Name: tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis
Uploaded: 2022-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis at JoVE.com

1. הכנת תא קרום הקרציות
<ol><li>הכינו משטח שטוח ולא נקבובי כמו בסיס זכוכית או מתכת מצופה קרמיקה של מעמד זרוע על-ידי ניגובו באתנול 70% ולאחר מכן כסו אותו בשכבה אחת של ניילון נצמד, וודאו שהניילון הנצמד שטוח וללא בועות או קמטים (ראו איור 1A).</li>
	<li>הדביקו נייר ניקוי עדשה 100% קר...

<ol>
	<li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+signs:+trends+in+reported+vectorborne+disease+cases+-+United+States+and+territories,+2004-2016.">Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).</li><li>Busch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+movement+of+invasive+cattle+fever+ticks+(Rhipicephalus+microplus)+in+southern+Texas+leads+to+shared+local+infestations+on+cattle+and+deer.">Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 188 (2014).</li><li>S&#252;ss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+makes+ticks+tick?+Climate+change,+ticks,+and+tick-borne+diseases.">What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases.</a> Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).</li><li>Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Pe&#241;a, A., Kahl, O., Lindgren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+climate+change+on+ticks+and+tick-borne+diseases+in+Europe.">Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe.</a> Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Ticks. , (1991).</li><li>Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+an+outer+surface+protein+on+Borrelia+burgdorferi+during+tick+feeding.">Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).</li><li>Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inability+of+a+variant+strain+of+Anaplasma+phagocytophilum+to+infect+mice.">Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).</li><li>Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+surface+protein+Lmp1+facilitates+pathogen+dissemination+through+ticks+as+studied+by+an+artificial+membrane+feeding+system.">Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).</li><li>Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+maintenance+of+multi-host+ixodid+ticks+in+the+laboratory.">Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory.</a> Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).</li><li>Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Lyme+borreliae+proteins+promoting+vertebrate+host+blood-specific+spirochete+survival+in+Ixodes+scapularis+nymphs+using+artificial+feeding+chambers.">Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).</li><li>Hart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+tropism+determination+by+convergent+evolution+of+immunological+evasion+in+the+Lyme+disease+system.">Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).</li><li>Bernard, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+early+immune+evasion+strategies+of+a+bacterial+pathogen.">Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).</li><li>Pierce, A. E., Pierce, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+note+on+the+cultivation+of+Boophilus+microplus+(Canestrini,+1887)+(Ixodidae:+Acarina)+on+the+embyonated+hen+egg.">A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg.</a> Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).</li><li>Doube, B. M., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature,+relative+humidity+and+host+factors+on+the+attachment+and+survival+of+Boophilus+microplus+(Canestrini)+larvae+to+skin+slices.">The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices.</a> International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+feeding+assay+to+test+acaricides+for+control+of+hard+ticks.">An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks.</a> Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).</li><li>Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life-cycle+of+the+bont+tick+Amblyomma+hebraeum+in+vitro.">The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro.</a> International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks.">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).</li><li>Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silicone+membrane+for+in+vitro+feeding+of+Ixodes+scapularis+(Ixodida:+Ixodidae).">A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae).</a> Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+immature+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae)+by+membrane+feeding.">Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding.</a> Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+dynamics+and+antibiotic+elimination+of+symbiotic+Rickettsia+buchneri+in+the+tick+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae).">Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).</li><li>Graham, E. E., Poland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Fluon+conditioning+for+capturing+cerambycid+beetles+in+different+trap+designs+and+persistence+on+panel+traps+over+time.">Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time.</a> Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).</li><li>Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+maintenance+and+description+of+cell+lines+from+the+tick+Ixodes+scapularis.">Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis.</a> Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).</li><li>Lehane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+single+and+coinfections+of+human+pathogens+in+Ixodes+ticks+from+five+geographical+regions+in+the+United+States,+2013-2019.">Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).</li><li>Gonz&#225;lez, J., Bickerton, M., Toledo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+artificial+membrane+feeding+for+ixodid+ticks.">Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks.</a> Acta Tropica. 215, (2021).</li><li>Kr&#243;l, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+transmission+paths+for+three+different+Bartonella+spp.+in+Ixodes+ricinus+ticks+using+artificial+feeding.">Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding.</a> Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).</li><li>Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+ticks.">Biology of ticks.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).</li></ol>

