pero está limitada por la incapacidad de confirmar visualmente aspectos clave de las imágenes celulares. La citometría de flujo de imágenes (IFC) combina la captura de imágenes de alto rendimiento y el análisis automatizado de imágenes, y se ha aplicado con éxito para adquirir rápidamente imágenes y calificar todos los eventos clave en el ensayo MN. Recientemente, se ha demostrado que los métodos de inteligencia artificial (IA) basados en redes neuronales convolucionales se pueden utilizar para calificar los datos de ensayos MN adquiridos por IFC. En este documento se describen todos los pasos para usar el software de IA para crear un modelo de aprendizaje profundo para calificar todos los eventos clave y aplicar este modelo para calificar automáticamente datos adicionales. Los resultados del modelo de aprendizaje profundo de IA se comparan bien con la microscopía manual, lo que permite una puntuación totalmente automatizada del ensayo MN mediante la combinación de IFC e IA.

La figura 1 muestra el flujo de trabajo para usar el software de IA para crear un modelo para el ensayo MN. El usuario carga los archivos .daf deseados en el software de IA, luego asigna objetos a las clases de modelo de verdad del terreno utilizando los algoritmos de etiquetado de clúster asistido por IA (Figura 2) y predicción (Figura 3). Una vez que todas las clases de modelos de verdad básica se han poblado con suficientes ob...

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Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

El ensayo de micronúcleos (MN) es una prueba bien establecida para cuantificar el daño del ADN. Sin embargo, calificar el ensayo utilizando técnicas convencionales como la microscopía manual o el análisis de imágenes basado en características es laborioso y desafiante. Este artículo describe la metodología para desarrollar un modelo de inteligencia artificial para calificar el ensayo MN utilizando datos de citometría de flujo de imágenes.

Automatización del ensayo de micronúcleos mediante citometría de flujo de imágenes e inteligencia artificial

