Name: automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

1. Görüntüleme akış sitometrisi kullanılarak veri toplama
NOT: Aşağıdaki değişikliklerle Rodrigues ve ark.16'ya bakın ve IFC kullanan edinme bölgelerinin optimum görüntü yakalama için değiştirilmesi gerekebileceğini unutmayın:
<ol><li>Cyt-B olmayan yöntem için, kültürden hemen önce ve iyileşme döneminden hemen sonra her kültürde üreticinin talimatlarını (bkz. Malzeme Tablosu) izleyerek ticari olarak te...

<ol>
	<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HUMN+project+initiative+and+review+of+validation,+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems.">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+No.+487:+In+Vitro+Mammalian+Cell+Micronucleus+Test.+Section+4.">Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4.</a> OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+technique.">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans.">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test:+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B.">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li><li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations,+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated,+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells.">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li><li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure.">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li><li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity.">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li><li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry:+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability.">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li><li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry.">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream&#174;+imaging+flow+cytometer.">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream&#174; imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li><li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+FlowSight&#174;+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro.">Investigating FlowSight&#174; imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li><li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning.">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).</li><li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).</li><li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells.">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li><li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+interactive+machine+learning+for+(bio)image+analysis.">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li><li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning.">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li></ol>

Burada sunulan çalışma, MN testinin puanlamasını otomatikleştirmek için derin öğrenme algoritmalarının kullanımını açıklamaktadır. Son zamanlarda yapılan birkaç yayın, sezgisel, etkileşimli araçların, derinlemesine hesaplama bilgisine ihtiyaç duymadan görüntü verilerini analiz etmek için derin öğrenme modellerinin oluşturulmasına izin verdiğini göstermiştir18,19. Kullanıcı arayüzü güdümlü bir yazılım paketi kullanılara...