האכלה מלאכותית של קרציות באמצעות ממברנות מספקת כלי שימושי למגוון הליכים ניסיוניים, אך לא צפויה להחליף את האכלת בעלי החיים בכל היישומים. שמירה על מושבות גדולות של קרציות בכל שלבי החיים ללא האכלת בעלי חיים היא בדרך כלל בלתי נסבלת. במקום זאת, מערכת ההזנה המלאכותית היא בעלת ערך למטרות אחרות כג...

מחלות המועברות על ידי קרציות משפיעות מאוד על בריאותם של בני אדם ובעלי חיים ברחבי העולם, ואחראיות ליותר משני שלישים מכל המחלות הקשורות לווקטורים בארה"ב בין השנים 2004 ל -20161. בנוסף, מספר המקרים גדל בשנים האחרונות, כאשר יותר אנשים ובעלי חיים מושפעים מקרציות והמחלות הקשורות אליהן 2,3. בעוד שסביר להניח שיש סיבות רבות למגמת העלייה במספר המקרים, האקלים המשתנה הוא גורם חשוב 3,4. העלייה המתמשכת הצפויה במספר מקרי המחלה המועברת על ידי קרציות מדגישה את הצורך לפתח כלים חדשים לחקר היחסים בין קרציות לפתוגנים שהן מעבירות.
ידוע כי קרציות עוברות שינויים פיזיולוגיים וביטוי גנים במהלך ההאכלה וכי שינויים אלה ממלאים תפקיד בהעברת פתוגן 5,6. ייתכן שיהיה קשה לבצע מחקרים הבוחנים את ההשפעות של הזנה מלאה וחלקית על העברה ורכישה של פתוגנים באמצעות מודלים של בעלי חיים, במיוחד במצבים שבהם מודלים של מכרסמים אינם רגישים לזיהום על ידי פתוגן מסוים. לדוגמה, זן Anaplasma phagocytophilum Variant-1 מועבר באופן טבעי בין Ixodes scapularis לאיילים אך אינו מסוגל להדביק עכברים, מה שמסבך את זיהום הקרציות במעבדה7. מערכות הזנה מלאכותיות יכולות להיות מיושמות גם כדי לסייע בחקר פתוגנים כגון Borrelia burgdorferi באמצעות שימוש במוטציות טרנסגניות שיש להן מחיקות גנים המעכבות העברה או זיהום8. שימוש במערכת הזנה מלאכותית מסייע לחוקרים לבודד את תפקיד הגנים בכך שהוא מאפשר להדבקה או העברה להתרחש רק בצד הקרציה, ובכך לבודד כל תגובה פונדקאית שעלולה לבלבל מחקרים כאלה.
באופן דומה, ייתכן שחלק משלבי החיים של קרציות המעורבות במחלות ובהעברת בעלי חיים לא יופעלו כדי להיזון ממיני מודל מעבדה נפוצים. נקבות Ixodes scapularis , למשל, חייבות להיות מוזנות מבעלי חיים גדולים יותר, בדרך כלל ארנבות9. בעוד שלעתים קרובות נגיש לניסויי מעבדה, הדרישות המנהליות והחקלאיות של שימוש בארנבים עולות על אלה של מכרסמים קטנים ועשויות להיות אסורות עבור מעבדות מסוימות. מיני קרציות אחרים, במיוחד אלה המעוררים דאגה וטרינרית, חייבים להיות מוזנים בבקר או בבעלי חיים גדולים אחרים שאינם מעשיים לשימוש ברוב המעבדות. שיטות האכלה חוץ גופית וזיהום, כגון הזנת ממברנות מלאכותיות, מספקות חלופות לשימוש בבעלי חיים מארחים גדולים או אקזוטיים.
בנוסף, השימוש במערכת הזנה מלאכותית מאפשר ניתוחים מסוימים שאולי לא יהיו אפשריים בשיטות האכלה מסורתיות של בעלי חיים. דוגמה אחת לכך היא שעל ידי הפרדת מקור הדם ממנגנון ההזנה, מתאפשרת בחינת התפקיד שעשוי להיות לדם של פונדקאים שונים בהעברת B. burgdorferi 10. בדיקה זו של הדם המארח והתפקיד שהדם עצמו ממלא בהיעדר התגובה החיסונית של המאכסן היא גורם חשוב ביכולת להבין מחזורי העברה של פתוגנים וכזה שמערכות הזנה מלאכותיות מסוגלות לעזור לענות עליו11. כמו כן, ניתן לכמת את מספרי ההעברה המדויקים של פתוגן במהלך הזנה ולא רק לבחון את הצלחת השידור והתבססותו במארח 8,12.
