Name: tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis
Uploaded: 2022-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis at JoVE.com

1. Preparazione della camera della membrana tick
<ol><li>Preparare una superficie piana e non porosa, come un piano di vetro o una base metallica rivestita in ceramica, pulendola con etanolo al 70% e quindi coprirla con un singolo strato di pellicola trasparente, assicurandosi che l'involucro di plastica sia piatto e privo di bolle o rughe (vedere Figura 1A).</li>
	<li>Incollare con nastro adesivo la carta per la pulizia delle lenti in rayon al 100% sulla superficie prepar...

<ol>
	<li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+signs:+trends+in+reported+vectorborne+disease+cases+-+United+States+and+territories,+2004-2016.">Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).</li><li>Busch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+movement+of+invasive+cattle+fever+ticks+(Rhipicephalus+microplus)+in+southern+Texas+leads+to+shared+local+infestations+on+cattle+and+deer.">Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 188 (2014).</li><li>S&#252;ss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+makes+ticks+tick?+Climate+change,+ticks,+and+tick-borne+diseases.">What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases.</a> Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).</li><li>Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Pe&#241;a, A., Kahl, O., Lindgren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+climate+change+on+ticks+and+tick-borne+diseases+in+Europe.">Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe.</a> Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Ticks. , (1991).</li><li>Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+an+outer+surface+protein+on+Borrelia+burgdorferi+during+tick+feeding.">Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).</li><li>Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inability+of+a+variant+strain+of+Anaplasma+phagocytophilum+to+infect+mice.">Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).</li><li>Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+surface+protein+Lmp1+facilitates+pathogen+dissemination+through+ticks+as+studied+by+an+artificial+membrane+feeding+system.">Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).</li><li>Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+maintenance+of+multi-host+ixodid+ticks+in+the+laboratory.">Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory.</a> Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).</li><li>Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Lyme+borreliae+proteins+promoting+vertebrate+host+blood-specific+spirochete+survival+in+Ixodes+scapularis+nymphs+using+artificial+feeding+chambers.">Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).</li><li>Hart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+tropism+determination+by+convergent+evolution+of+immunological+evasion+in+the+Lyme+disease+system.">Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).</li><li>Bernard, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+early+immune+evasion+strategies+of+a+bacterial+pathogen.">Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).</li><li>Pierce, A. E., Pierce, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+note+on+the+cultivation+of+Boophilus+microplus+(Canestrini,+1887)+(Ixodidae:+Acarina)+on+the+embyonated+hen+egg.">A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg.</a> Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).</li><li>Doube, B. M., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature,+relative+humidity+and+host+factors+on+the+attachment+and+survival+of+Boophilus+microplus+(Canestrini)+larvae+to+skin+slices.">The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices.</a> International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+feeding+assay+to+test+acaricides+for+control+of+hard+ticks.">An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks.</a> Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).</li><li>Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life-cycle+of+the+bont+tick+Amblyomma+hebraeum+in+vitro.">The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro.</a> International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks.">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).</li><li>Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silicone+membrane+for+in+vitro+feeding+of+Ixodes+scapularis+(Ixodida:+Ixodidae).">A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae).</a> Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+immature+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae)+by+membrane+feeding.">Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding.</a> Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+dynamics+and+antibiotic+elimination+of+symbiotic+Rickettsia+buchneri+in+the+tick+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae).">Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).</li><li>Graham, E. E., Poland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Fluon+conditioning+for+capturing+cerambycid+beetles+in+different+trap+designs+and+persistence+on+panel+traps+over+time.">Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time.</a> Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).</li><li>Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+maintenance+and+description+of+cell+lines+from+the+tick+Ixodes+scapularis.">Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis.</a> Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).</li><li>Lehane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+single+and+coinfections+of+human+pathogens+in+Ixodes+ticks+from+five+geographical+regions+in+the+United+States,+2013-2019.">Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).</li><li>Gonz&#225;lez, J., Bickerton, M., Toledo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+artificial+membrane+feeding+for+ixodid+ticks.">Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks.</a> Acta Tropica. 215, (2021).</li><li>Kr&#243;l, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+transmission+paths+for+three+different+Bartonella+spp.+in+Ixodes+ricinus+ticks+using+artificial+feeding.">Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding.</a> Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).</li><li>Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+ticks.">Biology of ticks.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).</li></ol>

L'alimentazione artificiale a membrana delle zecche fornisce uno strumento utile per una varietà di procedure sperimentali, ma non è probabile che sostituisca l'alimentazione animale per tutte le applicazioni. Mantenere grandi colonie di zecche in tutte le fasi della vita senza alimentazione animale è generalmente insostenibile. Invece, il sistema di alimentazione artificiale è prezioso per altri scopi come infettare le zecche con agenti patogeni non supportati da ospiti modello, valutare gli impatti di dosaggi contr...

