Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

1. Datainsamling med hjälp av bildflödescytometri
Se Rodrigues et al.16 med följande ändringar, notera att förvärvsregionerna som använder IFC kan behöva modifieras för optimal bildtagning:
<ol><li>För icke-Cyt-B-metoden, utför ett celltal med hjälp av en kommersiellt tillgänglig cellräknare enligt tillverkarens anvisningar (se materialförteckning) för varje odling omedelbart före odling och omedelbart efter återhäm...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

Arbetet som presenteras här beskriver användningen av djupinlärningsalgoritmer för att automatisera poängsättningen av MN-analysen. Flera nya publikationer har visat att intuitiva, interaktiva verktyg gör det möjligt att skapa djupinlärningsmodeller för att analysera bilddata utan behov av djupgående beräkningskunskap18,19. Protokollet som beskrivs i detta arbete med hjälp av ett användargränssnittsdrivet mjukvarupaket har utformats för att funger...

Mikrokärnanalysen (MN) är grundläggande inom genetisk toxikologi för att utvärdera DNA-skador vid utveckling av kosmetika, läkemedel och kemikalier för humant bruk 1,2,3,4. Mikrokärnor bildas av hela kromosomer eller kromosomfragment som inte införlivas i kärnan efter delning och kondenseras till små, cirkulära kroppar separerade från kärnan. Således kan MN användas som slutpunkt för att kvantifiera DNA-skador vid genotoxicitetstestning1.
Den föredragna metoden för kvantifiering av MN är inom en gång uppdelade binucleated cells (BNC) genom att blockera delning med cytochalasin-B (Cyt-B). I denna version av analysen bedöms cytotoxicitet också genom att poängsätta mononukleerade (MONO) och polynukleerade (POLY) celler. Analysen kan också utföras genom att poängsätta MN i oblockerade MONO-celler, vilket är snabbare och lättare att poängsätta, med cytotoxicitet som bedöms med hjälp av celltal före och efter exponering för att bedöma proliferation 5,6.
Fysisk poängsättning av analysen har historiskt utförts genom manuell mikroskopi, eftersom detta möjliggör visuell bekräftelse av alla viktiga händelser. Manuell mikroskopi är dock utmanande och subjektiv1. Således har automatiserade tekniker utvecklats, inklusive mikroskopskanning och flödescytometri, var och en med sina egna fördelar och begränsningar. Medan diaskanningsmetoder gör det möjligt att visualisera viktiga händelser, måste bilder skapas med optimal celldensitet, vilket kan vara svårt att uppnå. Dessutom saknar denna teknik ofta cytoplasmatisk visualisering, vilket kan äventyra poängsättningen av MONO och POLY celler 7,8. Medan flödescytometri erbjuder datainsamling med hög genomströmning måste cellerna lyseras, vilket inte tillåter användning av Cyt-B-formen av analysen. Dessutom, som en icke-avbildningsteknik, ger konventionell flödescytometri inte visuell validering av nyckelhändelser 9,10.
Därför har avbildningsflödescytometri (IFC) undersökts för att utföra MN-analysen. ImageStreamX Mk II kombinerar hastigheten och den statistiska robustheten hos konventionell flödescytometri med de högupplösta avbildningsfunktionerna hos mikroskopi i ett enda system11. Det har visats att genom att använda IFC kan högupplösta bilder av alla viktiga händelser fångas och automatiskt poängsättas med hjälp av funktionsbaserade 12,13 eller artificiell intelligens (AI) tekniker 14,15. Genom att använda IFC för att utföra MN-analysen kan automatisk poängsättning av många fler celler jämfört med mikroskopi på kortare tid uppnås.
Detta arbete avviker från ett tidigare beskrivet arbetsflöde för bildanalys16 och diskuterar alla steg som krävs för att utveckla och träna en Random Forest (RF) och/eller CNN-modell (Convolutional Neural Network) med hjälp av Amnis AI-programvara (hädanefter kallad "AI-programvara"). Alla nödvändiga steg beskrivs, inklusive att fylla i marksanningsdata med hjälp av AI-assisterade taggningsverktyg, tolkning av modellträningsresultat och tillämpning av modellen för att klassificera ytterligare data, vilket möjliggör beräkning av genotoxicitet och cytotoxicitet15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

Mikrokärnanalysen (MN) används över hela världen av tillsynsorgan för att utvärdera kemikalier för genetisk toxicitet. Analysen kan utföras på två sätt: genom att poängsätta MN i en gång uppdelade, cytokineseblockerade binukleerade celler eller helt uppdelade mononukleerade celler. Historiskt sett har ljusmikroskopi varit guldstandardmetoden för att göra analysen, men det är mödosamt och subjektivt. Flödescytometri har använts under de senaste åren för att poängsätta analysen, men begränsas av oförmågan att visuellt bekräfta viktiga aspekter av cellulära bilder. Imaging flow cytometry (IFC) kombinerar bildtagning med hög genomströmning och automatiserad bildanalys och har framgångsrikt tillämpats för att snabbt få bilder av och poängsätta alla viktiga händelser i MN-analysen. Nyligen har det visats att metoder för artificiell intelligens (AI) baserade på konvolutionella neurala nätverk kan användas för att poängsätta MN-analysdata som förvärvats av IFC. I det här dokumentet beskrivs alla steg för att använda AI-programvara för att skapa en djupinlärningsmodell för att poängsätta alla viktiga händelser och tillämpa den här modellen för att automatiskt poängsätta ytterligare data. Resultat från AI-djupinlärningsmodellen jämförs väl med manuell mikroskopi, vilket möjliggör helt automatiserad poängsättning av MN-analysen genom att kombinera IFC och AI.

