Name: tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis
Uploaded: 2022-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis at JoVE.com

1. Klargøring af krydsmembrankammeret
<ol><li>Forbered en flad, ikke-porøs overflade, såsom et plan af glas eller keramisk belagt metalbase på et armstativ ved at tørre det af med 70% ethanol og derefter dække det med et enkelt lag plastfolie, og sørg for, at plastfolien er flad og uden bobler eller rynker (se figur 1A).</li>
	<li>Tape 100% rayon linse rengøringspapir ned til den forberedte overflade. Sørg for, at den er flad og let stram med tape på tværs af al...

<ol>
	<li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+signs:+trends+in+reported+vectorborne+disease+cases+-+United+States+and+territories,+2004-2016.">Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).</li><li>Busch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+movement+of+invasive+cattle+fever+ticks+(Rhipicephalus+microplus)+in+southern+Texas+leads+to+shared+local+infestations+on+cattle+and+deer.">Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 188 (2014).</li><li>S&#252;ss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+makes+ticks+tick?+Climate+change,+ticks,+and+tick-borne+diseases.">What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases.</a> Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).</li><li>Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Pe&#241;a, A., Kahl, O., Lindgren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+climate+change+on+ticks+and+tick-borne+diseases+in+Europe.">Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe.</a> Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Ticks. , (1991).</li><li>Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+an+outer+surface+protein+on+Borrelia+burgdorferi+during+tick+feeding.">Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).</li><li>Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inability+of+a+variant+strain+of+Anaplasma+phagocytophilum+to+infect+mice.">Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).</li><li>Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+surface+protein+Lmp1+facilitates+pathogen+dissemination+through+ticks+as+studied+by+an+artificial+membrane+feeding+system.">Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).</li><li>Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+maintenance+of+multi-host+ixodid+ticks+in+the+laboratory.">Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory.</a> Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).</li><li>Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Lyme+borreliae+proteins+promoting+vertebrate+host+blood-specific+spirochete+survival+in+Ixodes+scapularis+nymphs+using+artificial+feeding+chambers.">Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).</li><li>Hart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+tropism+determination+by+convergent+evolution+of+immunological+evasion+in+the+Lyme+disease+system.">Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).</li><li>Bernard, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+early+immune+evasion+strategies+of+a+bacterial+pathogen.">Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).</li><li>Pierce, A. E., Pierce, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+note+on+the+cultivation+of+Boophilus+microplus+(Canestrini,+1887)+(Ixodidae:+Acarina)+on+the+embyonated+hen+egg.">A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg.</a> Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).</li><li>Doube, B. M., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature,+relative+humidity+and+host+factors+on+the+attachment+and+survival+of+Boophilus+microplus+(Canestrini)+larvae+to+skin+slices.">The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices.</a> International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+feeding+assay+to+test+acaricides+for+control+of+hard+ticks.">An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks.</a> Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).</li><li>Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life-cycle+of+the+bont+tick+Amblyomma+hebraeum+in+vitro.">The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro.</a> International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks.">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).</li><li>Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silicone+membrane+for+in+vitro+feeding+of+Ixodes+scapularis+(Ixodida:+Ixodidae).">A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae).</a> Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+immature+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae)+by+membrane+feeding.">Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding.</a> Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+dynamics+and+antibiotic+elimination+of+symbiotic+Rickettsia+buchneri+in+the+tick+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae).">Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).</li><li>Graham, E. E., Poland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Fluon+conditioning+for+capturing+cerambycid+beetles+in+different+trap+designs+and+persistence+on+panel+traps+over+time.">Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time.</a> Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).</li><li>Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+maintenance+and+description+of+cell+lines+from+the+tick+Ixodes+scapularis.">Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis.</a> Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).</li><li>Lehane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+single+and+coinfections+of+human+pathogens+in+Ixodes+ticks+from+five+geographical+regions+in+the+United+States,+2013-2019.">Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).</li><li>Gonz&#225;lez, J., Bickerton, M., Toledo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+artificial+membrane+feeding+for+ixodid+ticks.">Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks.</a> Acta Tropica. 215, (2021).</li><li>Kr&#243;l, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+transmission+paths+for+three+different+Bartonella+spp.+in+Ixodes+ricinus+ticks+using+artificial+feeding.">Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding.</a> Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).</li><li>Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+ticks.">Biology of ticks.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).</li></ol>

Kunstig membranfodring af flåter giver et nyttigt værktøj til en række eksperimentelle procedurer, men vil sandsynligvis ikke erstatte dyrefoder til alle applikationer. Opretholdelse af store kolonier af flåter på alle livsstadier uden dyrefoder er generelt uholdbart. I stedet er det kunstige fodringssystem værdifuldt til andre formål såsom at inficere flåter med patogener, der ikke understøttes af modelværter, evaluere virkningerne af kontrollerede doser af forbindelser eller mikroorganismer på flåterne i ...