Le malattie trasmesse dalle zecche hanno un forte impatto sulla salute degli esseri umani e degli animali in tutto il mondo, essendo responsabili di oltre due terzi di tutte le malattie associate ai vettori negli Stati Uniti dal 2004 al 20161. Inoltre, il numero di casi è cresciuto negli ultimi anni, con più persone e bestiame colpiti da zecche e malattie associate 2,3. Mentre ci sono probabilmente numerose cause per la tendenza al rialzo del numero di casi, il cambiamento climatico è un fattore importante 3,4. Il previsto aumento in corso del numero di casi di malattie trasmesse da zecche sottolinea la necessità di sviluppare nuovi strumenti per studiare le relazioni tra le zecche e gli agenti patogeni che trasmettono.
È noto che le zecche subiscono cambiamenti nella fisiologia e nell'espressione genica durante l'alimentazione e che questi cambiamenti svolgono un ruolo nella trasmissione dei patogeni 5,6. Può essere difficile eseguire studi che esaminino gli effetti dell'alimentazione completa e parziale sulla trasmissione e l'acquisizione di agenti patogeni utilizzando modelli animali, in particolare in situazioni in cui i modelli di roditori non sono suscettibili all'infezione da un particolare agente patogeno. Ad esempio, il ceppo Anaplasma phagocytophilum Variant-1 viene trasmesso naturalmente tra Ixodes scapularis e cervi, ma non è in grado di infettare i topi, complicando l'infezione da zecche nel laboratorio7. I sistemi di alimentazione artificiale possono anche essere applicati per aiutare a studiare agenti patogeni come Borrelia burgdorferi attraverso l'uso di mutanti transgenici che hanno delezioni geniche che inibiscono la trasmissione o l'infezione8. L'utilizzo di un sistema di alimentazione artificiale aiuta i ricercatori a isolare il ruolo dei geni consentendo all'infezione o alla trasmissione di verificarsi solo sul lato della zecca, isolando così qualsiasi risposta dell'ospite che possa confondere tali studi.
Allo stesso modo, alcune fasi di vita delle zecche coinvolte nella malattia e nella trasmissione animale potrebbero non essere indotte a nutrirsi di specie modello di laboratorio comuni. Le femmine di Ixodes scapularis , ad esempio, devono essere nutrite con animali più grandi, in genere conigli9. Sebbene spesso accessibili per la sperimentazione di laboratorio, i requisiti amministrativi e di allevamento dell'uso dei conigli superano quelli dei piccoli roditori e possono essere proibitivi per alcuni laboratori. Altre specie di zecche, in particolare quelle di interesse veterinario, devono essere nutrite con bovini o altri animali di grandi dimensioni che non sono pratici da usare nella maggior parte dei laboratori. I metodi di alimentazione e infezione in vitro , come l'alimentazione artificiale a membrana, forniscono alternative all'utilizzo di animali ospiti di grandi dimensioni o esotici.
Inoltre, l'uso di un sistema di alimentazione artificiale consente alcune analisi che potrebbero non essere possibili con i metodi tradizionali di alimentazione animale. Uno di questi esempi è che, separando la fonte di sangue dal meccanismo di alimentazione, diventa possibile esaminare il ruolo che il sangue di diversi ospiti può avere nella trasmissione di B. burgdorferi 10. Questo esame del sangue dell'ospite e del ruolo che il sangue stesso svolge in assenza della risposta immunitaria dell'ospite è un fattore importante per essere in grado di comprendere i cicli di trasmissione dei patogeni e uno che i sistemi di alimentazione artificiale sono in grado di aiutare a rispondere11. Diventa anche possibile quantificare i numeri esatti di trasmissione di un agente patogeno durante un mangime piuttosto che esaminare semplicemente il successo della trasmissione e l'insediamento in un ospite 8,12.
Alcune delle prime membrane artificiali di alimentazione fatte per zecche dure sono state fatte di pelli animali o membrane di origine animale negli anni 1950 e 196013,14. A causa della natura biologica di queste membrane, ci sono stati problemi sia con la produzione di nuove membrane che con la durata di conservazione. Nel 1990 sono state sviluppate membrane completamente artificiali che utilizzavano un supporto di rete, carta o tessuto con impregnazione di silicone15,16. Il silicone era ideale in quanto le sue proprietà fisiche imitano l'elasticità e la leggera appiccicosità della pelle, insieme alla sua natura bio-inerente. Basandosi su questo, Krober e Guerin, il cui lavoro era basato su questa tecnica, hanno descritto una tecnica di alimentazione con membrana di rayon impregnata di silicone per l'alimentazione artificiale di I. ricinus17.
Il perfezionamento dei metodi per I. scapularis, una specie strettamente correlata, ha portato a notevoli differenze nella durezza del silicone utilizzato nell'impregnazione della membrana, nella ricetta per la produzione di membrane, nelle dimensioni della camera e nello stimolante di attacco. Mentre i perfezionamenti riportati in questo studio hanno portato a caratteristiche di membrana simili a quelle riportate da Andrade et al., che ha anche sviluppato una membrana a base di silicone basata su Krober e Guerin per l'uso in I. scapularis, c'è una differenza nelle fasi di impregnazione del silicone, che consente la flessibilità di utilizzare questo protocollo per fasi di vita immature di I. scapularis 15, 18. Questo studio descrive anche le aggiunte e le modifiche tecniche basate sull'uso ripetuto di questo metodo, le migliori pratiche che si traducono in un feed di successo e la risoluzione dei problemi che possono sorgere. Questo metodo è stato utilizzato per alimentare tutte le fasi della vita attiva, infettare le zecche con batteri patogeni ed esporre le zecche a dosi multiple di antibiotici19,20. Mentre il metodo di alimentazione a membrana artificiale mostrato è per I. scapularis, questo metodo è facilmente adattabile ad altre specie di zecche con piccole modifiche nello spessore della membrana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>00-10 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-10</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>00-50 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-50</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Mold Star 30</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1852-1VL</td>
			<td>Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DBB500</td>
			<td>Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clingwrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-790-2C</td>
			<td>Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2871</td>
			<td>Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>139386-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td>100% rayon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin &#160;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>N-750-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S37440&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/fungizone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 &#181;g/mL of streptomycin, and 25 &#181;g/mL of Amphotericin B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagostimulant</td>
			<td>Made in House</td>
			<td></td>
			<td>Collected from prior tick feeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8585K204&#160;</td>
			<td>Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber O-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K38&#160;</td>
			<td>5 mm thick, 1.25 inch inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft touch forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470315-238&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unryu paper&#160;</td>
			<td>Art supply stores</td>
			<td></td>
			<td>mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis

Le zecche e le loro malattie associate sono un importante argomento di studio a causa della loro salute pubblica e del carico veterinario. Tuttavia, le esigenze alimentari delle zecche durante lo studio e l'allevamento possono limitare le domande sperimentali o la capacità dei laboratori di ricercare le zecche e i loro agenti patogeni associati. Un sistema di alimentazione artificiale a membrana può ridurre questi problemi e aprire nuove strade di ricerca che potrebbero non essere state possibili con i tradizionali sistemi di alimentazione animale. Questo studio descrive un sistema di alimentazione a membrana artificiale che è stato perfezionato per il successo dell'alimentazione e dell'ingorgo per tutte le fasi di vita di Ixodes scapularis . Inoltre, il sistema di alimentazione artificiale a membrana descritto in questo studio può essere modificato per l'uso con altre specie di zecche attraverso un semplice perfezionamento dello spessore della membrana desiderato. I benefici di un sistema di alimentazione artificiale a membrana sono controbilanciati dall'intensità di lavoro del sistema, dai fattori ambientali aggiuntivi che possono influire sul successo dell'alimentazione e dalla necessità di perfezionare la tecnica per ogni nuova specie e fase di vita delle zecche.

Un'alimentazione di successo dipende dal fatto che si desideri un ingorgo parziale o completo. Alimentato con successo I. scapularis diventa una tonalità di grigio canna di fucile per gli adulti e si stacca da solo dalla membrana. Tuttavia, se sono almeno delle dimensioni di un pisello, possono essere staccati dalla membrana quando finiscono l'alimentazione. Per gli stadi immaturi di I. scapularis , la dimensione per le zecche completamente ingorgate varia e, poiché, a differenza degli adulti, non mos...

Watch this Scientific Journal Video about Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis at JoVE.com

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Presentato qui è un metodo per alimentare le zecche in vitro tramite un sistema di membrana artificiale per consentire l'ingorgo parziale o totale di una varietà di fasi di vita delle zecche.