Bild 1 visar arbetsflödet för att använda AI-programvaran för att skapa en modell för MN-analysen. Användaren läser in önskade .daf-filer i AI-programvaran och tilldelar sedan objekt till marksanningsmodellklasserna med hjälp av AI-assisterade kluster- (figur 2) och förutsägningsalgoritmer (figur 3). När alla marksanningsmodellklasser har fyllts med tillräckligt många objekt kan modellen tränas med RF- eller CNN-algor...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

Mikrokärnanalysen (MN) är ett väletablerat test för kvantifiering av DNA-skador. Att göra analysen med konventionella tekniker som manuell mikroskopi eller funktionsbaserad bildanalys är dock mödosamt och utmanande. Detta dokument beskriver metoden för att utveckla en artificiell intelligensmodell för att poängsätta MN-analysen med hjälp av bildflödescytometridata.

Automatisering av mikrokärnanalysen med hjälp av avbildningsflödescytometri och artificiell intelligens

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

Att utföra mikrokärnanalysen med hjälp av bildflödescytometri övervinner många begränsningar av traditionella metoder, inklusive låg genomströmning, poängvariation och brist på visuell bekräftelse av händelser. Den största fördelen med denna teknik är att alla viktiga händelser kan förvärvas med hjälp av bildflödescytometri och analyseras med hjälp av artificiell intelligens. Denna metod har potential att användas i storskalig screening av kemikalier och andra föreningar för att testa toxicitet vid högre genomströmning än vad som för närvarande är tillgängligt.När man bygger en ny AI-modell är den största utmaningen att få tillräckligt med bilder av celler med mikrokärnor, så det är viktigt att använda bildmärkningsalgoritmerna. För att börja, starta programvaran för artificiell intelligens eller AI. Under Experimenttyp klickar du på alternativknappen bredvid Träna för att starta ett träningsexperiment för att skapa faltningsneuralt nätverk eller CNN-modellen och klickar på Nästa.På klassnamnen klickar du på Lägg till. I popup-fönstret skriver du Mononucleated och klickar på OK för att lägga till den mononucleated klassen i listan över klassnamn. Upprepa den här processen om du vill lägga till de andra klassnamnen, till exempel Mononucleated med MN, Binucleated, Binucleated with MN, Polynucleated och Irregular morphology.Under Välj filer klickar du på Lägg till filer och bläddrar efter önskade filer som ska läggas till i AI-programvaran för att bygga grundsanningsdata. På skärmen Välj baspopulation letar du sedan upp den icke-apoptotiska populationen från befolkningshierarkin. Högerklicka sedan på den icke-apoptotiska populationen, välj Välj alla matchande populationer och klicka på Nästa.För att tilldela en taggad sanningspopulation av mononukleerade celler med mikrokärna, klicka på klassen Mononucleated with MN under Model Classes till vänster och klicka sedan på lämplig taggad sanningspopulation till höger. När alla lämpliga sanningspopulationer har tilldelats klickar du på Nästa. På skärmen Välj kanaler kontrollerar du att lämpliga kanaler för experimentet har valts.Välj här Bright Field eller BF som kanal ett, besättningar för DNA som kanal sju och klicka sedan på Nästa. Slutligen, på bekräftelseskärmen, klicka på Skapa experiment. Klicka på Taggning för att starta taggningsverktygets gränssnitt.Klicka sedan på zoomverktygen för att beskära bilderna för enklare visning. Och klicka på skjutreglaget för att justera bildstorleken och bestämma antalet bilder som ska visas i galleriet. Klicka på alternativet Skärminställning och välj min-max, vilket ger den bästa kontrastbilden för att identifiera alla viktiga händelser.Klicka sedan på Setup Gallery Display för att ändra färgen på DNA-bilden till gul eller vit, vilket förbättrar visualiseringen av små objekt. Klicka på Kluster för att köra algoritmen för att gruppera bilder med liknande morfologi tillsammans. När klustringen är klar klickar du på de enskilda klustren och börjar tilldela avbildningar till lämpliga modellklasser.När minst 25 objekt har tilldelats varje modellklass blir förutsägelsealgoritmen tillgänglig. Klicka på Förutsäg. När förutsägelsealgoritmen har körts klart lägger du till objekt från de förutsagda klasserna i lämpliga modellklasser.När minst 100 objekt har tilldelats varje modellklass klickar du på fliken Träning högst upp på skärmen och klickar sedan på knappen Träna. När modellträningen är klar klickar du på Visa resultat för att utvärdera modellens noggrannhet. När modellträningen är klar klickar du på menyknappen för att definiera ett nytt experiment.Klicka på alternativknappen bredvid Klassificera under Experimenttyp för att starta ett klassificeringsexperiment och klicka sedan på Nästa. Klicka på modellen som ska användas för klassificering och klicka sedan på Nästa. På skärmen Välj filer klickar du på Lägg till