Mikronükleus (MN) testi, genetik toksikolojide, insan kullanımı için kozmetik, ilaç ve kimyasalların geliştirilmesinde DNA hasarını değerlendirmek için temeldir 1,2,3,4. Mikroçekirdekler, bölünmeyi takiben çekirdeğe dahil olmayan ve çekirdekten ayrı küçük, dairesel cisimler halinde yoğunlaşan tüm kromozomlardan veya kromozom parçalarından oluşur. Bu nedenle, MN, genotoksisite testi1'de DNA hasarını ölçmek için bir son nokta olarak kullanılabilir.
MN'yi ölçmek için tercih edilen yöntem, Sitokalasin-B (Cyt-B) kullanarak bölünmeyi bloke ederek bir kez bölünmüş binüklee hücreler (BNC'ler) içindedir. Tahlilin bu versiyonunda, sitotoksisite, monoçekirdekli (MONO) ve poliçekirdekli (POLY) hücrelerin puanlanmasıyla da değerlendirilir. Tahlil ayrıca, bloke edilmemiş MONO hücrelerinde MN'nin puanlanmasıyla da yapılabilir, bu da daha hızlı ve skorlanması daha kolaydır, sitotoksisite proliferasyonu değerlendirmek için maruziyet öncesi ve sonrası hücre sayıları kullanılarak değerlendirilir 5,6.
Tahlilin fiziksel puanlaması tarihsel olarak manuel mikroskopi ile gerçekleştirilmiştir, çünkü bu tüm önemli olayların görsel olarak doğrulanmasına izin verir. Bununla birlikte, manuel mikroskopi zorlu ve özneldir1. Böylece, mikroskop slayt taraması ve akış sitometrisi de dahil olmak üzere, her biri kendi avantajlarına ve sınırlamalarına sahip otomatik teknikler geliştirilmiştir. Slayt tarama yöntemleri önemli olayların görselleştirilmesine izin verirken, slaytlar optimum hücre yoğunluğunda oluşturulmalıdır, bu da elde edilmesi zor olabilir. Ek olarak, bu teknik genellikle MONO ve POLY hücrelerinin puanlamasını tehlikeye atabilecek sitoplazmik görselleştirmeden yoksundur 7,8. Akış sitometrisi yüksek verimli veri yakalama sunarken, hücreler lize edilmelidir, böylece tahlilin Cyt-B formunun kullanılmasına izin verilmez. Ek olarak, görüntüleme dışı bir teknik olarak, geleneksel akış sitometrisi anahtar olayların görsel doğrulamasını sağlamaz9,10.
Bu nedenle, MN testini gerçekleştirmek için görüntüleme akım sitometrisi (IFC) araştırılmıştır. ImageStreamX Mk II, geleneksel akış sitometrisinin hızını ve istatistiksel sağlamlığını mikroskopinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme yetenekleriyle tek bir sistemde birleştirir11. IFC kullanılarak, tüm önemli olayların yüksek çözünürlüklü görüntülerinin yakalanabileceği ve özellik tabanlı 12,13 veya yapay zeka (AI) teknikleri14,15 kullanılarak otomatik olarak puanlanabileceği gösterilmiştir. MN testini gerçekleştirmek için IFC'yi kullanarak, mikroskopiye kıyasla çok daha fazla hücrenin daha kısa sürede otomatik skorlaması elde edilebilir.
Bu çalışma, daha önce açıklanan bir görüntü analizi iş akışı16'dan sapmaktadır ve Amnis AI yazılımını (bundan böyle "AI yazılımı" olarak anılacaktır) kullanarak bir Rastgele Orman (RF) ve / veya evrişimli sinir ağı (CNN) modeli geliştirmek ve eğitmek için gereken tüm adımları tartışmaktadır. AI destekli etiketleme araçlarını kullanarak zemin gerçeği verilerinin doldurulması, model eğitim sonuçlarının yorumlanması ve modelin ek verileri sınıflandırmak için uygulanması, genotoksisite ve sitotoksisitenin hesaplanmasına izin verilmesi dahil olmak üzere gerekli tüm adımlar açıklanmaktadır15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 
			1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td>0.22 &#181;m filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td>5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td>Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td>This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td>A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image analysis sofware&#34; 
			The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100220</td>
			<td>&#34;Image acquisition software&#34; 
			This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amnis AI software</td>
			<td>Luminex, a DiaSorin company</td>
			<td>100221</td>
			<td>&#34;AI software&#34; 
			This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA Mixture 100x</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium 1x</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td>This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1x&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900 mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer - 0.4%&#8211;0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td>This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automation of the micronucleus assay using imaging flow cytometry and artificial intelligence

Mikroçekirdek (MN) testi, genetik toksisite için kimyasalları değerlendirmek için dünya çapında düzenleyici kurumlar tarafından kullanılmaktadır. Tahlil iki şekilde gerçekleştirilebilir: MN'yi bir kez bölünmüş, sitokinez bloke edilmiş binüklee hücrelerde veya tamamen bölünmüş monoçekirdekli hücrelerde puanlayarak. Tarihsel olarak, ışık mikroskobu testi puanlamak için altın standart yöntem olmuştur, ancak zahmetli ve özneldir. Akış sitometrisi son yıllarda testi puanlamak için kullanılmıştır, ancak hücresel görüntülerin temel yönlerini görsel olarak doğrulayamama ile sınırlıdır. Görüntüleme akışı sitometrisi (IFC), yüksek verimli görüntü yakalama ve otomatik görüntü analizini birleştirir ve MN testindeki tüm önemli olayların görüntülerini hızlı bir şekilde elde etmek ve puanlamak için başarıyla uygulanmıştır. Son zamanlarda, IFC tarafından elde edilen MN tahlil verilerini puanlamak için evrişimli sinir ağlarına dayanan yapay zeka (AI) yöntemlerinin kullanılabileceği gösterilmiştir. Bu makalede, tüm önemli olayları puanlamak üzere bir derin öğrenme modeli oluşturmak ve ek verileri otomatik olarak puanlamak için bu modeli uygulamak üzere yapay zeka yazılımını kullanmaya yönelik tüm adımlar açıklanmaktadır. AI derin öğrenme modelinden elde edilen sonuçlar, manuel mikroskopi ile iyi bir şekilde karşılaştırılır, bu nedenle IFC ve AI'yı birleştirerek MN testinin tam otomatik puanlamasını sağlar.