חלק מממברנות ההזנה המלאכותיות הראשונות שיוצרו עבור קרציות קשות יוצרו מעורות בעלי חיים או מממברנות שמקורן בבעלי חיים בשנות ה-50 וה-60 של המאה ה-2013,14. בשל האופי הביולוגי של ממברנות אלה, היו בעיות הן בייצור של ממברנות חדשות והן בחיי מדף. בשנות ה-90 פותחו קרומים מלאכותיים לחלוטין שהשתמשו בגב של רשת, נייר או בד עם ספיגת סיליקון15,16. סיליקון היה אידיאלי מכיוון שתכונותיו הפיזיות מחקות את נחיצות העור ודביקות קלה, יחד עם טבעו הביולוגי. בהתבסס על כך, קרובר וגרין, שעל עבודתם התבססה טכניקה זו, תיארו טכניקת הזנה של קרום קרניים ספוג סיליקון עבור הזנה מלאכותית של I. ricinus17.
שכלול השיטות של I. scapularis, מין קרוב, הוביל להבדלים בולטים בקשיות הסיליקון המשמש בספיגת קרום, המתכון לייצור ממברנה, מידות התא וממריץ ההתקשרות. בעוד שהשכלולים שדווחו במחקר זה הביאו למאפייני קרום דומים לאלה שדווחו על ידי Andrade et al., שפיתחו גם קרום מבוסס סיליקון המבוסס על Krober ו- Guerin לשימוש ב- I. scapularis, קיים הבדל בשלבי ספיגת הסיליקון, המאפשר את הגמישות להשתמש בפרוטוקול זה לשלבי חיים לא בוגרים של I. scapularis15, 18. מחקר זה מתאר גם תוספות ושינויים טכניים המבוססים על שימוש חוזר ונשנה בשיטה זו, שיטות עבודה מומלצות שמביאות להזנה מוצלחת ופתרון בעיות שעלולות להתעורר. שיטה זו שימשה להאכלת כל שלבי החיים הפעילים, להדבקת קרציות בחיידקים פתוגניים ולחשיפת קרציות למינונים מרובים של אנטיביוטיקה 19,20. בעוד ששיטת האכלת הממברנה המלאכותית המוצגת היא עבור I. scapularis, שיטה זו ניתנת להתאמה בקלות למינים אחרים של קרציות עם שינויים קלים בעובי הממברנה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>00-10 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-10</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>00-50 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-50</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Mold Star 30</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1852-1VL</td>
			<td>Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DBB500</td>
			<td>Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clingwrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-790-2C</td>
			<td>Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2871</td>
			<td>Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>139386-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td>100% rayon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin &#160;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>N-750-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S37440&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/fungizone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 &#181;g/mL of streptomycin, and 25 &#181;g/mL of Amphotericin B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagostimulant</td>
			<td>Made in House</td>
			<td></td>
			<td>Collected from prior tick feeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8585K204&#160;</td>
			<td>Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber O-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K38&#160;</td>
			<td>5 mm thick, 1.25 inch inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft touch forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470315-238&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unryu paper&#160;</td>
			<td>Art supply stores</td>
			<td></td>
			<td>mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis

קרציות והמחלות הנלוות אליהן הן נושא מחקר חשוב בשל בריאות הציבור והנטל הווטרינרי שלהן. עם זאת, דרישות ההזנה של קרציות במהלך המחקר והגידול יכולות להגביל שאלות ניסוי או את יכולתן של מעבדות לחקור קרציות ואת הפתוגנים הקשורים אליהן. מערכת הזנה מלאכותית של ממברנות יכולה להפחית בעיות אלה ולפתוח כיווני מחקר חדשים שאולי לא היו אפשריים במערכות מסורתיות להאכלת בעלי חיים. מחקר זה מתאר מערכת הזנה מלאכותית של ממברנות ששוכללה להצלחת הזנה וגודש בכל שלבי החיים של Ixodes scapularis . יתר על כן, ניתן לשנות את מערכת הזנת הממברנות המלאכותית המתוארת במחקר זה לשימוש עם מיני קרציות אחרים באמצעות עידון פשוט של עובי הממברנה הרצוי. היתרונות של מערכת הזנה מלאכותית ממברנות מאוזנים על ידי אינטנסיביות העבודה של המערכת, הגורמים הסביבתיים הנוספים שעשויים להשפיע על הצלחת ההאכלה, והצורך לשכלל את הטכניקה עבור כל מין חדש ושלב החיים של הקרציות.

האכלה מוצלחת תלויה אם רוצים גודש חלקי או מלא. מוזן בהצלחה I. scapularis להפוך גוון של אפור מתכת עבור מבוגרים להתנתק בכוחות עצמם מן הממברנה. עם זאת, אם הם לפחות בגודל אפונה, הם עשויים להיות מנותקים מן הממברנה בעת סיום האכלה. בשלבים לא בוגרים של I. scapularis , הגודל של קרציות חרוטות לחלוטין משתנ?...

Watch this Scientific Journal Video about Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis at JoVE.com

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

מוצגת כאן שיטה להאכלת קרציות במבחנה באמצעות מערכת ממברנות מלאכותית המאפשרת גודש חלקי או מלא של מגוון שלבי חיים של הקרציות.

קרציות האכלת קרום מלאכותי עבור Ixodes scapularis

Ticks and their associated diseases are an important topic of study due to their public health and veterinary burden. However, the feeding requirements of ...