Alimentazione a membrana artificiale di zecche per Ixodes scapularis

Ticks and their associated diseases are an important topic of study due to their public health and veterinary burden. However, the feeding requirements of ...

Mentre l'alimentazione artificiale a membrana è stata fatta prima, il nostro protocollo è più semplice da impostare e adattabile ad altre specie di zecche con alcune modifiche. Il vantaggio principale dell'alimentazione artificiale a membrana è che consente l'esposizione a agenti patogeni e trattamenti che potrebbero non essere fattibili attraverso l'alimentazione animale. Questo sistema di alimentazione artificiale a membrana può essere applicato ad altre specie di artropodi con alcuni test per i fagostimolanti ideali e modifiche sullo spessore ideale della membrana.Produrre lo spessore corretto della membrana richiede un po' di pratica. Assicurati di utilizzare un micrometro per misurare lo spessore in diversi punti della membrana. Benjamin Cull, un postdoc nel nostro laboratorio mi aiuterà a dimostrare la procedura.Per iniziare, pulire una superficie piana e non porosa come una lastra di vetro o una base di metallo rivestita in ceramica di un supporto da braccio con etanolo al 70% e quindi coprirlo con un singolo strato di pellicola trasparente. Assicurati che l'involucro di plastica sia piatto e senza bolle o rughe. Fissare con nastro adesivo la carta per la pulizia delle lenti in rayon al 100% sulla superficie preparata.Assicurarsi che sia piatto e leggermente teso con nastro adesivo su tutti e quattro i lati della carta. Preparare la miscela di silicone di durezza 0010 misurando cinque millilitri di ciascuna parte del kit di silicone in un contenitore monouso. Mescolare leggermente i due liquidi e aggiungere 1,5 millilitri di esano.Continuare a mescolare fino a quando il composto è omogeneo e ben miscelato. Utilizzare un piccolo tergipavimento per distribuire la miscela di silicone sulla carta per lenti e lasciarla riposare per un minuto per assicurarsi che il silicone si sia impregnato nella carta per lenti. Costantemente, raschiare il silicone in eccesso sul lato con il tergipavimento usando una piccola quantità di pressione verso il basso.Eseguire un secondo passaggio con il tergipavimento senza esercitare la pressione verso il basso per rimuovere eventuali linee di silicone e produrre uno strato liscio. Solo per le larve, immergere più volte la parte superiore della camera di alimentazione nella resina fluoropolimerica Fluon, lasciandola asciugare tra le applicazioni per produrre uno strato coerente. Lasciare la membrana a polimerizzare per almeno 24 ore in un ambiente privo di polvere come un armadio chimico o di biosicurezza chiuso.Quindi, mescolare parti uguali di miscela siliconica A e B per preparare la miscela di silicone di durezza 30 per attaccare le camere alla membrana. Immergere le camere in policarbonato di circa un quarto di pollice nella miscela siliconica e quindi posizionarle sul foglio di membrana, facendo attenzione a non sovrapporre nessuno dei nastri. Lasciare indurire il silicone di fissaggio per almeno 24 ore.Usando un bisturi, tagliare con cura la membrana attorno a ciascuna delle camere attaccate, tagliando i bordi in modo che possa adattarsi agevolmente in un pozzetto della piastra a sei pozzetti senza molto raschiare sui lati. Lasciare materiale sufficiente all'esterno della camera per massimizzare l'aggiunta della membrana. Tagliare un piccolo pezzo della membrana rimanente da ogni angolo e dal centro del foglio di membrana.Rimuovere l'involucro di plastica da ogni pezzo e misurare i pezzi con un micrometro per determinare lo spessore medio della membrana. Posizionare le camere di alimentazione insieme a un O-ring per camera in un becher di vetro da autoclavare a 121 gradi Celsius per almeno 20 minuti per sterilizzare. Lasciare raffreddare le camere prima di utilizzarle.Dopo aver estratto le camere a membrana autoclavate pre-preparate e aver posizionato l'O-ring attorno ad esse, riempire ogni camera con abbastanza etanolo al 70% per coprire la membrana. Lasciare riposare in una piastra a sei pozzetti per cinque minuti e poi cercare eventuali perdite tra la camera e la membrana e nella membrana stessa. Svuotare l'etanolo dalle camere e quindi lasciarlo asciugare all'aria all'interno di un armadio di biosicurezza o di una cappa a flusso laminare.Per riscaldare e attivare il complemento nel