Flåtbårne sygdomme påvirker stærkt menneskers og dyrs sundhed over hele verden og er ansvarlige for mere end to tredjedele af alle vektorassocierede sygdomme i USA fra 2004 til 20161. Derudover er antallet af tilfælde vokset i de senere år, hvor flere mennesker og husdyr er ramt af flåter og deres tilknyttede sygdomme 2,3. Mens der sandsynligvis er mange årsager til den opadgående tendens i antallet af tilfælde, er det ændrede klima en vigtig faktor 3,4. Den forventede fortsatte stigning i antallet af tilfælde af flåtbårne sygdomme understreger behovet for at udvikle nye værktøjer til at undersøge forholdet mellem flåter og de patogener, de overfører.
Det er kendt, at flåter gennemgår ændringer i fysiologi og genekspression under fodring, og at disse ændringer spiller en rolle i patogenoverførsel 5,6. Det kan være vanskeligt at udføre undersøgelser, der undersøger virkningerne af fuld og delvis fodring på patogenoverførsel og erhvervelse ved hjælp af dyremodeller, især i situationer, hvor gnavermodeller ikke er modtagelige for infektion med et bestemt patogen. For eksempel overføres Anaplasma phagocytophilum Variant-1-stammen naturligt mellem Ixodes scapularis og hjorte, men er ude af stand til at inficere mus, hvilket komplicerer flåtinfektion i laboratoriet7. Kunstige fodringssystemer kan også anvendes til at hjælpe med at studere patogener som Borrelia burgdorferi via brug af transgene mutanter, der har gendeletioner, der hæmmer transmission eller infektion8. Brug af et kunstigt fodringssystem hjælper forskere med at isolere genernes rolle ved at tillade infektion eller transmission kun at forekomme på flåtens side og derved isolere ethvert værtsrespons, der kan forvirre sådanne undersøgelser.
På samme måde kan nogle livsstadier af flåter, der er involveret i sygdom og overførsel af dyr, muligvis ikke tilskyndes til at fodre med almindelige laboratoriemodelarter. Ixodes scapularis hunner skal for eksempel fodres med større dyr, typisk kaniner9. Selv om de ofte er tilgængelige for laboratorieforsøg, overstiger de administrative krav og kravene til opdræt af kaniner kravene til små gnavere og kan være uoverkommelige for nogle laboratorier. Andre flåtarter, især dem, der er af veterinær betydning, skal fodres med kvæg eller andre store dyr, der ikke er praktiske at bruge i de fleste laboratorier. In vitro-fodrings - og infektionsmetoder, såsom kunstig membranfodring, giver alternativer til at bruge store eller eksotiske værtsdyr.
Derudover giver brugen af et kunstigt fodringssystem mulighed for visse analyser, som måske ikke er mulige med traditionelle dyrefodringsmetoder. Et sådant eksempel er, at ved at adskille blodkilden fra fodringsmekanismen bliver det muligt at undersøge den rolle, som forskellige værters blod kan have i B. burgdorferi-transmission 10. Denne undersøgelse af værtsblod og selve blodets rolle i fravær af værtsimmunrespons er en vigtig faktor for at kunne forstå patogenoverførselscyklusser og en, som kunstige fodringssystemer er i stand til at hjælpe med at besvare11. Det bliver også muligt at kvantificere det nøjagtige overførselsantal af et patogen under et foder i stedet for blot at undersøge overførselssucces og etablering i en vært 8,12.
Nogle af de første kunstige fodringsmembraner lavet til hårde flåter blev lavet af dyreskind eller dyreafledte membraner i 1950'erne og 1960'erne13,14. På grund af disse membraners biologiske natur var der problemer med både produktion af nye membraner og holdbarhed. I 1990'erne blev der udviklet fuldt kunstige membraner, der udnyttede en bagside af net, papir eller stof med silikoneimprægnering15,16. Silikone var ideel, da dens fysiske egenskaber efterligner hudens strækbarhed og lette klæbrighed sammen med dens bioiboende natur. På baggrund af dette beskrev Krober og Guerin, hvis arbejde denne teknik var baseret på, en silikoneimprægneret rayonmembranfodringsteknik til kunstig fodring af I. ricinus17.
Forfining af metoderne til I. scapularis, en nært beslægtet art, har ført til bemærkelsesværdige forskelle i hårdheden af silikone, der anvendes til membranimprægnering, opskriften på membranproduktion, kammerets dimensioner og fastgørelsesstimulerende middel. Mens de forbedringer, der er rapporteret i denne undersøgelse, har resulteret i lignende membranegenskaber som dem, der er rapporteret af Andrade et al., Som også udviklede en silikonebaseret membran baseret på Krober og Guerin til brug i I. scapularis, er der en forskel i silikoneimprægneringstrinnene, hvilket giver fleksibilitet til at udnytte denne protokol til umodne livsstadier af I. scapularis 15, 18. Denne undersøgelse beskriver også tilføjelser og tekniske ændringer baseret på gentagen brug af denne metode, bedste praksis, der resulterer i et vellykket feed, og fejlfinding af problemer, der kan opstå. Denne metode er blevet brugt til at fodre alle aktive livsstadier, inficere flåter med patogene bakterier og udsætte flåter for flere doser antibiotika19,20. Mens den viste kunstige membranfodringsmetode er for I. scapularis, kan denne metode let tilpasses andre arter af flåter med mindre ændringer i membrantykkelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>00-10 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-10</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>00-50 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-50</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Mold Star 30</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1852-1VL</td>
			<td>Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DBB500</td>
			<td>Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clingwrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-790-2C</td>
			<td>Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2871</td>
			<td>Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>139386-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td>100% rayon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin &#160;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>N-750-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S37440&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/fungizone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 &#181;g/mL of streptomycin, and 25 &#181;g/mL of Amphotericin B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagostimulant</td>
			<td>Made in House</td>
			<td></td>
			<td>Collected from prior tick feeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8585K204&#160;</td>
			<td>Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber O-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K38&#160;</td>
			<td>5 mm thick, 1.25 inch inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft touch forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470315-238&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unryu paper&#160;</td>
			<td>Art supply stores</td>
			<td></td>
			<td>mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis

Flåter og deres tilknyttede sygdomme er et vigtigt emne for undersøgelse på grund af deres folkesundhed og veterinære byrde. Imidlertid kan fodringsbehovet for flåter under både undersøgelse og opdræt begrænse eksperimentelle spørgsmål eller laboratoriernes evne til at undersøge flåter og deres tilknyttede patogener. Et kunstigt membranfodringssystem kan reducere disse problemer og åbne nye forskningsveje, som måske ikke har været mulige med traditionelle dyrefodringssystemer. Denne undersøgelse beskriver et kunstigt membranfodringssystem, der er blevet raffineret til fodring og engorgement succes for alle Ixodes scapularis livsstadier. Desuden kan det kunstige membranfodringssystem, der er beskrevet i denne undersøgelse, modificeres til brug sammen med andre flåtarter gennem simpel forfining af den ønskede membrantykkelse. Fordelene ved et kunstigt membranfodringssystem opvejes af systemets arbejdsintensitet, de yderligere miljøfaktorer, der kan påvirke fodringssucces, og behovet for at forfine teknikken for hver ny art og livsfase af flåter.

En vellykket fodring afhænger af, om der ønskes en delvis eller fuld engorgement. Succesfuldt fodret I. scapularis drej en skygge af gunmetal grå for voksne og løsne sig alene fra membranen. Men hvis de i det mindste er ærtestore, kan de løsnes fra membranen, når fodringen er afsluttet. For umodne stadier af I. scapularis varierer størrelsen for fuldt engorged flåter, og fordi de i modsætning til voksne ikke udviser en farveændring, er løsrivelse den bedste måde at afgøre, om et kryds er f...