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

La realización del ensayo de micronúcleos mediante citometría de flujo por imágenes supera muchas limitaciones de los métodos tradicionales, incluido el bajo rendimiento, la variabilidad de la puntuación y la falta de confirmación visual de los eventos. La principal ventaja de esta técnica es que todos los eventos clave pueden adquirirse mediante citometría de flujo de imágenes y analizarse mediante inteligencia artificial. Este método tiene el potencial de ser utilizado en la detección a gran escala de productos químicos y otros compuestos para probar la toxicidad a un rendimiento más alto que el disponible actualmente.Al construir un nuevo modelo de IA, el principal desafío es obtener suficientes imágenes de células con micronúcleos, por lo que es importante utilizar los algoritmos de etiquetado de imágenes. Para comenzar, inicie el software de Inteligencia Artificial o IA. En Tipo de experimento, haga clic en el botón de opción junto a Entrenar para iniciar un experimento de entrenamiento para construir la red neuronal convolucional o el modelo CNN, y haga clic en Siguiente.En los nombres de clase, haga clic en Agregar. En la ventana emergente, escriba Mononucleado y haga clic en Aceptar para agregar la clase mononucleada a la lista de nombres de clase. Repita este proceso para agregar los otros nombres de clase, como Mononucleado con MN, Binucleado, Binucleado con MN, Polinucleado y Morfología irregular.En Seleccionar archivos, haga clic en Agregar archivos y busque los archivos deseados que se agregarán al software de IA para construir los datos de verdad sobre el terreno. A continuación, en la pantalla Seleccionar población base, busque la población no apoptótica de la jerarquía de población. Luego haga clic derecho en la población no apoptótica, elija Seleccionar todas las poblaciones coincidentes y haga clic en Siguiente.Para asignar una población de verdad etiquetada de células mononucleadas con micronúcleo, haga clic en la clase Mononucleada con MN en Clases modelo a la izquierda y, a continuación, haga clic en la población de verdad etiquetada apropiada a la derecha. Una vez que se hayan asignado todas las poblaciones de verdad apropiadas, haga clic en Siguiente. En la pantalla Seleccionar canales, asegúrese de que se han elegido los canales adecuados para el experimento.Aquí, elija Campo brillante o BF como canal uno, manadas de ADN como canal siete y, a continuación, haga clic en Siguiente. Finalmente, en la pantalla Confirmación, haga clic en Crear experimento. Haga clic en Etiquetado para iniciar la interfaz de la herramienta de etiquetado.Luego haga clic en las herramientas de zoom para recortar las imágenes para facilitar la visualización. Y haga clic en la barra deslizante para ajustar el tamaño de la imagen y decidir el número de imágenes que se mostrarán en la galería. Haga clic en la opción Configuración de pantalla y elija min-max, que proporciona la mejor imagen de contraste para identificar todos los eventos clave.A continuación, haga clic en Configurar pantalla de la galería para cambiar el color de la imagen de ADN a amarillo o blanco, lo que mejorará la visualización de objetos pequeños. Haga clic en Clúster para ejecutar el algoritmo para agrupar imágenes con morfología similar. Una vez completada la agrupación en clústeres, haga clic en los clústeres individuales y comience a asignar imágenes a las clases de modelo adecuadas.Después de asignar un mínimo de 25 objetos a cada clase de modelo, el algoritmo de predicción pasa a estar disponible. Haga clic en Predict. Una vez que el algoritmo de predicción haya completado la ejecución, agregue objetos de las clases predichas a las clases de modelo adecuadas.Una vez que se asigne un mínimo de 100 objetos a cada clase de modelo, haga clic en la pestaña Entrenamiento en la parte superior de la pantalla y, a continuación, haga clic en el botón Entrenar. Una vez que se complete el entrenamiento del modelo, haga clic en Ver resultados para evaluar la precisión del modelo. Una vez completado el entrenamiento del modelo, haga clic en el botón de menú para definir un nuevo experimento.En Tipo de experimento, haga clic en el botón de opción situado junto a Clasificar para iniciar un experimento de clasificación y haga clic en Siguiente. Haga clic en el modelo que se utilizará para la clasificación, luego haga clic en Siguiente. En la pantalla Seleccionar archivos, haga clic en Agregar archivos.Busque los archivos que se clasificarán por el modelo CNN y luego haga clic en Siguiente. A continuación, en la pantalla Seleccionar población base, haga clic en la casilla de verificación junto a la población no apoptótica en uno de los archivos cargados. Haga clic con el botón derecho en la población no apoptótica, haga clic en Seleccionar todas las poblaciones coincidentes para seleccionar esta población de todos los archivos cargados y, a continuación, haga clic en Siguiente.En la pantalla Seleccionar canales, compruebe que el canal uno está seleccionado para el campo brillante y el canal siete está seleccionado para la tinción de ADN y haga clic en Siguiente. Finalmente, en la pantalla de confirmación, haga clic en Crear experimento. El software AI carga el modelo seleccionado y todas las imágenes de los archivos de datos elegidos.Después de cargar, haga clic en Finalizar. A continuación, haga clic en Clasificar para iniciar la pantalla de clasificación. Y use las casillas de verificación para elegir usar Random Forest o RF y CNN.Luego haga clic en el botón Clasificar. Esto inicia el proceso de uso de los modelos RF y CNN para clasificar datos adicionales e identificar todos los objetos que pertenecen a las clases de modelo especificadas. Una vez completada la clasificación, haga clic en Ver resultados.Haga clic en el botón Actualizar DAF para abrir la ventana de actualización de DAF con resultados de clasificación y, a continuación, haga clic en Aceptar para actualizar los archivos DAF. Para generar el informe, en la pantalla de resultados, haga clic en Generar informe. Si se requiere un informe individual para cada DAF de entrada, seleccione la casilla de verificación situada junto a Crear informe para cada DAF de entrada.De lo contrario, simplemente haga clic en Aceptar para obtener los informes. El algoritmo de clúster asistido por IA agrupa objetos similares dentro de un segmento, de acuerdo con la morfología de los objetos no clasificados y los objetos que se han asignado a las clases del modelo de verdad del suelo. Los grupos que contienen células mononucleadas caen en un lado del mapa de objetos, mientras que las células multinucleadas están en el lado opuesto.Los grupos de células binucleadas se encuentran entre los grupos de células mononucleadas y multinucleadas. Finalmente, los cúmulos con morfología irregular, caen en diferentes áreas del mapa de objetos. El algoritmo de predicción es más robusto que el algoritmo de clúster para identificar morfologías sutiles en las imágenes.Por ejemplo, células mononucleadas con MN versus células mononucleadas sin MN. El rendimiento del modelo se puede evaluar utilizando herramientas, incluidos histogramas de distribución de clases, estadísticas de precisión y una matriz de confusión interactiva. En los histogramas de distribución de clases, cuanto más cercanos sean los valores porcentuales entre las poblaciones de verdad y predichas, más preciso será el modelo. En las estadísticas de precisión, cuanto más cerca estén estas métricas del 100%, más preciso será el modelo para identificar eventos en las clases del modelo.Finalmente, la matriz de confusión interactiva indica dónde el modelo clasifica erróneamente los eventos. La genotoxicidad se midió por el porcentaje de micronúcleos por microscopía, indicado por barras transparentes, y la IA indicada por barras punteadas después de una exposición de 3 horas y 24 horas de recuperación, para manitol, etopósido y mitomicina C, utilizando los métodos de citocalasina B y no citocalasina B. Al crear un experimento de entrenamiento, asegúrese de que los datos cargados contengan imágenes de muestras de control positivo y negativo.Los micronúcleos son raros y se requieren imágenes suficientes para construir un modelo preciso de IA. Este procedimiento permite la creación de modelos de IA para analizar datos de micronúcleos de flujo de imágenes en cualquier campo de estudio, como la biodosimetría de radiación. Un método rápido y robusto basado en IA para identificar micronúcleos puede extenderse a otras aplicaciones, como la cuantificación de micronúcleos que pueden predecir el riesgo de desarrollo de cáncer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Investigación

Bioingeniería

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-field microscopía de fluorescencia y citometría de flujo fluorescente de imágenes en un teléfono móvil

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Aislamiento de células primarias de ganglio retiniano murino (RGC) por citometría de flujo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Un método automatizado para realizar el ensayo de micronúcleos In Vitro mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Detección de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Imágenes de flujo sanguíneo con Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...