בעוד שהאכלת קרום מלאכותי נעשתה בעבר, הפרוטוקול שלנו פשוט יותר להתקנה וניתן להתאמה למיני קרציות אחרים עם כמה שינויים. היתרון העיקרי של הזנת ממברנות מלאכותיות הוא שהיא מאפשרת חשיפה לפתוגנים ולטיפולים שאולי לא יהיו אפשריים באמצעות הזנת בעלי חיים. מערכת הזנה מלאכותית זו של ממברנות יכולה להיות מיושמת על מיני פרוקי רגליים אחרים עם בדיקות מסוימות עבור phagostimulants אידיאלי ושינויים על עובי הממברנה האידיאלי.הפקת עובי הממברנה הנכון דורשת תרגול מסוים. הקפד להשתמש במיקרומטר כדי למדוד את העובי במספר מקומות על הממברנה. בנג'מין קול, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלנו יעזור לי להדגים את ההליך.כדי להתחיל, נגב משטח שטוח ולא נקבובי כגון זכוכית או בסיס מתכת מצופה קרמיקה של מעמד זרוע עם 70% אתנול ולאחר מכן כסה אותו בשכבה אחת של ניילון נצמד. ודאו שהניילון הנצמד שטוח וללא בועות או קמטים. הדביקו נייר ניקוי של 100% קרני אור למשטח המוכן.ודא שהוא שטוח ומתוח מעט באמצעות סרט דבק לכל ארבעת צידי הנייר. הכינו את תערובת הסיליקון בדרגת קשיות 0010 על ידי מדידת חמישה מיליליטר מכל חלק של ערכת הסיליקון לתוך מיכל חד פעמי. מערבבים קלות את שני הנוזלים ומוסיפים 1.5 מיליליטר הקסאן.ממשיכים לערבב עד שהתערובת הומוגנית ומעורבבת היטב. השתמשו בלחיצת גומי קטנה כדי לפזר את תערובת הסיליקון על נייר העדשה ואפשרו לה לעמוד דקה אחת כדי לוודא שהסיליקון נספג בנייר העדשה. ביציבות, מגרדים את עודפי הסיליקון הצידה עם הסחיטה תוך שימוש בכמות קטנה של לחץ כלפי מטה.בצעו מעבר שני עם הסחיטה מבלי להפעיל את הלחץ כלפי מטה כדי להסיר קווי סיליקון וליצור שכבה חלקה. עבור זחלים בלבד, טבלו את החלק העליון של תא ההזנה בשרף פלואורופולימר פלואון מספר פעמים, ואפשרו לו להתייבש בין יישומים כדי ליצור שכבה עקבית. השאירו את הממברנה לריפוי למשך 24 שעות לפחות בסביבה נטולת אבק כגון ארון כימי סגור או ארון בטיחות ביולוגית.לאחר מכן, ערבבו חלקים שווים של תערובת סיליקון A ו-B כדי להכין את תערובת הסיליקון בעלת 30 הקשיות לחיבור התאים לממברנה. טובלים את תאי הפוליקרבונט כרבע סנטימטר בתערובת הסיליקון ואז מניחים אותם על יריעת הממברנה, תוך הקפדה שלא לחפוף אף אחד מהסרטים. אפשרו לסיליקון המתחבר להחלים למשך 24 שעות לפחות.בעזרת אזמל, חותכים בזהירות את הקרום סביב כל אחד מהתאים המחוברים, חותכים את הקצוות כך שהוא יכול להתאים בצורה חלקה לתוך באר של צלחת שש באר ללא הרבה גירוד בצדדים. אפשר מספיק חומר מחוץ לתא כדי למקסם את תוספת הממברנה. חותכים חתיכה קטנה משאריות הקרום מכל פינה וממרכז יריעת הממברנה.הסר את הניילון הנצמד מכל חתיכה ומדד את החתיכות עם מיקרומטר כדי לקבוע את עובי הממברנה הממוצע. הניחו את תאי ההאכלה יחד עם טבעת O אחת בכל תא לתוך זכוכית כדי להיות autoclaved ב 121 מעלות צלזיוס במשך לפחות 20 דקות כדי לעקר. הניחו לתאים להתקרר לפני השימוש בהם.לאחר הוצאת תאי הממברנה האוטוקלאביים שהוכנו מראש והנחת טבעת ה-O סביבם, מלאו כל תא בכמות מספקת של 70% אתנול כדי לכסות את הממברנה. תן לו לשבת בצלחת שש באר במשך חמש דקות ולאחר מכן לחפש כל דליפות בין החדר לבין הממברנה ואת הממברנה עצמה. רוקנו את האתנול מהתאים ואז תנו לו להתייבש באוויר בתוך ארון בטיחות ביולוגית או מכסה מנוע זרימה למינרית.