Watch this Scientific Journal Video about Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis at JoVE.com

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Præsenteret her er en metode til blodfodring af flåter in vitro via et kunstigt membransystem for at muliggøre delvis eller fuld overfyldning af en række forskellige flåtlivsstadier.

Tick kunstig membranfodring til Ixodes scapularis

Ticks and their associated diseases are an important topic of study due to their public health and veterinary burden. However, the feeding requirements of ...

Mens kunstig membranfodring er blevet gjort før, er vores protokol enklere at oprette og kan tilpasses andre flåtarter med nogle ændringer. Den største fordel ved kunstig membranfodring er, at det giver mulighed for eksponering for patogener og behandlinger, der muligvis ikke er mulige via dyrefoder. Dette kunstige membranfodringssystem kan anvendes på andre leddyrarter med nogle test for ideelle fagostimulanser og modifikationer på ideel membrantykkelse.At producere den korrekte membrantykkelse kræver en vis øvelse. Sørg for at bruge et mikrometer til at måle tykkelsen flere steder på membranen. Benjamin Cull, postdoc i vores laboratorium, vil hjælpe mig med at demonstrere proceduren.Til at begynde med skal du tørre en flad, ikke-porøs overflade, såsom en glasrude eller keramisk belagt metalbase på et armstativ med 70% ethanol, og derefter dække det med et enkelt lag plastfolie. Sørg for, at plastfolien er flad og uden bobler eller rynker. Tape 100 % rayon-linserengøringspapir fast på den forberedte overflade.Sørg for, at den er flad og let stram med tape på tværs af alle fire sider af papiret. Forbered silikoneblandingen 0010 hårdhed ved at måle fem ml af hver del af silikonesættet i en engangsbeholder. Bland de to væsker let og tilsæt 1,5 ml hexan.Fortsæt blandingen, indtil blandingen er homogen og grundigt blandet. Brug en lille gummiskraber til at fordele silikoneblandingen over linsepapiret, og lad den stå i et minut for at sikre, at silikonen er gennemblødt i linsepapiret. Skrab forsigtigt overskydende silikone til siden med gummiskraberen ved hjælp af en lille mængde nedadgående tryk.Udfør et andet pas med gummiskraberen uden at udøve det nedadgående tryk for at fjerne silikonelinjer og producere et glat lag. Kun for larver dyppes toppen af fødekammeret i Fluon-fluorpolymerharpiks flere gange, så det tørrer mellem applikationer for at producere et ensartet lag. Lad membranen hærde i mindst 24 timer i et støvfrit miljø, såsom et lukket kemikalie- eller biosikkerhedsskab.Bland derefter lige dele silikoneblanding A og B for at forberede silikoneblandingen med 30 hårdheder til at fastgøre kamrene til membranen. Dyp polykarbonatkamrene cirka en kvart tomme ind i silikoneblandingen, og læg dem derefter på membranpladen, og pas på ikke at overlappe nogen af båndene. Lad den fastgjorte silikone hærde i mindst 24 timer.Brug en skalpel til forsigtigt at skære membranen rundt om hvert af de vedhæftede kamre og trimme kanterne ned, så den kan passe glat ind i en brønd på de seks brøndplader uden meget skrabning på siderne. Tillad tilstrækkeligt materiale uden for kammeret for at maksimere tilsætningen af membranen. Skær et lille stykke af den resterende membran fra hvert hjørne og midten af membranpladen.Fjern plastfolien fra hvert stykke og mål stykkerne med et mikrometer for at bestemme den gennemsnitlige membrantykkelse. Anbring fødekamrene sammen med en O-ring pr. kammer i et glasbægerglas, der skal autoklaveres ved 121 grader Celsius i mindst 20 minutter for at sterilisere. Lad kamrene køle af, før du bruger dem.Efter at have taget de forberedte, autoklaverede membrankamre ud og placeret O-ringen omkring dem, skal du fylde hvert kammer med nok 70% ethanol til at dække membranen. Lad det sidde i en seks brøndplade i fem minutter, og se derefter efter lækager mellem kammeret og membranen og i selve membranen. Tøm ethanolen ud af kamrene, og lad den derefter lufttørre inde i et biosikkerhedsskab eller laminar strømningshætte.For at opvarme og aktivere komplementet i blodet opvarmes det ved 56 grader