Şekil 1, MN testi için bir model oluşturmak üzere AI yazılımını kullanmaya yönelik iş akışını göstermektedir. Kullanıcı istenen .daf dosyalarını AI yazılımına yükler, ardından AI destekli küme (Şekil 2) ve tahmin (Şekil 3) etiketleme algoritmalarını kullanarak nesneleri temel doğruluk modeli sınıflarına atar. Tüm temel doğruluk modeli sınıfları yeterli nesnelerle doldurulduktan sonra, model RF v...

Watch this Scientific Journal Video about Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence at JoVE.com

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

Mikroçekirdek (MN) testi, DNA hasarını ölçmek için iyi kurulmuş bir testtir. Bununla birlikte, manuel mikroskopi veya özellik tabanlı görüntü analizi gibi geleneksel teknikleri kullanarak tahlilin puanlanması zahmetli ve zordur. Bu makalede, görüntüleme akışı sitometri verilerini kullanarak MN testini puanlamak için bir yapay zeka modeli geliştirme metodolojisi açıklanmaktadır.

Görüntüleme Akış Sitometrisi ve Yapay Zeka Kullanılarak Mikronükleus Testinin Otomasyonu

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

Mikronükleus testinin görüntüleme akış sitometrisi kullanılarak gerçekleştirilmesi, düşük verim, skor değişkenliği ve olayların görsel olarak doğrulanmaması gibi geleneksel yöntemlerin birçok sınırlamasının üstesinden gelir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm önemli olayların görüntüleme akış sitometrisi kullanılarak elde edilebilmesi ve yapay zeka kullanılarak analiz edilebilmesidir. Bu yöntem, şu anda mevcut olandan daha yüksek verimde toksisiteyi test etmek için kimyasalların ve diğer bileşiklerin büyük ölçekli taranmasında kullanılma potansiyeline sahiptir.Yeni bir AI modeli oluştururken, asıl zorluk mikroçekirdekli hücrelerin yeterli görüntülerini elde etmektir, bu nedenle görüntü etiketleme algoritmalarını kullanmak önemlidir. Başlamak için Yapay Zeka veya AI yazılımını başlatın. Deneme Türü altında, Evrişimli Sinir Ağı veya CNN modelini oluşturmaya yönelik bir eğitim denemesi başlatmak için Eğit'in yanındaki radyo düğmesini tıklatın ve İleri'yi tıklatın.Sınıf Adları'nda, Ekle'ye tıklayın. Açılır pencerede, Mononucleated yazın ve mononucleated sınıfı sınıf adları listesine eklemek için Tamam'a tıklayın. MN ile Mononükleated, Binucleated, MN ile Binükleated, Polynucleated ve Irregular morfoloji gibi diğer sınıf adlarını eklemek için bu işlemi tekrarlayın.Dosya Seç altında, Dosya Ekle'ye tıklayın ve temel doğruluk verilerini oluşturmak için AI yazılımına eklenmesi istenen dosyalara göz atın. Ardından, Temel Popülasyon Seç ekranında, popülasyon hiyerarşisinden apoptotik olmayan popülasyonu bulun. Ardından apoptotik olmayan popülasyona sağ tıklayın, Tüm Eşleşen Popülasyonları Seç'i seçin ve İleri'ye tıklayın.Mikronükleuslu mononüklee hücrelerin etiketli bir doğruluk popülasyonunu atamak için, soldaki Model Sınıfları altındaki MN sınıfı ile mononükleated öğesine tıklayın ve ardından sağdaki uygun etiketli doğruluk popülasyonuna tıklayın. Tüm uygun gerçek popülasyonları atandıktan