filer.Bläddra efter filerna som ska klassificeras av CNN-modellen och klicka sedan på Nästa. På skärmen Välj baspopulation klickar du sedan på kryssrutan bredvid den icke-apoptotiska populationen i en av de inlästa filerna. Högerklicka på den icke-apoptotiska populationen, klicka på Välj alla matchande populationer för att välja denna population från alla laddade filer och klicka sedan på Nästa.På skärmen Välj kanaler kontrollerar du att kanal ett är valt för det ljusa fältet och att kanal sju är vald för DNA-fläcken och klickar på Nästa. Slutligen, på bekräftelseskärmen, klicka på Skapa experiment. AI-programvaran laddar den valda modellen och alla bilder från de valda datafilerna.Efter laddning klickar du på Slutför. Klicka sedan på Klassificera för att starta klassificeringsskärmen. Och använd kryssrutorna för att välja att använda Random Forest eller RF och CNN.Klicka sedan på knappen Klassificera. Detta inleder processen med att använda RF- och CNN-modellerna för att klassificera ytterligare data och identifiera alla objekt som hör hemma i de angivna modellklasserna. När klassificeringen är klar klickar du på Visa resultat.Klicka på knappen Uppdatera DAF för att öppna fönstret Uppdatera DAF med klassificeringsresultat och klicka sedan på OK för att uppdatera DAF-filerna. För att generera rapporten, på resultatskärmen, klicka på Generera rapport. Om en enskild rapport krävs för varje indata-DAF markerar du kryssrutan bredvid Skapa rapport för varje indata-DAF.Annars klickar du bara på OK för att få rapporterna. Den AI-assisterade klusteralgoritmen grupperar liknande objekt inom ett segment tillsammans, enligt morfologin för både oklassificerade objekt och de objekt som har tilldelats marksanningsmodellklasserna. Kluster som innehåller mononukleerade celler faller på ena sidan av objektkartan, medan de flerkärniga cellerna är på motsatt sida.Binucleated cellkluster faller mellan mono- och flerkärniga cellkluster. Slutligen faller kluster med oregelbunden morfologi i olika områden i objektkartan. Prediktionsalgoritmen är mer robust än klusteralgoritmen när det gäller att identifiera subtila morfologier i bilder.Till exempel mononukleerade celler med MN jämfört med mononukleerade celler utan MN. Modellens prestanda kan bedömas med hjälp av verktyg, inklusive histogram för klassfördelning, noggrannhetsstatistik och en interaktiv förvirringsmatris. I klassfördelningshistogram, ju närmare procentvärdena mellan sanningen och förutsagda populationer, desto mer exakt är modellen. I noggrannhetsstatistiken, Ju närmare dessa mätvärden är 100 %, desto mer exakt är modellen på att identifiera händelser i modellklasserna.Slutligen anger den interaktiva förvirringsmatrisen var modellen felklassificerar händelser. Genotoxicitet mättes som procentandelen mikrokärnor genom mikroskopi, indikerad med klara staplar, och AI indikerad med prickade staplar efter 3 timmars exponering och 24 timmars återhämtning, för Mannitol, Etoposid och Mitomycin C, med användning av både cytochalasin B och icke-cytochalasin B-metoderna. När du skapar ett träningsexperiment ska du se till att inlästa data innehåller bilder från positiva och negativa kontrollexempel.Mikrokärnor är sällsynta och tillräckligt med bilder krävs för att bygga en korrekt AI-modell. Denna procedur tillåter skapandet av AI-modeller för att analysera bildflödesmikrokärndata inom något studieområde, såsom strålningsbiodosimetri. En snabb och robust AI-baserad metod för att identifiera mikrokärnor kan utvidgas till andra tillämpningar, såsom kvantifiering av mikrokärnor som kan vara prediktiva för risken för cancerutveckling.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analysera Cellulär internalisering av Nanopartiklar och bakterier genom att multispektralt Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-området fluorescensmikroskopi och fluorescerande Imaging flödescytometri på en mobiltelefon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Lokalisering och relativ kvantifiering av kolnanorör i celler med multispekt flödescytometri

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Känslig detektion av Proteopathic Seeding aktivitet med FRET flödescytometri

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolering av primära murin retinala Ganglion-celler (RGC) genom flödescytometri

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

En automatiserad metod för att utföra Mikrokärnanalys in vitro med hjälp av Multispektral avbildning flödescytometri

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Äggstocks cancer detektion med Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Högdimensionell flödescytometri för immunfunktionsanalys av dissekerade implantatvävnader

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Blodflödesavbildning med ultrasnabb Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...