Celsius i 40 minutter og suppleres mekanisk defibrilleret kvægblod med to gram pr. Liter glukose. Når membranen er tør, skal du anvende omkring 20 mikroliter fagstimulerende middel på indersiden af kammeret og vippe kammeret for at sprede det rundt om overfladen. Når fagstimulerende er tørt, skal du hurtigt tilføje flåterne til kammeret med enten en børste eller tang.Forsegl toppen med parafilm, da varmen fra vandbadet kan få den til at rive. Derefter tilsættes fem ml af varmen og aktiveret blod pr. Brønd eller kammer i et konisk rør og anbringes i vandbadet indstillet til 36 grader Celsius. Tilsæt fem mikroliter tre millimolær ATP og 50 mikroliter 100X lager penicillin streptomycin fungizone pr. Fem ml blod til røret og overfør 4,5 ml blod til en brønd på en seks brøndplade.Placer forsigtigt kammeret i brønden, juster O-ringhøjden på kammeret, så membranen sidder i blodet, men blodniveauet omkring siden ikke overgår brønden. Placer derefter brønden i blodet i en vinkel for at undgå dannelse af luftbobler mellem blodet og membranen. Placer låget på de seks brøndplader oven på fødekamrene.Sæt de seks brøndplader med kamre i det forberedte 34 grader Celsius vandbad og låget. Tilsæt fem mikroliter tre millimolær ATP og 50 mikroliter 100X lager penicillin streptomycin fungizone pr. Brønd til blodrøret og overfør 4,5 ml blod til en brønd med en frisk seks brøndplade som vist tidligere. Tag den seks brøndplade med krydskammeret ud af vandbadet og fjern kammeret fra brønden.Skyl ydersiden af kammeret og membranen med 10 ml steriliseret 1X PBS for at fjerne blodet. Brug autoklaveret filterpapir til forsigtigt at tørre membranen og kammeret for at fjerne overskydende PBS. Hvis der er meget kondens inde i kammeret, skal du tørre de våde pletter med autoklaveret filterpapir, før du forsegler det med frisk parafilm.Udskift derefter parafilmen øverst i kammeret. Placer flåtkammeret i den nye seks brøndplade med frisk blod, og juster O-ringhøjden, hvis det er nødvendigt. Gentag disse trin for hvert kammer på pladen.Til sidst placeres låget på den seks brøndplade over toppen af kamrene, og den nye seks brøndplade flyttes tilbage i vandbadet med 34 grader Celsius. Et løbende foder med delvist engorged ixodes scapularis nymfer er vist her. De sorte eller brune prikker omkring fastgørelsesstederne er frosten, der kan opsamles under og efter foderet for at gøre fagostimulerende.Delvist engorged ixodes scapularis nymfer ses fastgjort til membranen. En skal af den engorged larver skimmel kan også ses her. Flåtfyldningsnumrene og ægmassevægtene er vist i denne tabel.Larve- og nymphal-engorgement eksperimentelle betingelser havde hjorteorganhomogenat tilsat blodet ud over de kosttilskud, der blev brugt i denne teknik. Her blev vellykket engorgement defineret som enten engorged flåter, der med succes smeltede til næste levende stadium eller engorged hunner, der med succes lagde æg. Det kræver øvelse at opnå en acceptabel tykkelse, når der påføres silikone på linsepapiret, så det er altid vigtigt at måle membranens tykkelse før brug.Membranfodring kan udsætte flåter for patogener eller antibiotika. Virkningerne af disse på aspekter af flåtbiologi såsom smeltesucces, æglægning og overlevelse kan vurderes efter fodring.

Research

JoVE Journal

Biology

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Anvendelse af en robot til Højkapacitetsforskning Krystallisation af membranproteiner i Lipidiske mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Høst og Cryo-køling Krystaller af membranproteiner dyrket i Lipidiske mesofaser for Structure Bestemmelse ved makromolekylær krystallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Mikroperfusionskammerindretning Teknik at undersøge Regulering af mikrokardannelse permeabilitet i rotte mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Højt fedtindhold Fodring Paradigme for Larver Zebrafisk: Fodring, Levende Imaging, og kvantificering af fødeindtagelse

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtilstand udtynding super-resolution Imaging i pattedyrceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...