כדי לחמם ולהפעיל את המשלים בדם, לחמם אותו ב 56 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות ולהשלים דם בקר דפיברילציה מכנית עם שני גרם לליטר גלוקוז. ברגע שהקרום יבש, מרחו כ-20 מיקרוליטר של פאגוססטימולנט על החלק הפנימי של התא והטו את החדר כדי לפזר אותו על פני השטח. כאשר phagostimulant יבש, במהירות להוסיף את הקרציות לחדר עם מברשת או מלקחיים.אטמו את החלק העליון עם פרפילם מכיוון שהחום מאמבט המים עלול לגרום לו להיקרע. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של החום ודם פעיל לכל באר או חדר לתוך צינור חרוטי ומניחים אותו באמבט המים להגדיר ב 36 מעלות צלזיוס. הוסף חמישה מיקרוליטרים של ATP שלושה מילימולרי ו 50 מיקרוליטר של מלאי 100X של פטריות סטרפטומיצין פניצילין לכל חמישה מיליליטר דם לצינור ולהעביר 4.5 מיליליטר של הדם לתוך באר של צלחת שש באר.מניחים בעדינות את החדר לתוך הבאר, התאמת גובה טבעת O על החדר כך שהקרום יושב בדם, אך רמת הדם סביב הצד אינה עולה על הבאר. לאחר מכן הניחו את הבאר לתוך הדם בזווית כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בין הדם לממברנה. מניחים את המכסה של צלחת שש בארות על גבי תאי ההאכלה.שים את צלחת שש באר עם תאים לתוך מוכן 34 מעלות צלזיוס אמבט מים ואת המכסה. הוסף חמישה מיקרוליטרים של שלושה מילימולרים ATP ו 50 מיקרוליטר של מלאי 100X של פטריות סטרפטומיצין פניצילין לכל באר לצינור הדם ולהעביר 4.5 מיליליטר של דם לתוך באר של צלחת שש בארות טרי כפי שהוצג קודם לכן. הוציאו את צלחת שש הבארות עם תא הקרציות מאמבט המים והוציאו את החדר מהבאר.שטפו את החלק החיצוני של החדר והקרום עם 10 מיליליטר של PBS 1X מעוקר כדי להסיר את הדם. בעזרת נייר סינון אוטומטי, יבשו בעדינות את הממברנה ואת התא כדי להסיר את עודפי PBS. אם יש הרבה עיבוי בתוך החדר, לטפוח לייבש את הכתמים הרטובים עם נייר מסנן autoclaved לפני אטימתו עם parafilm טרי.לאחר מכן החלף את הפרפילם בחלק העליון של החדר. הכניסו את תא הקרציות לצלחת שש הבארות החדשה עם דם טרי, והתאימו את גובה טבעת ה-O במידת הצורך. חזור על שלבים אלה עבור כל תא בצלחת.לבסוף, הניחו את המכסה של צלחת שש הבארות מעל החלק העליון של החדרים והחזירו את צלחת שש הבארות החדשה לאמבט המים של 34 מעלות צלזיוס. כאן מוצגת הזנה מתמשכת עם נימפות ixodes scapularis חרוטות חלקית. הנקודות השחורות או החומות סביב אתרי ההתקשרות הן הכפור שניתן לאסוף במהלך ואחרי ההזנה כדי להפוך את phagostimulant.נימפות ixodes scapularis חרוטות חלקית נראות מחוברות לממברנה. ניתן לראות כאן גם קליפה של עובש הזחלים החרוטים. מספרי גודש הקרציות ומשקלי מסת הביצים מוצגים בטבלה זו.בתנאי ניסוי של גודש זחל ונימפה נוסף איבר צבי לדם בנוסף לתוספים המשמשים בטכניקה זו. כאן, גודש מוצלח הוגדר כקרציות חרוטות שנמסו בהצלחה לשלב החי הבא או נקבות חרוטות שהטילו ביצים בהצלחה. נדרש תרגול כדי לקבל עובי מקובל בעת מריחת סיליקון על נייר העדשה ולכן חשוב תמיד למדוד את עובי הממברנה לפני השימוש.הזנת ממברנות עלולה לחשוף את הקרציות לפתוגנים או לאנטיביוטיקה. ההשפעות של אלה על היבטים של ביולוגיה של קרציות כגון הצלחת ההתכה, הטלת ביצים והישרדות ניתן להעריך לאחר ההזנה.

Research

JoVE Journal

Biology

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

בדיקת סובלנות ניקוטין ב כנימות באמצעות ניסוי דיאט מלאכותית

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...