sangue, riscaldarlo a 56 gradi Celsius per 40 minuti e integrare il sangue bovino defibrillato meccanicamente con due grammi per litro di glucosio. Una volta che la membrana è asciutta, applicare circa 20 microlitri di fagostimolante all'interno della camera e inclinare la camera per diffonderla sulla superficie. Quando il fagostimolante è asciutto, aggiungere rapidamente le zecche alla camera con un pennello o una pinza.Sigillare la parte superiore con parafilm poiché il calore del bagno d'acqua può causarne lo strappo. Quindi aggiungere cinque millilitri di calore e sangue attivato per pozzetto o camera in un tubo conico e metterlo a bagnomaria impostato a 36 gradi Celsius. Aggiungere cinque microlitri di ATP a tre millimolari e 50 microlitri di stock 100X di fungizone streptomicina penicillina per cinque millilitri di sangue al tubo e trasferire 4,5 millilitri di sangue in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Posizionare delicatamente la camera nel pozzetto, regolando l'altezza dell'O-ring sulla camera in modo che la membrana si trovi nel sangue, ma il livello del sangue intorno al lato non sovrasta il pozzetto. Quindi posizionare il pozzo nel sangue ad angolo per evitare la formazione di bolle d'aria tra il sangue e la membrana. Posizionare il coperchio della piastra a sei pozzetti sopra le camere di alimentazione.Metti la piastra a sei pozzetti con le camere nel bagno d'acqua preparato a 34 gradi Celsius e nel coperchio. Aggiungere cinque microlitri di ATP a tre millimolari e 50 microlitri di stock 100X di funghizone streptomicina penicillina per pozzetto al tubo sanguigno e trasferire 4,5 millilitri di sangue in un pozzetto di una piastra fresca a sei pozzetti come mostrato in precedenza. Estrarre la piastra a sei pozzetti con la camera di zecca dal bagno d'acqua e rimuovere la camera dal pozzo.Risciacquare l'esterno della camera e della membrana con 10 millilitri di PBS 1X sterilizzato per rimuovere il sangue. Utilizzando carta da filtro autoclavata, tamponare delicatamente la membrana e la camera per rimuovere il PBS in eccesso. Se c'è molta condensa all'interno della camera, tamponare i punti umidi con carta da filtro autoclavata prima di sigillarla con un nuovo parafilm.Quindi sostituire il parafilm sulla parte superiore della camera. Posizionare la camera tick nella nuova piastra a sei pozzetti con sangue fresco, regolando l'altezza dell'O-ring se necessario. Ripetere questi passaggi per ogni camera sulla piastra.Infine, posizionare il coperchio della piastra a sei pozzetti sopra la parte superiore delle camere e spostare la nuova piastra a sei pozzetti nel bagno d'acqua a 34 gradi Celsius. Qui viene mostrato un feed in corso con ninfe ixodes scapularis parzialmente ingorgate. I punti neri o marroni attorno ai siti di attacco sono il gelo che può essere raccolto durante e dopo il pasto per rendere il fagostimolante.Le ninfe ixodes scapularis parzialmente ingorgate sono viste attaccate alla membrana. Qui si può vedere anche una buccia della muffa delle larve ingorgate. I numeri di ingorgo delle zecche e i pesi della massa delle uova sono presentati in questa tabella.Le condizioni sperimentali di ingorgo larvale e ninfale, hanno aggiunto omogenato di organi di cervo al sangue oltre agli integratori utilizzati in questa tecnica. Qui, l'ingorgo riuscito è stato definito come zecche ingorgate che si sono ammutate con successo allo stadio vivo successivo o femmine ingorgate che hanno deposto con successo le uova. Ci vuole pratica per ottenere uno spessore accettabile quando si applica il silicone alla carta delle lenti, quindi è sempre importante misurare lo spessore della membrana prima dell'uso.L'alimentazione a membrana può esporre le zecche a patogeni o antibiotici. Gli effetti di questi su aspetti della biologia delle zecche come il successo della muta, la deposizione delle uova e la sopravvivenza possono essere valutati dopo l'alimentazione.

Research

JoVE Journal

Biology

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Test di tolleranza nicotina in Afidi Utilizzando un esperimento artificiale dieta

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Ricerca

Biologia

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Preparazione di doppi strati artificiali per esperimenti Elettrofisiologia

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, l&#39;imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...