sonra, İleri'ye tıklayın. Kanalları Seç ekranında, deneme için uygun kanalların seçildiğinden emin olun.Burada, birinci kanal olarak Parlak Alan veya BF'yi, kanal yedi olarak DNA sürülerini seçin ve ardından İleri'ye tıklayın. Son olarak, Onay ekranında Deneme Oluştur'a tıklayın. Etiketleme aracı arayüzünü başlatmak için Etiketleme'ye tıklayın.Ardından, daha kolay görüntüleme için görüntüleri kırpmak üzere yakınlaştırma araçlarına tıklayın. Görüntü boyutunu ayarlamak ve galeride gösterilecek görüntü sayısına karar vermek için kaydırma çubuğuna tıklayın. Ekran Ayarı seçeneğine tıklayın ve tüm önemli olayları tanımlamak için en iyi kontrast görüntüsünü sağlayan min-max'i seçin.Ardından, DNA görüntüsünün rengini sarı veya beyaza değiştirmek için Galeri Ekranını Ayarla'ya tıklayın, bu da küçük nesnelerin görselleştirilmesini iyileştirecektir. Benzer morfolojiye sahip görüntüleri birlikte gruplandırmak üzere algoritmayı çalıştırmak için Küme'ye tıklayın. Kümeleme tamamlandıktan sonra, tek tek kümelere tıklayın ve görüntüleri uygun model sınıflarına atamaya başlayın.Her model sınıfına en az 25 nesne atandıktan sonra, tahmin algoritması kullanılabilir hale gelir. Tahmin'e tıklayın. Tahmin algoritması çalışmayı tamamladıktan sonra, tahmin edilen sınıflardan nesneleri uygun model sınıflarına ekleyin.Her model sınıfına en az 100 nesne atandıktan sonra, ekranın üst kısmındaki Eğitim sekmesine ve ardından Eğit düğmesine tıklayın. Model eğitimi tamamlandıktan sonra, model doğruluğunu değerlendirmek için Sonuçları Görüntüle'ye tıklayın. Model eğitimi tamamlandıktan sonra, yeni bir deneme tanımlamak için menü düğmesine tıklayın.Deneme Türü altında, sınıflandırma denemesi başlatmak için Sınıflandır'ın yanındaki radyo düğmesini tıklatın ve İleri'yi tıklatın. Sınıflandırma için kullanılacak modele tıklayın, ardından İleri'ye tıklayın. Dosya Seç ekranında, Dosya Ekle'ye tıklayın.CNN modeline göre sınıflandırılacak dosyalara göz atın ve ardından İleri'ye tıklayın. Ardından, Temel Popülasyon Seç ekranında, yüklenen dosyalardan birinde apoptotik olmayan popülasyonun yanındaki onay kutusuna tıklayın. Apoptotik olmayan popülasyona sağ tıklayın, yüklenen tüm dosyalardan bu popülasyonu seçmek için Tüm Eşleşen Popülasyonları Seç'e tıklayın ve ardından İleri'ye tıklayın.Kanalları Seç ekranında, Parlak Alan için birinci kanalın ve DNA lekesi için yedinci kanalın seçildiğini doğrulayın ve İleri'yi tıklatın. Son olarak, onay ekranında Deneme Oluştur'a tıklayın. AI yazılımı, seçilen modeli ve seçilen veri dosyalarından tüm görüntüleri yükler.Yükledikten sonra Son'a tıklayın. Ardından, sınıflandırma ekranını başlatmak için Sınıflandır'a tıklayın. Ayrıca, Rastgele Orman veya RF ve CNN kullanmayı seçmek için onay kutularını kullanın.Ardından Sınıflandır düğmesine tıklayın. Bu, ek verileri sınıflandırmak ve belirtilen model sınıflarına ait tüm nesneleri tanımlamak için RF ve CNN modellerini kullanma işlemini başlatır. Sınıflandırma tamamlandıktan sonra, Sonuçları Görüntüle'ye tıklayın.DAF'ları sınıflandırma sonuçlarıyla güncelleştir penceresini açmak için DAF'ları Güncelleştir düğmesini tıklatın ve ardından DAF dosyalarını güncelleştirmek için Tamam'ı tıklatın. Raporu oluşturmak için, sonuçlar ekranında Rapor Oluştur'a tıklayın. Her giriş DAF'ı için ayrı bir rapor gerekiyorsa, Her giriş DAF'ı için rapor oluştur'un yanındaki onay kutusunu işaretleyin.Aksi takdirde, raporları almak için Tamam'a tıklamanız yeterlidir. AI destekli küme algoritması, hem sınıflandırılmamış nesnelerin hem de temel doğruluk modeli sınıflarına atanan nesnelerin morfolojisine göre, bir segment içindeki benzer nesneleri birlikte gruplandırır. Monoçekirdekli hücreler içeren kümeler nesne haritasının bir tarafına düşerken, çok çekirdekli hücreler diğer taraftadır.Binüklee hücre kümeleri, mono ve çok çekirdekli hücre kümeleri arasına girer. Son olarak, düzensiz morfolojiye sahip kümeler, nesne haritasının farklı alanlarına düşer. Tahmin algoritması, görüntülerdeki ince morfolojileri tanımlamada küme algoritmasından daha sağlamdır.Örneğin, MN'li Mononüklee Hücrelere karşı MN'siz Mononüklee Hücreler. Modelin performansı, sınıf dağılımı histogramları, doğruluk istatistikleri ve etkileşimli bir karışıklık matrisi gibi araçlar kullanılarak değerlendirilebilir. Sınıf dağılımı histogramlarında, gerçek ve tahmin edilen popülasyonlar arasındaki yüzde değerleri ne kadar yakınsa, model o kadar doğru olur. Doğruluk istatistiklerinde, bu metrikler %100'e ne kadar yakınsa, model sınıflarındaki olayları tanımlamada model o kadar doğru olur.Son olarak, etkileşimli karışıklık matrisi, modelin olayları nerede yanlış sınıflandırdığını gösterir. Genotoksisite, hem Sitokalasin B hem de Sitokalasin B yöntemleri kullanılarak, Mannitol, Etopositid ve Mitomisin C için 3 saatlik maruz kalma ve 24 saatlik iyileşmeyi takiben mikroskopi ile mikronükleus yüzdesi ile ölçüldü. Bir eğitim denemesi oluştururken, yüklenen verilerin pozitif ve negatif kontrol örneklerinden görüntüler içerdiğinden emin olun.Mikroçekirdekler nadirdir ve doğru bir AI modeli oluşturmak için yeterli görüntü gereklidir. Bu prosedür, radyasyon biyodozimetrisi gibi herhangi bir çalışma alanındaki görüntüleme akışı mikronükleus verilerini analiz etmek için AI modellerinin oluşturulmasına izin verir. Mikroçekirdekleri tanımlamak için hızlı ve sağlam bir AI tabanlı yöntem, kanser gelişimi riski için öngörücü olabilecek mikroçekirdeklerin nicelleştirilmesi gibi diğer uygulamalara da uzanabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Bir Cep telefonu ile ilgili Geniş alan Floresan Mikroskopi ve Floresan Görüntüleme Flow Sitometri

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Çokspektrumlu Görüntüleme Sitometrisi ile Hücreleri yerelleştirme ve Karbon nanotüpler Bağıl Kantitasyonu

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Fotoakustik Akış Sitometri kullanarak Yumurtalık Kanseri Algılama

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Ultra Hızlı Doppler ile Kan Akışı Görüntüleme

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...